Summary
Denne protokol viser metoder, der anvendes til at etablere 2D-og 3D-miljøer i specialdesignede electrotactic kamre, som kan spore celler
Abstract
Endogene elektriske felter (EFS) forekommer naturligt i vivo og spiller en afgørende rolle i væv / organ udvikling og fornyelse, herunder af det centrale nervesystem 1,2. Disse endogene elementærfiler genereres ved cellulær regulering af iontransport kombineret med den elektriske modstand af celler og væv. Det er blevet rapporteret, at anvendte EF behandling kan fremme funktionel reparation af rygmarvsskader i dyr og mennesker 3,4. Navnlig har EF-directed cellemigrering blevet påvist i en lang række celletyper 5,6, herunder neurale stamceller (NPC) 7,8. Anvendelse af jævnstrøm (DC) elementærfiler ikke er en almindeligt tilgængelig teknik i de fleste laboratorier. Vi har beskrevet detaljerede protokoller for anvendelse af DC elementærfiler til celle-og vævskulturer tidligere 5,11. Her præsenterer vi en video demonstration af standardmetoder baseret på en beregnet feltstyrke at oprette 2D end 3D-miljøer for NPC'ere, og at undersøge cellulære reaktioner på EF stimulering i både encellede vækstbetingelser i 2D, og den organotypiske rygmarven skive i 3D. Det spinal cordslice er et ideelt modtager væv for at studere NPC ex vivo adfærd, post-transplantation, fordi den cytoarchitectonic vævet organisationen er godt bevaret inden for disse kulturer 9,10. Desuden er denne ex vivo model tillader også fremgangsmåder, der ikke er teknisk muligt at spore celler in vivo ved anvendelse af time-lapse optagelse på enkeltcelleniveau. Det er kritisk vigtigt at evaluere celle adfærd i ikke kun en 2D miljø, men også i en 3D organotypisk tilstand, som efterligner in vivo-miljø. Dette system vil give høj opløsning billeddannelse vha. Cover glas-baserede retter i væv eller organ kultur med 3D-tracking af enkelt celle migration in vitro og ex vivo og kan være et mellemliggende skridt, før du flytter ind i vivo paradigmer.
Protocol
1. Neural progenitorcelle isolering
- Dissekere hele hjerner fra E14-16 mus og læg dem i koldt DMEM/F12 basalmedium. Fjern alle meninges under et anatomisk mikroskop og overføre hjerner ind i en 35 mm petriskål.
- Anvende fine tænger til mekanisk dissociere hjerner i vævsfragmenter og overføre dem til et 15 ml rør, centrifugeres prøverne ved 800 rpm i 3 minutter for at fjerne debris.
- Tilsættes DMEM/F12 indeholdende bFGF og EGF og tritureres med en 1 ml pipette.
- Passere cellesuspensionen gennem en cellefilter til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
- Plade celler i kolberne ved 2-5 x 10 4 celler / ml, og derefter udføre en fuldstændig medium ændre hver 3. dag, og passage af cellerne hver 6 dage.
- Efter mindst 5 passager, til enkelte celler fordøjelse neurosfærer anvendelse af trypsin og EDTA og vokse på poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic kamre (fremstillet som beskrevet nedenfor i 2). Brug den voksende medium, der indeholder N2-supplement,bFGF og EGF til enhver tid at opretholde egenskaber NPC.
2. Forberedelse af electrotactic kammer
- Forbered 22 x 11 mm strimler af glas ved at dividere autoklaveres 22 x 22 mm no.1 tykkelse dækglas på halv ved hjælp af en diamant pen.
- Opret en fritstående glas godt af indvendige mål 22 x 10 mm ved sammenlimning fire lodret stående 22 x 11 mm strimler med høj-vakuum silicone fedt. Tillader brøndene fuldstændigt tørre og hærde natten over.
- Den følgende dag, vedhæfte to 22 x 11 mm glas strimler, parallelt med hinanden efterlades en spalte på 10 mm, til bunden af en 100 mm dyrkningsskål med siliconefedt. Forsegle området mellem disse strimler ved at placere en 22 x 22 mm dækglas ved hver ende, som er fastgjort til bunden af skålen med fedt på tre sider, men ikke at tættest på midten.
- Placere glaspladen og fremstillet i trin 2,2 på dækglas, således at de indvendige vægge skabe et begrænset rum til podningcellerne på bunden af pladen. Vand-bevis alle samlinger med silikone fedt. Coat denne begrænset område sekventielt med poly-D-lysin derefter laminin: tilsættes 1 ml poly-D-lysin i kammeret og henstår i 5 minutter for at tillade poly-D-lysin til at binde til bunden af pladen, vaskes kammeret med steril PBS to gange, derefter fortyndes laminin i sterilt PBS til opnåelse af 20 ug / ml og anvendes til at dække bunden af pladen. Henstår ved stuetemperatur natten over.
- Den følgende dag, høst cellerne og fremstilling af 1 ml suspension indeholdende 1 x 104 celler. Tag laminin fra glasset godt, gør det muligt at lufttørre helt, og erstatte med 1 ml cellesuspension. Placere skål i inkubatoren ved 37 ° C i mindst 4 timer for at tillade fastgørelse.
- Når cellerne er tilstrækkeligt konfluent fjerne alt medium fra kammeret. Fjern forsigtigt glasset godt. Danner et tag over cellerne ved omhyggeligt fastgørelse med siliconefedt, en autoklaveret 22 x 22 mm glas dækglasbro mellem de to 22 x 11 mm strimler. Dæk cellerne med et par dråber medium for at undgå udtørring.
- Dannelse af en isoleret medium reservoir ved hver ende af kammeret ved at skabe to vandtætte siliconefedt barrierer, der løber fra den ene kant af skålen til den anden, over kammeret taget. Fylde kammeret med frisk medium, hvilket sikrer en gennemstrømnings-fra et medium reservoir til det andet. Retur retten til inkubatoren i 12 timer for at give mulighed for celle opsving.
3. Anvendelsen af et elektrisk felt til electrotactic kammeret
- Fremstille et låg til at dække skålen ved at bore to huller, en placeret over hvert reservoir af migrationskammeret.
- Erstatte alle medium i kammeret med dyrkningsmedium indeholdende 25 mM HEPES puffer og overføres skålen til det temperaturstyrede billeddannende system. Indstil de eksperimentelle parametre for time-lapse og multi-position optagelse. Bringe kammeret, således at katoden og anoden erpå venstre og højre henholdsvis vandret for at sikre, at EF vektoren løber set ned mikroskopet og registreres i det billeddannende system.
- Fylde to bægerglas med Steinberg opløsning (58 mM NaCl, 0,67 mM KCI, 0,44 mM Ca (NO3) 2 0,4 H2O 0, 1,3 mM MgSO4 0,7 H2O 0 og 4,6 mM Trizma-base, pH 7,4). Forbinde et separat bægerglas til hvert medium reservoir under anvendelse tilberedte glas broer glasrør ~ 13 cm lange og ~ 3 mm i diameter, og bøjet i en U-form ved opvarmning i en bunsenbraender), fyldt med 2% (w / v) Steinberg's-agar opløsning, der passerer gennem hullerne i låget. Fuldende det elektriske kredsløb ved at placere Ag / AgCI-elektroder forbundet til en jævnstrømsforsyning til hvert bægerglas af Steinberg opløsning.
- Indstil spændingen knappen på strømforsyningen til 0 og tænde. Måle spændingen over electrotactic kammeret, medens drejning op spændingen skiven ved hjælp af en spænding meter, og tilpasse til de eksperimentelle betingelser.
- Start time-lapse optagelse. Udføre et medium ændringer og justere spændingen, som krævet, hver time. Frisk medium, narkotika eller kemiske midler kan tilsættes til reservoirerne efter behov. Når udføre medium forandring, kan to muligheder overvejes som nedenfor:
- Mulighed nr. 1 - at holde pause den tid-lapse optagelse midlertidigt, forsigtigt fjerne glas broer fra kammeret for at undgå forstyrrende dæksel, skal du bruge en steriliseret Pasteur-pipette forsigtigt erstatte alle medium med frisk medium, og sætte glas broer tilbage, derefter genoptage optagelsen.
- Mulighed No.2 - Alternativt, specialfremstillede dæksel med 4 huller (to er placeret over hvert reservoir af migration kammeret) kan også bruges til mellemstore forandring formål. To til glas broer forbindelse, de to andre for at ændre mediet. Mulighed 2 giver mulighed for kontinuerlig optagelse uden indblanding under medium forandring.
4. Fremstillinq af den organotypiske rygmarven skive
- Dissekere Lumbar rygmarve fra 2 uger gamle C57 BL / 6 mus.
- Skær rygmarve til 500 um tykke sektioner med en McIlwain vævshakker.
- Separate skiver under en anatomisk mikroskop og vælge skiver med intakt sagittal / aksial rygmarv struktur.
- Plade udsnit i en 35 mm petriskål indeholdende 30 ul Matrigel og placere dem tæt på centrum som muligt og opretholde dem i en 5% CO2-inkubator ved 37 ° C i mindst 30 minutter, indtil Matrigel proteinerne selv-samle til fremstilling en tynd film, der dækker overfladen af rygmarven skive. Det er meget vigtigt at sikre, at Matrigel er samlet helt inkuberes petriskålen ved 37 ° C i yderligere 30 minutter, hvis nødvendigt.
- Tilsættes 4-6 ml DMEM/F-12 medium indeholdende 25 mM HEPES-puffer og 15-20% føtalt kalveserum meget forsigtigt for at undgå mediestrøm direkte på skiven. Sikre, at skiven ikke er fuldstændigt neddykket i medium, der forlader overfladen af eksplantater og udsat forluften. Ændre mediet to gange om ugen.
5. Injektion af Hoechst 33342-mærkede NPC i organotypisk rygmarven skive
- Forbered NPC suspensionen på 1 x 10 6 celler / gl.
- Præ-inkubere cellesuspension i medium med 5 uM Hoechst 33342 i 30 minutter.
- Anvende kapillar glasrør microinject 2 pi af suspensionen ind i rygmarven skive langsomt under et mikroskop. Sørge kapillar glasrør passerer gennem Matrigel (lyserød del under mikroskop) og nå til indersiden af rygmarven skive (grå væv under mikroskop), forbliver inde i rygmarven skive i mindst 30 sekunder for at undgå cellesuspension løber over. Satte petriskål indeholdende rygmarven skive i inkubatoren (37 ° C 5% CO2) og lad det natten over.
- Næste dag, anvender en EF på 500 mV / mm til rygmarven skive indeholder Hoechst 33342-mærkede spilbare i electrotactic kammer (ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i3).
6. Repræsentative resultater
Når NPC blev udsat for en række fysiologiske elementærfiler de viste meget rettet cellemigrering mod katoden (figur 1). Den samme bemærkning blev også fremstillet ved en enkelt celle niveau på organotypisk rygmarven skive ex vivo-model, en 3D miljø efterligne in vivo-betingelser (fig. 2).
Figur 1. NPCs viser instrueret migration i EFS. Pc'er viste meget rettet migration mod katoden, når de udsættes for EFS, røde linier og blå pile repræsenterer baner og retning af celle-bevægelse (A). B viser migrationsveje af NPC'ere. Bar: 50 um.
Figur 2. Transplanterede NPC viser rettet overgangen til katoden i organotypisk rygmarven skive
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoller, vi anvender, er baseret på tidligere undersøgelser 5,11. Ved hjælp af disse metoder, stabil kultur og elektrisk strøm forhold kan opretholdes, mens anvendelse af en EF via agar broer, Steinberg opløsning og Ag / AgCl elektroder, til celler eller skiver dyrket i custom-designede electrotactic kamre af standardiserede og præcise dimensioner. Dybden af kamre kan justeres til at optage den anden prøve tykkelser 11, og i tilfælde af celler, kan kammeret størrelse ændres for at imødekomme imidlertid mange celler er påkrævet (f.eks Western blot-analyse kræver mange celler). Vi har modificerede og udviklet disse metoder for at opnå procedurer, der ikke er teknisk muligt at spore celler in vivo ved anvendelse af tidsforløb optagelse i en enkelt celle niveau. Størstedelen af tidligere forskning cellulære responser på EFS, er udført i 2D miljøer. In vivo undersøgelse af electrotactic reaktion NPC i en enkelt celle niveauville give afgørende bevis til at underbygge nogen fysiologisk relevans. Men dette er teknisk meget vanskeligt at opnå med den nuværende teknologi, især når de forsøger at opnå real-time cellevandring optagelser. Vi har taget yderligere skridt til at etablere en ex vivo organotypiske rygmarven skive kultur model, tæt efterligne in vivo-miljø, viser, at celler, der stadig besidder en electrotactic respons i et 3D-miljø, som vist i figur 2. Denne fremgangsmåde kan også være egnede til at observere virkningen af elementærfiler på en lang række celletyper i en organotypisk 3D miljø, såsom sårheling i epitelvæv, angiogenese i aorta ring eller chick CAM og eventuelt genetiske virkninger på kyllingeembryo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Royal Society urf tilskud UF051616, Storbritannien og Det Europæiske Forskningsråd STG tilskud 243261 til BS. Arbejdet i MZ lab er også understøttet af en California Institute for regenerativ medicin tilskud RB1-01.417.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
