Summary
Detta protokoll visar metoder för att fastställa 2D-och 3D-miljöer i specialdesignade electrotactic kammare, som kan spåra celler
Abstract
Endogena elektriska fält (EFS) förekommer naturligt in vivo och spelar en avgörande roll under vävnad / organ utveckling och förnyelse, bland annat av det centrala nervsystemet 1,2. Dessa endogena EF alstras genom cellulär reglering av jontransport kombineras med den elektriska resistansen hos celler och vävnader. Det har rapporterats att tillämpas EF behandlingen kan främja funktionell reparation av ryggmärgsskador hos djur och människor 3,4. I synnerhet har EF-riktad cellmigration visats i en mängd olika celltyper 5,6, innefattande neurala progenitorceller (NPC) 7,8. Applicering av likström (DC) EF är inte en allmänt tillgänglig teknik i de flesta laboratorier. Vi har beskrivit detaljerade protokoll för tillämpning av DC EFS för att cell-och vävnadskulturer tidigare 5,11. Här presenterar vi en video demonstration av standardmetoder som bygger på ett beräknat fält styrka att upprätta 2D end 3D miljöer för NPC, samt att undersöka cellulära svar på EF stimulering i både singel förhållanden celltillväxt i 2D, och organotypisk ryggmärgen bit i 3D. Den spinala cordslice är en idealisk mottagande vävnaden för att studera NPC ex vivo beteenden, efter transplantation, eftersom den cytoarchitectonic vävnadsorganisation är väl bevarade i dessa kulturer 9,10. Dessutom möjliggör denna ex vivo modell även förfaranden som inte är tekniskt möjligt att spåra celler in vivo med time-lapse inspelning på en enda cell nivå. Det är kritiskt viktigt att utvärdera cell beteenden inte bara i en 2D-miljö, men också i en 3D-organotypisk tillstånd som härmar in vivo miljö. Detta system ska medge en hög upplösning avbildning med skyddsglas-baserade rätter i vävnad eller organ kultur med 3D spårning av enskild cell migration in vitro och ex vivo och kan vara ett mellansteg innan man går in i vivo paradigm.
Protocol
1. Neural stamcellstransplantation isolering
- Dissekera hela hjärnor från E14-16 möss och lägg i kallt DMEM/F12 basal medium. Ta bort alla hjärnhinnorna under ett anatomiskt mikroskop och hjärnor över till ett 35 mm petriskål.
- Använd fin pincett för att mekaniskt dissociera hjärnor i vävnadsfragment och överföra dem till ett 15 ml rör och centrifugera därefter prover vid 800 rpm i 3 minuter för att avlägsna skräp.
- Lägg DMEM/F12 innehåller bFGF och EGF och finfördela med en 1 ml pipett.
- Passera cellsuspensionen genom en cellfilter att erhålla en enkelcellsuspension.
- Plate celler i kolvar på 2-5 x 10 4 celler / ml, sedan en fullständig byte av medium var 3 dagar och passage cellerna var 6 dagar.
- Efter minst 5 passager, digestiv neurosfärer till enstaka celler med användning av trypsin och EDTA och växa på poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic kammare (framställd såsom beskrivs nedan i 2). Använd den växande mediet innehållande N2-tillägg,bFGF och EGF alltid att hålla egenskaper NPCs.
2. Framställning av den electrotactic kammaren
- Förbered 22 x 11 mm remsor av glas genom att dividera autoklaveras 22 x 22 mm No.1 tjocklek täckglas i halv med en diamant penna.
- Skapa ett fristående glas väl om innermåtten 22 x 10 mm genom limning tillsammans fyra vertikalt stående 22 x 11 mm remsor med högvakuum silikonfett. Låt brunnarna helt torka och hårdna över natten.
- Följande dag, bifoga två 22 x 11 band mm glas, parallellt med varandra vilket ger en öppning på 10 mm, till basen av en 100 mm odlingsskål med silikonfett. Täta området mellan dessa band genom att placera en 22 x 22 slip mm lock i varje ände, fäst till botten av skålen med fett på tre sidor, men inte att närmast centrum.
- Placera glaset väl förberedd i steg 2,2 på täckglas så att de inre väggarna skapar ett slutet utrymme för såddcellerna på botten av plattan. Vattentäta alla skarvar med silikonfett. Kappa denna begränsat område sekventiellt med poly-D-lysin sedan laminin: tillsätt 1 ml poly-D-lysin in i kammaren och lämnar i 5 min för att tillåta den poly-D-lysin för att binda till botten av plattan, tvätta kammaren med steril PBS två gånger, därefter späda laminin i steril PBS för att ge 20 ^ g / ml och använda för att täcka botten av plattan. Låt stå i rumstemperatur över natten.
- Följande dag celler skörd och förbereda 1 ml suspension innehållande 1 x 104 celler. Ta laminin från glaset väl gör det möjligt att lufttorka helt och ersätta med 1 ml cellsuspension. Placera in skålen i inkubator vid 37 ° C under minst 4 timmar för att medge fastsättning.
- När cellerna väl är tillräckligt sammanflytande avlägsna all mediet från kammaren. Ta försiktigt bort glaset väl. Bilda ett tak över cellerna genom att noggrant fästa, med silikonfett, en autoklaverad 22 x 22 mm täckglasöverbryggning mellan de två 22 x 11 mm remsor. Täcka cellerna med några droppar av mediet för att undvika uttorkning.
- Bilda en isolerad medel reservoar i varje ände av kammaren genom att skapa två vattentäta silikonfett hinder som går från ena kanten av skålen till den andra, över kammaren taket. Fylla kammaren med färskt medium, vilket säkerställer en genomströmning från ett medium reservoaren till den andra. Återföra skålen till inkubatorn under 12 timmar för att medge cellåtervinning.
3. Applicering av ett elektriskt fält på electrotactic kammaren
- Framställa ett lock för att täcka skålen genom att borra två hål, ett placerat över var och en reservoar av migreringen kammaren.
- Ersätta all mediet i kammaren med odlingsmedium innehållande 25 mM HEPES-buffert och överför skålen till tempererad avbildningssystem. Ställ in de experimentella parametrar för time-lapse-och multi-position inspelning. Rikta kammaren så att katoden och anoden ärtill vänster och höger respektive, för att säkerställa att EF vektorn löper horisontellt, såsom visas ned mikroskopet och registreras i avbildningssystemet.
- Fylla två bägare med Steinbergs lösning (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO3) 2 0,4 H 2 0, 1,3 mM MgSO 4 0,7 H 2 0 och 4,6 mM Trizma-bas, pH 7,4). Anslut en separat bägare till varje medel reservoar med färdiga glas broar (glasrör ca 13 cm lång och ~ 3 mm i diameter, och böjde till en U-form genom uppvärmning i en Bunsen låga), fyllda med 2% (w / v) Steinberg's-agarlösning, som passerar genom hålen i locket. Fullborda den elektriska kretsen genom att placera Ag / AgCl-elektroder anslutna till en likströmskälla till varje bägare av Steinbergs lösning.
- Ställ spänningen ratten på strömförsörjningen till 0 och slå på. Mät spänningen över electrotactic kammaren samtidigt som du vrider upp spänningen ratten, med hjälp av en voltmeter och justera för att passa de experimentella kraven.
- Start time-lapse inspelning. Utför ett medium förändring och justera spänningen efter behov, varje timme. Färskt medium, droger eller kemiska medel kan tillsättas till de reservoarer som krävs. Då utför byte av medium, kan två alternativ övervägas enligt nedan:
- Alternativ No.1 - För att pausa time-lapse inspelning tillfälligt försiktigt bort glas broar från kammare för att undvika störande täcklock, använd en steriliserad Pasteurpipett försiktigt ersätta alla medium med färskt medium och sätta glas broarna tillbaka, så återuppta inspelningen.
- Alternativ nr 2 - Alternativt, skräddarsydda täcklock med 4 hål (två placerade över varje reservoar av migrationsprocessen kammaren) kan också användas för medelstora förändring ändamål. Två för glas broar anslutning, de andra två för att ändra medium. Alternativ 2 innebär att kontinuerlig inspelning utan störningar under medelstora förändring.
4. Beredning av organotypisk ryggmärgen slice
- Dissekera Lumbar ryggmärg hos 2 veckor gamla C57 BL / 6 möss.
- Skär ryggmärg i 500 nm tjocka sektioner med en Mcllwain vävnad chopper.
- Separata skivor under en anatomiskt mikroskop och välj skivor med intakt sagittal / axiell ryggmärgen struktur.
- Plate skivor i en 35 mm petriskål med 30 pl Matrigel och placera dem så nära centrum som möjligt och behålla dem i en 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C under minst 30 min tills Matrigel proteiner själv montera för att producera en tunn film som täcker ytan av ryggmärgen skiva. Det är mycket viktigt att se till att Matrigel har monterats helt inkubera petriskål vid 37 ° C i ytterligare 30 minuter om det behövs.
- Tillsätt 4-6 ml DMEM/F-12 medium innehållande 25 mM HEPES-buffert och 15-20% fetalt kalvserum mycket försiktigt för att undvika mediet strömma direkt på skivan. Säkerställa att skivan inte är helt nedsänkt i mediet som lämnar ytan hos explantat väl utsatts förluften. Ändra mediet två gånger per vecka.
5. Injektion av Hoechst märkta 33342 NPCs i organotypisk ryggmärgen slice
- Bereda NPC suspensionen vid 1 x 10 6 celler / | il.
- Pre-inkubera cellsuspensionen i medium med 5 iM Hoechst 33342 under 30 min.
- Använda kapillär glasrör att mikroinjicera 2 | il av suspensionen in i ryggmärgen skiva långsamt under ett mikroskop. Se kapillärrör glasrör passerar genom Matrigel (rosa delen under mikroskop) och når på insidan av ryggmärgen slice (grå vävnad under mikroskop), kvar i ryggmärgen slice i minst 30 sekunder för att undvika cellsuspension överkörd. Sätt petriskålen innehåller ryggmärgen skiva i inkubator (37 ° C 5% CO 2) och lämna den över natten.
- Nästa dag, tillämpa en EF på 500 mV / mm till ryggmärgen slice innehåller Hoechst 33342-märkta NPCs i electrotactic kammaren (med hjälp av metoder som beskrivs i3).
6. Representativa resultat
När NPC: er exponerades för en rad fysiologiska EF de visade mycket riktad cellmigrering mot katoden (figur 1). Samma iakttagelse gjordes också på en enda cell nivå på organotypisk ryggmärgen slice ex vivo-modell, en 3D-miljö imiterar in vivo förhållanden (figur 2).
Figur 1. NPCs visar riktad migration i EFS. PC visade mycket riktad migration mot katoden när de utsätts för EFS röda linjer och blå pilar representerar banor och inriktning av cell Movement (A). B visar migration vägar NPCs. Bar: 50 nm.
Figur 2. Transplanterade NPCs visar riktad migration mot katoden i organotypisk ryggmärgen slice
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen vi använder är baserade på tidigare studier 5,11. Genom att använda dessa metoder, stabil kultur och elektrisk ström kan upprätthållas samtidigt som en EF via agar broar, Steinbergs lösning, och Ag / AgCl elektroder, till celler eller skivor som odlats i Skräddarsydda electrotactic kammare standardiserade och exakt mått. Djupet av kamrarna kan justeras för att rymma för olika prov tjocklekar 11, och i fallet med celler, kan kammarens storlek modifieras för att rymma emellertid många celler krävs (t ex Western blot-analys kräver många celler). Vi har modifierat och utvecklat dessa metoder för att förfaranden som inte är tekniskt möjligt att spåra celler in vivo med time-lapse inspelning vid en enda cell nivå. Majoriteten av tidigare forskning på cellulära svar på EFS, har utförts i 2D-miljöer. Den in vivo-studie av electrotactic respons av NPC vid en enda cell nivåskulle ge avgörande bevis för att styrka någon fysiologisk relevans. Detta är dock tekniskt mycket svårt att uppnå med dagens teknik, speciellt när man försöker få realtid inspelningar cell migration. Vi har tagit ytterligare steg för att upprätta en ex vivo organotypisk ryggmärgen modell bit kultur, tätt imitera in vivo miljön, visar att celler fortfarande har en electrotactic svar i en 3D-miljö, som visas i figur 2. Denna metod kan också vara lämpliga för att observera effekterna av EF på en mängd olika celltyper inom en organotypisk 3D-miljö, såsom sårläkning i epitelial vävnad, angiogenes i aortaringen eller kyckling CAM, och eventuellt genetiska effekter i kycklingembryo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Royal Society URF bidrag UF051616, Storbritannien och det europeiska forskningsrådet StG bidrag 243.261 till BS. Arbetet i MZ lab stöds också av en California Institute of regenerativ medicin bidrag RB1-01.417.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
