Summary
Hier beschrijven een werkwijze om direct zichtbaar microregional weefselhypoxie in de muis cortex
Abstract
De hersenen het vermogen om te functioneren op een hoog niveau van metabole vraag hangt af van continue toevoer van zuurstof door bloedtoevoer en weefsel zuurstof diffusie. Hier presenteren we een gevisualiseerde experimentele en methodologische protocol om direct te visualiseren microregional weefselhypoxie en perivasculaire zuurstof hellingen af te leiden in de muis cortex. Het is gebaseerd op de niet-lineaire relatie tussen nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogene fluorescentie-intensiteit en de partiële zuurstofdruk in het weefsel, waar opgemerkt weefsel NADH fluorescentie abrupt verhoogt op weefsel zuurstof dan 10 mmHg 1. We maken gebruik van twee-foton excitatie bij 740 nm die het mogelijk maakt voor gelijktijdige excitatie van intrinsieke NADH fluorescentie weefsel en bloedplasma in contrast met Texas-Red dextran. De voordelen van deze methode boven bestaande benaderingen omvatten de volgende: profiteert van een intrinsieke weefsel signaal en kan worden uitgevoerd met standaard twee foton in vivo imouder materiaal; het maakt het mogelijk continue monitoring in het hele gezichtsveld met een diepte resolutie van ~ 50 um. We laten zien dat hersenweefsel gebieden die het verst van cerebrale bloedvaten overeen met kwetsbare stroomgebieden gebieden die als eerste functioneel hypoxische is geworden na een daling van de vasculaire zuurstoftoevoer. Deze methode maakt het mogelijk om beeld microregional corticale oxygenatie en is daarom nuttig voor de behandeling van de rol van onvoldoende of beperkte weefsel zuurstoftoevoer in neurovasculaire ziekten en beroerte.
Protocol
1. Voorbereiding van het dier voor de beeldvorming
Let op: We maken gebruik van volwassen C57BL muizen. Verschillende transgene stammen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Microvasculaire operaties en pulsoximetrie worden gefaciliteerd in muizen met een witte vacht (bv. FVB-stam).
- Bereid de chirurgische site op de bank. Alle chirurgische instrumenten moeten worden geautoclaveerd of gedesinfecteerd met 70% ethanol.
- Plaats een rectale sonde, en voortdurend van het dier lichaamstemperatuur te meten tijdens de gehele procedure
- Verdoof de muis met behulp van in eerste instantie 5% isofluraan. In 15-30 s, Als het dier niet in beweging is, leg het op een verwarmingselement (37 ° C), en pas een gezichtsmasker voor de continue toediening van lucht met 1,3-1,5% isofluraan). Zorg ervoor dat het dier niet reageert op een pijnprikkel (bv staart knijpen).
- Gebruik kunstmatige traan gel om de muis van de ogen te bedekken, om blootstelling aan droge lucht te voorkomen.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, verwijder haar from het hoofd en van beide dijen. Breng haar remover (bijv. Nair) om de dij gedurende 2 minuten, en dan voorzichtig veeg het om de resterende haren te verwijderen. Dit dij zal worden gebruikt voor oximetrie.
- Desinfecteren de hoofdhuid met een 10%-ige povidonjood-oplossing en 70% ethanol.
2. Voorbereiding van het open schedel schedel venster
- Vanaf 5 mm caudaal van de schedel, maakt een sneetje in de hoofdhuid met een schaar, en vooruit een centimeter. Verplaats huid aan de zijkanten om de schedel bloot te leggen.
- Om de membranen te verwijderen op de schedel toepassing 10%-oplossing naar de top van de schedel. Veeg de overtollige oplossing, en weg te schrapen van de membranen met 45 ° hoek # 5 pincet. Het is belangrijk om de plaats nauwkeurig op te stellen, zodat de kopplaat kan stevig worden bevestigd aan de schedel (de stappen 4-6).
- Met behulp van een dissectie microscoop te identificeren op het gebied van belang. Merk op dat de schedelnaden moet worden vermeden, omdat de schedel ceen onvoorspelbaar breken in deze richting.
- Een dunne laag van snelle lijm (bijv. Locktite 454) langs de randen van het raam van de kopplaat (figuur 1). Plaats de kopplaat zodanig dat het gebied van belang is blootgesteld in het venster. Breng lichte druk op het hoofd plaat. Breng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement om de lijm te snel te polymeriseren. Houd gedurende 10 seconden, terwijl de lijm wordt polymerisatie.
- Een kleine hoeveelheid van snelle lijm op de randen van het raam van de kopplaat en de schedel dichten. Schroef de kop plaat om het dier houder onder de dissectie scope.
- Met behulp van de Microtorque II boor vastgesteld op 6000 rpm en een IRF 005 boor, verwijder alle extra lijm van de schedel en van het hoofd plaat. Eventuele resterende lijm op het hoofd plaat dient te worden verwijderd, omdat ze anders interfereren met de bevestiging van de glazen afdekplaat.
- Zet de boor bij 1000 rpm, en start het boren van de schedel door het maken van een cirkel in het hoofd plaat venster, een diameter van ~ 5 mm. Gebruik licht strijkende bewegingen alsof je tekenen met een zeer zacht potlood. Stop met het boren van elke 20-30 seconden op het bot stof met behulp van perslucht te verwijderen.
Opmerking: De vorm van de opening in de kop plaat maakt het mogelijk extra toegang voor de boor (voor links-en rechtshandig chirurg), wat maakt het makkelijker om een ronde schedel venster te maken. Bovendien zijn de twee oneven gevormde gaten de benodigde ruimte voor een Clark-elektrode of glas-electrode te voegen in het hersenweefsel onder de schedel venster extra polarografische of elektrofysiologische metingen. - Zoals het boren voortgaat een hol gevormd rond de intacte schedel in het midden. Wees voorzichtig niet te porren door de verdunde schedel, maar om dit hol van gelijke dikte te maken. Wees extra voorzichtig rond de grote bloedvaten, ze mogen niet worden aangetast en, indien mogelijk, zelfs niet aangeraakt.
- Gebruik een "been" pincet # 3 heffen ("beweeg off") het bot in het midden van het venster. Breng een druppel artificial cerebrospinale vloeistof (aCSF) op het raam.
- Veeg aCSF voorzichtig met een hoek van zacht weefsel papier (bijvoorbeeld Kimwipe). Gewoonlijk de duur beschadigd in een of meer plaatsen langs de rand van het raam. Vanaf een van deze sites, til en dan de dura te verwijderen uit de hersenen oppervlak, met behulp van hoek van 45 ° pincet # 5. Bij de keuze van de plaats waar beginnen verwijderen dura, voorkomen de gebieden grenzend aan grote bloedvaten. Als er een bloeding optreedt, breng dan een druppel aCSF en wacht 2-3 minuten voor kleine bloedingen te stoppen.
- Bereid 0,07% bij lage temperatuur smeltende agarose opgelost in aCSF) de gesmolten agarose Breng aan de lichaamstemperatuur. Veeg de overmaat aCSF van het oppervlak van de hersenen. Giet de agarose in het venster, en dek af met een glasplaatje. Druk zachtjes op het glas om een contact tussen het glas en het hoofd plaat te maken, en wacht 10-20 sec tot de agarose is solide.
- Verwijder het teveel aan agarose uit de glazen afdekplaat met een pincet en het zachte weefsel papier.
- Zet een kleinehoeveelheid van snelle lijm rond het glas te lijmen het glas naar het hoofd plaat. Breng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement om de lijm (figuur 1) stollen.
3. Intraveneuze injectie en bloedoxygenatie controle
Let op: Wij routinematig gebruikt de lies voor intraveneuze toepassing van Texas rode in plaats van de staartader. Dit komt omdat dijader injecties een veilige en reproduceerbare bolusinjecties van de kleurstof.
- Draai het dier gedeeltelijk naar de binnenzijde van de linkerdij bloot. Gebruik tape om het dier veilig te stellen in deze positie.
- Breng antiseptische scrub, en vervolgens 100% ethanol voor de huid.
- Maak een insnijding langs de mediale dij van de knie tot het bekken. Aparte zachte weefsels door stompe dissectie met een pincet # 5.
- Vul 1 ml spuit met 130 ul van Texas Red (2,5 mg / ml). Bevestig een nieuwe naald (gauge 30), en zorgvuldig buig het op 30 °, het bijhouden van de schuine kant op. Vul de naald wie Texas Red oplossing.
- Onder een dissectie microscoop, steek de naald in de lies en injecteer 100 ul van Texas Red. Verwijder de naald en licht de ader drukt u op met een gaasje om het bloeden te stoppen.
- Sluit de huid met behulp van 4-0 hechtdraad.
- Voor continue bewaking van het bloed SpO 2 (voldoende bloedoxygenatie te garanderen) plaats de oximeter sonde op de rechter dij (waar haar werd eerder verwijderd).
4. Twee-foton beeldvorming
Opmerking: Wij maken gebruik van een Olympus Fluoview1000 multifoton imaging-systeem (rechtop) met een Spectra-Physics Maitai HP DeepSee femtoseconde Ti: Sa laser als een excitatie bron. Voor de beeldvorming, gebruiken we × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), of × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) water-onderdompeling doelstellingen. We nemen beelden 12 bitdiepte met een resolutie van 512 x 512 pixels met een pixelverblijftijd van 2 ps. De NADH en Texas-Rood-dextran gelijktijdig enthousiast op 740 nm, en fluorescence is gescheiden van het excitatie licht met behulp van een dichroïsche spiegel / nabij-IR-sperfilter combinatie (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA), verdeeld in twee kanalen met behulp van een dichroïsche spiegel (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), en de bandbreedte gefilterd (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laservermogen gemeten na de doelstelling 10-20 mW voor beeldvorming bij laag I en 20-50 mW voor beeldvorming bij laag II.
- Breng de chirurgisch voorbereid muis om de microscoop podium. Neem een eerste beeld van de schedel venster site met behulp van helderveld verlichting met 4-voudige vergroting om als referentie kaart voor registratie te gebruiken met een hogere vergroting twee-foton angiografieën.
- Zoom in op het gebied van belang aan de hand × 10 vergroting. Een gebied van belang in corticale lagen I en II (tot 150 pm onder het oppervlak pial). Als er een hogere vergroting gewenst is, gebruik dan × 25 doel
- Begin op te nemen de tijdreeks (FiguAd 2). Wij raden een gemiddelde van 3-5 frames om de kwaliteit van het beeld te vergroten.
- Induceren hypoxie door toevoeging van 50% N2 in de lucht het dier ademt. Dit zal het O2-niveau tot 10%. Controleer of hypoxemie door het bewaken van oximeter gegevens.
- Blijf de tijdreeksen op te nemen door middel van hypoxie (bijvoorbeeld voor 30 seconden), en na de normale O2-niveau is hersteld.
- Verzamel gegevens voor de berekening van de zuurstof die de distributie door het detecteren, meten en kwantificeren van de oppervlakte van hypoxie en zuurstofrijk weefsel cilinders rond de bloedvaten.
5. Gegevensverwerking
- Bepaal de Krogh weefsel cilinder straal R. Dit kan manueel (figuur 3) door de afstand tussen het middelpunt van het bloedvat en de grens waarbij hoge NADH fluorescentie wordt waargenomen.
- U kunt ook de computationele onderzoekers onafhankelijk semi-automatische bepaling van het weefsel cilinder straal R en de centrale blood schip r dat al eerder is beschreven in een aanvullende vorm en samengevat in de bespreking van dit protocol.
- Bepaal het oppervlak van hypoxie met behulp van open-access beeldanalyse software, bijvoorbeeld ImageJ. Om dit te doen, gebruik maken van NADH-signaal, definieert u een drempel die de hoge NADH intensiteit gebied afbakent, en meet vervolgens het gebied met verhoogde NADH weefsel fluorescentie.
6. Representatieve resultaten
Figuur 2 toont een video van NADH / angiografie beelden tijdens de voorbijgaande hypoxemie (voor de PDF-versie van deze figuur, geselecteerde foto's zijn gebruikt). De zuurstof concentratie werd verlaagd van 21% naar 10% voor een periode van 3 minuten. Dit niveau van experimenteel geïnduceerde hypoxemie is voldoende om ernstige hypoxie te induceren in de cerebrale cortex. Hypoxie leidt tot een toename van NADH fluorescentie, eerst in de domeinen die het verst van de arteriële bloedtoevoer. Let op de scherpe NADH weefselgrenzen, die waarneembare weefsel grenzen van zuurstofdiffusie vormen van de corticale microcirculatie. Het beeld in figuur 3 de geometrie van zuurstofdiffusie grenzen rond cerebrale bloedvaten. Het is af te leiden Krogh cilinder diameters van deze grenzen, zoals eerder beschreven 1.
Figuur 1. (A) Muis met schedel venster voorbereid voor de beeldvorming. (B) Afmetingen van het hoofd van plaat.
Figuur 2. Endogene NADH groene fluorescentie zichtbaar gemaakt met twee-foton beeldvorming door middel van craniale raam, ongeveer 50 urn onder het pial oppervlak. Bloedvaten worden gevisualiseerd met Texas Red dextran. Zuurstof in ingeademde lucht werd verlaagd tot 10% gedurende 3 minuten, en dan hersteld voor 21%. Schaal bar: 50 pm.
<img alt = "Afbeelding 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" />
Figuur 3. Geometrie van NADH fluorescentie grenzen. Geel schets toont grens van functionele hypoxie; blauwe cirkels geven geprojecteerd zuurstof (Krogh) cilinders. Blauwe lijnen geven cilinder stralen; cijfers laten zien stralen in micrometers.
Discussion
Een hoge ruimtelijke resolutie informatie over zuurstofdiffusie is belangrijk om te begrijpen hoe de bloedstroom in de hersenen wordt geregeld om zuurstof aan hersencellen, en de metabole vraag te voldoen. Traditionele polarografische zuurstof metingen met behulp van Clark-stijl glazen elektroden zijn zeer ingrijpend en hebben een lage ruimtelijke resolutie 2-3 en significant (tweede reeks) responstijd. Tot nu toe de enige niet-invasieve methode voor het meten van pO 2 in hersenweefsel is fosforescentie afschrikken, waar de snelheid van het verval van de aangeslagen sonde is evenredig aan de zuurstofconcentratie 4. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige zuurstofconcentraties, maar vereist een eigen kleurstof en een technisch geavanceerde fosforescentie levensduur imaging systeem. Hier tonen we een eenvoudige, eenvoudiger aanpak die kan op een standaard twee-foton imaging-systeem worden uitgevoerd met twee flurescence kanalen. Onze aanpak maakt gebruik van een intrinsieke weefsel-signaal 5 and vereist slechts contrasterende visualisatie van de corticale microcirculatie. Vanwege de niet-lineaire, in hoofdzaak tweewaardig toename van NADH fluorescentie bij functioneel beperken zuurstofconcentraties 1 verhoogd intrinsieke NADH fluorescentie wordt alleen waargenomen in gebieden met aanzienlijke beperking metabolisch hypoxie. Een belangrijke implicatie is dat weefsel grenzen van zuurstof diffusie van corticale microvaten rechtstreeks waarneembaar zijn door de cilindervormige intensiteit veranderingen van de endogene NADH fluorescentie. We verwijzen naar deze structuren als Krogh cilinders, omdat het concept van cilindervormige structuren die de zuurstof volume van weefsel rondom een bloedvat te definiëren werd geïntroduceerd door August Krogh en is recent experimenteel waargenomen met behulp van twee-foton NADH imaging 1. Krogh cilinders beelden kunnen worden verzameld in 3D door een z-stapel scannen. Ze zijn vooral prominent in de buurt van indringende arteriolen en ze zijn congruent with capillaire uitgeput periarteriolar weefsel cilinders 1,4.
Om een objectieve bepaling van de Krogh weefsel cilinder straal R (zie paragraaf 5.2) hebben we hun radiale pixel intensiteit gemeten waarden in een goed gedefinieerde segment tussen het centrum van de cilinder en de buitenste grens met behulp van de Matlab functie "improfile" te leveren. De buitenrand van het segment worden gekozen uit te breiden met een veiligheidsmarge buiten het zichtbare grens. Om de signaal-ruis niveau te verbeteren we averageed over alle radiale lijnen nodig zichtbare cilindersegment op 1 ° stappen omvatten. De resulterende gemiddelde radiale intensiteit profiel binnen het segment vertoonde een sterke stijging, die overeenkwam met de zichtbare weefsel grens R. De we past een sigmoïdale functie (bijvoorbeeld Boltzmann functie) de gemiddelde radiale intensiteitsprofiel en gebruikte de buigpunt (ook bekend als x 0) als een definitie van R. De bijbehorende twee photon microangiography (Texas-rood) bleek de doorsnede van een enkele centrale bloedvat in het centrum van de cilinder. De diameter van de centrale bloedvat kan direct worden toegepast r bepalen.
Twee-foton NADH imaging biedt dezelfde ruimtelijke resolutie als de gelijktijdige hoge-resolutie afbeelding van de corticale microangiography. Een belangrijk kenmerk voor de kwantitatieve toepassing van deze methode is dat p 50 van de NADH fluorescentie toename gemeten als 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 en dat de NADH fluorescentie-intensiteit als functie van microregional weefsel pO 2 kan mathematisch worden beschreven met een sigmoïdale functie. . We tonen aan dat deze techniek maakt het mogelijk om vast hersendelen die het meest gevoelig hypoxie (door afnemende zuurstofgehalte in de lucht 10%). We tonen ook aan dat de zuurstof diffusie een eenvoudige geometrische perivasculaire patroon volgt.
Een critsche stap van deze methode is de kwaliteit van de schedel venster preparaat. De operatie moet leiden minimale schade om niet om de bloedstroom te verstoren met het blootgestelde gebied. Een zorg is dat in een chirurgisch gecompromitteerd voorbereiding, de cortex onder het raam kan hypoxische om te beginnen, zich verzet tegen een zinvolle experimenten. Een goed voorbereide craniale venster moeten intact grote en kleine bloedvaten met levendige bloedstroom in alle types schepen en er geen significante bloedingen langs de randen. Onder normoxie (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) van de hersenen parenchym moeten vertonen een uniforme, homogene NADH fluorescentie zonder opvallende, lichte weefsel plekken met verhoogde NADH fluorescentie.
Een fundamentele fysieke beperking van onze aanpak is beperkt diepte penetratie. De blauw-groene NADH fluorescentie in de hersenen wordt snel verzwakt door hemoglobine absorptie en verstrooiing weefsel op deze golflengten. Zelfs met een hoge numerieke apertuur (bijv. 1,05) wateronderdompeling doelstellingen twee-foton NADH beeldvorming is momenteel beperkt tot corticale lagen I en II. Deze beperking is wetenschappelijk relevant omdat energiemetabolisme in of in de nabijheid van de witte stof zal waarschijnlijk verschillen van de grijze stof. Echter, de onderzoek diepe corticale structuren zoals lagen IV-VI en subcorticale structuren zoals witte stof contracten of het striatum is het gebruik van speciale microlenzen zoals beschreven in de muis cortex in vivo 6.
NADH op basis van meting van zuurstof diffusie grenzen kan vooral nuttig zijn in combinatie met andere metingen zoals analyses van functionele hyperemie, en detectie van capillaire fluxen 7. Bijvoorbeeld kan deze techniek worden aangepast aan hypoxie visualiseren beroerte en ziekte van Alzheimer (AD) modellen. De eenvoudige geometrie van zuurstof diffusie maakt het mogelijk om de zuurstof gradiënt in microvasculaire bedden te voorspellen onder omstandigheden waarin capillaire dichtheid is detoegenomen 8 (bijv. AD 9) en te onderzoeken of hersenweefsel regio's met een verminderde capillaire dichtheid hebben een verhoogd risico op hypoxie schade als gevolg van microstrokes. De mogelijkheid om microregionally maakt het ook mogelijk om de vorm en afmetingen van het weefsel microstrokes onderzoeken en het volume van weefsel waarin hypoxie optreedt bepalen, alsmede de verhouding tussen weefselhypoxie en vervolgens neuronale dood of capillair remodellering 10.
Tot slot, aangezien stijgingen van de endogene NADH fluorescentie zijn het directe gevolg van acute mitochondriale dysfunctie, deze methode biedt de mogelijkheid om NADH beeldvorming te gebruiken als een specifieke verslaggever voor neurale energiemetabolisme 11 en een proxy voor mitochondriale dysfunctie.
Tot slot, twee-foton beeldvorming van endogene NADH fluorescentie is een eenvoudige, niet veeleisend instrument dat kan worden gebruikt om zuurstof levering en het verbruik in de hersenen te begrijpen, zowel onder normaleen pathologische toestanden.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) voor de kopplaat ontwerp. Het werk werd ondersteund door NIH awards uit aan SD (R01DA026325 en P30AI078498 en de stichting subsidies aan KK (DANA Stichting Brein en Immunoimaging programma American Heart Association 0635595T en de ALS Association [# 1112)]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Co. | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
- Ndubuizu, O., LaManna, J. C. Brain tissue oxygen concentration measurements. Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).
- Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
- Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
- Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
- Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
- de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
- Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
- Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).
