Summary
Descriviamo un clone molecolare di Maedi-Visna virus che esprime GFP ed è completamente infettive. Replicazione di questo virus possono essere rilevati tramite microscopio a fluorescenza e citometria a flusso.
Abstract
Maedi-Visna virus (MVV) è un lentivirus di pecore, lentamente progressiva che causa la polmonite interstiziale e l'encefalite 1. Le cellule bersaglio primario della MVV in vivo sono considerate dei 2 lignaggio monociti. Alcuni ceppi di MVV può replicare in altri tipi cellulari, ma 3,4. La proteina verde fluorescente è un marker comunemente usato per lo studio lentivirus nelle cellule viventi. Abbiamo inserito il gene EGFP nel gene per dUTPase di MVV. Il gene dUTPase è ben conservato in ceppi più lentivirus di pecore e capre e ha dimostrato di essere importante nella replicazione del CAEV 5. Tuttavia, dUTPase ha dimostrato di essere indispensabili per la replica del clone molecolare di MVV usato in questo studio sia in vitro che in vivo 6. Replica MVV è strettamente limitata alle cellule di pecora o capra origine. Noi usiamo una linea principale di cellule dal plesso coroideo di pecore (cellule SCP) per la trasfezione e la propagazione del virus 7. La MVV fluorescente è completamente infettive e di espressione EGFP è stabile per almeno 6 passaggi 8. C'è una buona correlazione tra le misurazioni di TCID 50 e EGFP. Questo virus dovrebbe quindi essere utile per il rilevamento rapido delle cellule infette negli studi di tropismo cellulare e patogenicità in vitro e in vivo 8.
Protocol
1. Trasfezione
Il clone molecolare è contenuto in due plasmidi, p8XSp5-EGFP e p67r, di 12 kb e 4,5 kb rispettivamente. 9,10
- Tagliare quantità equimolare di due plasmidi, ovvero 4,4 mg di p8XSp5-EGFP e 1,6 mg di p67r con XbaI e legare prima di trasfezione.
- Per la legatura, usare 1 unità Weiss di ligasi in una reazione 50 microlitri e incubare a 16 ° C durante la notte.
- Quando la legatura è completata, incubare la miscela legatura a 65 ° C per 15 minuti per l'inattivazione della ligasi. Questo passaggio può essere omesso.
- Due giorni prima della transfezione, semi di 10 6 cellule SCP in un pallone T25 di coltura tissutale, e far crescere le cellule per due giorni in 5 ml di DMEM + 10% siero di agnello e glutammina 2mM senza antibiotici per un monostrato di 90% di confluenza. Se le cellule non hanno raggiunto il 90% confluenza dopo due giorni, lasciare le cellule a crescere un giorno in più.
Nota: Il siero di agnello può essere sostituito da siero bovino fetale (FBS). Noi abitualmente uso di agnello siero, dal momento che alcuni ceppi di MVV sono inibiti da FBS; questo ceppo MVV non è inibito da FBS, comunque.
- Quando le cellule sono pronti per la transfezione, il cambiamento medio DMEM con 1% di siero (siero o agnello FBS) senza antibiotici.
Noi usiamo Lipofectamin 2000 (Invitrogen) per la trasfezione. - Diluire il DNA in 500μl Opti-MEM medium.
- Diluire 20μl Lipofectamin 2000 a 500μl Opti-MEM medio e lasciare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Dopo l'incubazione 5 minuti, unire il DNA diluito con Lipofectamine diluito 2000 (volume totale = 1000 ml). Mescolare delicatamente e incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela di trasfezione (1 ml) al pallone T25 contenente cellule SCP e medie (5 ml). Miscelare delicatamente a dondolo.
- Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (18 - 24 h).
- Cambia media il giorno successivo a DMEM con 1% di siero, 2mM glutamina, penicillina e streptomicina 100IU 100IU.
- Monitorare la produzione di GFP nelle cellule SCP da invertita microscopia a fluorescenza. Bassa efficienza di trasfezione può essere previsto con queste pile, di solito 5 - 15%.
- Mantenere ancora in incubazione a 37 ° C, 5% di CO 2 per diversi giorni per consentire la diffusione del virus nel pallone. Di solito ci vogliono 7-14 giorni per l'infezione pieno.
- Raccolto il virus aliquoting il surnatante in provette Eppendorf. Spin in una microcentrifuga a 3000 rpm per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il supernatante contenente il virus ai nuovi tubi. Conservare a -80 ° C.
2. Titolazione di virus
- Semi di 3x10 4 celle SCP in 100 microlitri di media DMEM supplementato con 10% siero, 2mM glutammina, 100IU/ml penicillina e streptomicina 100IU/ml, per bene in una piastra da 96 pozzetti. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Se le cellule sono confluenti il giorno successivo, il cambiamento medio DMEM con 1% di siero, 2mM glutamina, penicillina e streptomicina 100IU/ml 100IU/ml, 100 l in ciascun pozzetto.
- Diluire il virus nel modo seguente:
- Aggiungere 180 microlitri DMEM con 1% di siero, 2mM glutamina, penicillina e streptomicina 100IU/ml 100IU/ml per pozzetto di 4 x 10 pozzi in un fondo da 96 pozzetti rotondi o V-piastra inferiore.
- Per le diluizioni seriali dieci volte in quadruplice copia, aggiungere 20 ml di virus a ciascuno dei 4wells nella prima colonna del piatto, e con un quattro canali pipette, pipetta su e giù per garantire che i campioni siano ben mescolati. Cambia puntali e trasferire 20 l per i prossimi 4 pozzi e così via. Lasciare i pozzi ultimi senza virus per un controllo negativo.
- Aggiungere 100 ml di diluizioni del virus alle cellule SCP e medie imprese.
- Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. Osservare per fluorescenza GFP ed effetti citopatico per due settimane.
Citopatico effetti consistono in cellule diventando arrotondata e meno trasparente rispetto a quelle normali con i processi si allunga, per finire con le cellule multinucleare appaiono e morte cellulare. - Calcolare virus titolo (TCID50) utilizzando il metodo Reed Muench 11.
3. Analisi FACS di cellule infette
Nota: Per il monitoraggio rapido di replicazione del virus, le cellule infette può essere esaminata mediante citometria di flusso.
- Trypsinize cellule infette (ca 10 5), lavare con PBS 1x e risospendere in 500μl di PBS.
- Aggiungere 500 ul di soluzione di paraformaldeide al 4% (2% di concentrazione finale), incubare a RT per 30 min.
- Celle di pellet in una microcentrifuga a 3000 rpm per 5 min.
- Lavare con PBS 2x5 min e analizzare su un analizzatore FACScan. Contano 10.000 eventi.
4. Rappresentante dei risultati:
Questo virus dovrebbe essere pienamente infettive e replicare ad un titolo del 10 Giugno-10 Luglio TCID 50 / ml. Cellule infette sono fluorescenti e possono essere detperturbato mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza. Tipicamente, GFP può essere rilevato in oltre il 60% delle cellule nelle colture di cellule infettate in citometria a flusso (Fig. 1). Allo stesso modo, quando visualizzata al microscopio a fluorescenza, la maggior parte delle cellule sono fluorescenti (Fig. 2A e B).
Figura 1. FACScan analisi delle cellule infettate con KV1772 SCP-EGFP virus dopo 7 giorni di infezione.
Figura 2. Microscopio a contrasto di fase di cellule infettate con KV1772 SCP-EGFP dopo 7 giorni di incubazione (A). Stesse cellule visualizzati al microscopio a fluorescenza (B).
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Discussion
La GFP che esprimono clone molecolare di MVV qui presentato dovrebbe essere utile per analizzare le interazioni della cellula ospite e la patogenicità dei MVV sia in vitro che in vivo. Il virus ottiene dopo 7-14 giorni di replica ha indubbiamente acquisito alcune mutazioni a causa della inesattezza della trascrittasi inversa. Tuttavia, ci sono limitazioni per l'utilizzo di questo clone come vettore singolo ciclo. Una è che l'uso del clone è limitata alle cellule di pecora e capra origine. L'efficienza di transfezione di queste cellule utilizzando il nostro costrutto è solo il 5-15%, e utilizzando un pEGFP-N3 vettore l'efficienza di trasfezione è del 15-20% rispetto a oltre il 90% con 293-T cellule. 293-T le cellule sono state testate le cellule imballaggio per vettori MVV, ma le particelle del virus risultante dimostrato non infettive, sia in cellule di pecora e 293-cellule T 12, probabilmente a causa di fattori non identificati restrizione. Il clone infettivo è contenuto in due plasmidi, che è un altro difetto. Ciò è dovuto al fatto che il full-length clone è instabile in E. coli. Tuttavia, dovrebbe essere possibile clonare il full-length in una copia clone di bassa plasmide.
Plasmidi e le cellule possono essere ottenute dagli autori.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo di ricerca islandese e l'Università di Fondo Islanda ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10938025 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 51985018 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
- Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
- Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
- Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
- Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
- Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
- Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
- Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
- Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
- Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
- Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).
