Summary
Мы опишем молекулярный клон maedi-visna вирус, который выражает GFP и полностью заразным. Репликация вируса могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.
Abstract
Maedi-visna вируса (СОАС) является лентивирус овец, в результате чего медленно прогрессирующая интерстициальная пневмония и энцефалит 1. Первичные клетки-мишени из MVV в естественных условиях, считаются из моноцитов 2 линии. Некоторые штаммы MVV может реплицировать в другие типы клеток, тем не менее 3,4. Зеленый флуоресцентный белок широко используется маркер для изучения лентивирусов в живых клетках. Мы вставили EGFP гена в геном dUTPase из MVV. Ген dUTPase хорошо сохраняется в большинстве лентивирус штаммов овец и коз и было показано, что играть важную роль в репликации CAEV 5. Тем не менее, dUTPase было показано, что необязательной для репликации молекулярного клона MVV использованные в этом исследовании, как в пробирке и в естественных 6. MVV репликации строго ограничивается клетками овец или коз. Мы используем первичной линии клеток из сосудистого сплетения овец (SCP клеток) для трансфекции и распространения вируса 7. Флуоресцентные MVV полностью инфекционных и EGFP выражение остается стабильной на протяжении как минимум 6 проходов 8. Существует хорошая корреляция между измерениями TCID 50 и EGFP. Этот вирус Поэтому было бы полезно для быстрого обнаружения зараженных клеток в исследованиях клеточный тропизм и патогенности в пробирке и в естественных условиях 8.
Protocol
1. Трансфекция
Молекулярный клон, содержится в двух плазмид, p8XSp5-EGFP и p67r от 12 кб и 4,5 кб соответственно. 9,10
- Вырезать эквимолярного количества двух плазмид, то есть 4,4 мкг p8XSp5-EGFP и 1,6 мкг p67r с XbaI и перевязывать до трансфекции.
- Для перевязки, используйте 1 Вайс единицу лигазы в 50 мкл реакции и инкубировать при 16 ° С в течение ночи.
- При перевязке завершен, инкубировать перевязки смесь при температуре 65 ° С в течение 15 мин для инактивации лигазы. Этот шаг может быть опущен.
- За два дня до трансфекции, семена 10 6 SCP клеток в колбе T25 культуре ткани и клетки растут в течение двух дней в 5 мл DMEM + 10% баранины сыворотки и 2 мМ глутамина без антибиотиков для монослоя на 90% слияния. Если клетки не достигла 90% слияния после двух дней, оставьте клеткам расти один дополнительный день.
Примечание: сыворотка баранина может быть заменен эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Мы обычно используют баранину сыворотки, так как некоторые штаммы MVV подавляются ФБС; это MVV штамм не подавляется FBS, однако.
- Когда клетки готовы для трансфекции, изменение средних DMEM с 1% сыворотки (баранина сыворотки или ФБС) без антибиотиков.
Мы используем Lipofectamin 2000 (Invitrogen) для трансфекции. - Развести ДНК в 500 мкл Opti-MEM среде.
- Развести 20 мкл Lipofectamin 2000 года в 500 мкл Opti-MEM средних и оставить при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- После 5 минут инкубации, объединить разбавленный ДНК разбавленным Lipofectamine 2000 (общий объем = 1000 мкл). Тщательно перемешать и выдержать в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
- Добавить трансфекции смесь (1 мл) для T25 колбу SCP клетки и среднего (5 мл). Смешайте по качалки мягко.
- Инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 ночи (18 - 24 ч).
- Изменение среды следующий день DMEM с 1% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU пенициллин и стрептомицин 100IU.
- Монитор производство GFP в клетках УПП с помощью инвертированного флуоресцентной микроскопии. Низкая эффективность трансфекции можно ожидать, эти первичные элементы, как правило, 5 - 15%.
- Инкубируйте в дальнейшем при 37 ° С, 5% СО 2 в течение нескольких дней, чтобы распространение вируса в колбу. Обычно это занимает 7-14 дней для полной инфекции.
- Урожай вируса aliquoting супернатант в пробирки Эппендорф. Спина в микроцентрифужную при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы удалить ячейку мусора. Передача супернатант, содержащий вирус нового труб. Хранить при температуре -80 ° C.
2. Титрование вируса
- Семенной 3x10 4 SCP клеток в 100 мкл среды DMEM с добавлением 10% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU/ml пенициллин и стрептомицин 100IU/ml, на лунку в 96 ячейках. Инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
- Если клетки сливной следующий день, изменение средних DMEM с 1% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU/ml пенициллин и стрептомицин 100IU/ml, 100 мкл в каждую лунку.
- Развести вирус следующим образом:
- Добавить 180 мкл DMEM с 1% сыворотки, 2 мМ глютамина, 100IU/ml пенициллин и стрептомицин 100IU/ml на скважину до 4 х 10 скважин в 96 с круглым дном или V-нижней пластине.
- Для серийного десятикратное разведение в четырех экземплярах, добавить 20 мкл вируса к каждому из 4wells в первом столбце пластины, и используя четырехканальный пипетки, пипетка вверх и вниз, чтобы гарантировать, что образцы тщательно перемешивают. Изменение наконечники и передачи 20 мкл в последующие 4 колодцев и так далее. Оставить последние скважин без вирусов для отрицательного контроля.
- Добавить 100 мкл разведения вируса к клеткам и SCP среды.
- Инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2. Соблюдайте для GFP флуоресценции и цитопатический эффект в течение двух недель.
Цитопатического эффекты состоят из клеток становятся округлыми и менее прозрачны, чем нормальные клетки с процессами, протягивая, заканчивая многоядерные клетки появляются и гибели клеток. - Рассчитать титр вируса (TCID50) с использованием метода Reed Мюнх 11.
3. FACS анализ зараженных клеток
Примечание: Для быстрого мониторинга репликации вируса, инфицированные клетки могут быть изучены с помощью проточной цитометрии.
- Trypsinize инфицированных клеток (около 10 5), мыть 1x с PBS и ресуспендируют в 500 мкл PBS.
- Добавить 500 мкл 4% параформальдегида решение (2% конечная концентрация), инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Гранул клеток в микроцентрифужную при 3000 оборотов в минуту в течение 5 мин.
- Промыть PBS 2x5 мин и анализа на анализаторе FACScan. Граф 10000 событий.
4. Представитель результаты:
Этот вирус должен быть полностью инфекционных и реплицировать на титр 10 6 - 10 7 TCID 50 / мл. Зараженные клетки флуоресцентной и может быть опрected по проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Как правило, GFP могут быть обнаружены в более чем 60% клеток в инфицированных культурах клеток методом проточной цитометрии (рис. 1). Аналогичным образом, когда визуализируется флуоресцентной микроскопии, большинство клетки флуоресцентной (рис. 2А и В).
Рисунок 1. FACScan анализа клеток SCP инфицированных KV1772-EGFP вирус через 7 дней после инфицирования.
Рисунок 2. Фазовый контраст микроскопии клеток SCP инфицированных KV1772-EGFP после 7 дней инкубации (). То же клетки визуализируется флуоресцентной микроскопии (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GFP выражения молекулярного клона MVV, представленные здесь должны быть полезен для анализа клетки-хозяина взаимодействия и патогенность MVV как в пробирке и в естественных условиях. Вирус, полученный после 7-14 дней репликации, несомненно, приобрел некоторые мутации из-за неточности обратной транскриптазы. Однако Есть ограничения на использование этого клона как единый вектор цикла. Во-первых, использование клонов ограничен клетки овец и коз. Эффективности трансфекции этих клеток с помощью нашего построить только 5-15%, и используя pEGFP-N3 вектор эффективности трансфекции составляет 15-20% по сравнению с более чем 90% при использовании 293-Т-клеток. 293-Т-клетки были испытаны в качестве упаковочных клеток для MVV векторов, но в результате вирусных частиц доказал неинфекционных как у овец клеток и в 293-Т-клетки 12, вероятно, из-за неизвестных факторов ограничения. Инфекционные клон, содержится в двух плазмид, что является еще одним недостатком. Это связано с тем, что полнометражный клон неустойчив в E.coli. Тем не менее, должна быть возможность клонировать полнометражный клон в низкой копии плазмиды.
Плазмиды и клетки могут быть получены от авторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Фондом исландского исследований и Университета Исландии фонд исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10938025 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 51985018 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
- Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
- Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
- Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
- Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
- Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
- Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
- Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
- Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
- Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
- Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).
