Summary
हम उपन्यास प्रयोगशाला उपकरणों और thymus के intravital इमेजिंग अधिग्रहण के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया है. हमारी तकनीक थाइमस जहां टी सेल विकास होता है के भीतर "niches" की पहचान में मदद करनी चाहिए.
Protocol
1. पशु तैयारी
महत्वपूर्ण नोट: बी.एम. सेल निलंबन और thymic प्रत्यारोपण सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया. बी.एम. निलंबन हमारे सेल संस्कृति कमरे के डाकू के अंदर तैयार थे, जबकि thymic प्रत्यारोपण शल्य हमारे जानवरों की सुविधा के भीतर स्थित कमरे में प्रदर्शन किया गया था. आदेश में रखने के लिए और इन सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों की गारंटी, हम इन स्थानों में हमारे वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति नहीं थे. हालांकि, सभी शल्य चिकित्सा सामग्री autoclaved थे और शल्य बेंच Virkon (pharmacal अनुसंधान प्रयोगशालाओं, Inc) और 70% इथेनॉल के साथ पहले साफ किया गया था. सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित किया गया और समिति (IACUC) का उपयोग करें और वे यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान (FELASA) एसोसिएशनों निर्देशों के संघ के साथ समझौते में थे. अनुमोदन आईडी संख्या AO10/2010 है. सभी छवि प्रयोगों टर्मिनल प्रक्रियाओं थे और जानवरों तुरंत छवि के अंत के बाद euthanized थेअधिग्रहण.
विस्तृत प्रक्रिया निम्नानुसार है:
- चमकाना (एक γ irradiator साथ) 900 rads के साथ 8 सप्ताह पुरानी नग्न चूहों की हड्डी marrows (बी एम) के अंदर अंतर्जात hematopoietic व्यापारियों को नष्ट. विकिरण के बाद, अपने पिंजरों में जानवरों वापस जब तक आप अंतःशिरा इंजेक्शन और आगे बी.एम. पुनर्गठन के लिए दाता कोशिकाओं बी.एम. तैयार. यह बी.एम. हस्तांतरण के विकिरण के बाद 1 घंटे का प्रदर्शन किया गया था.
- बी.एम. दाता जानवरों अलग. Tibias और एक जानवर की हिंद अंग के femurs आम तौर पर 3 प्राप्तकर्ता पशुओं के लिए ऊपर पुनर्गठित करने के लिए पर्याप्त है. सीओ 2 के साथ इच्छामृत्यु के बाद, हिंद अंग हटाने और फिर से त्वचा और हड्डियों और मांसपेशियों को हटायें.
- प्रत्येक हड्डी के बंद के अंत कट और यह पीबीएस (या RPMI) के साथ फ्लश या उन्हें एक मोर्टार में सभी को कुचलने, एक पैर का उपयोग, पीबीएस (या RPMI) के 2 मिलीलीटर के साथ बी.एम. हटायें.
- जोरदार आकांक्षा उसी के repetitions के द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन में बी.एम. संरचना बाधितएक P1000 विंदुक एनजी. वैकल्पिक रूप से, आप भी एक 21G सिरिंज सुई भर बी.एम. कई बार पारित कर सकते हैं. अपकेंद्रित्र (400g, 5 मिनट, आर टी), पीबीएस में कोशिकाओं फिर से स्थगित करता है, और अपने नग्न विकिरणित प्राप्तकर्ताओं में नसों इंजेक्षन. हमारे प्रयोगों में हम Foxp3 की GFP / GFP चूहों जहां सभी विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) व्यक्त GFP 1 से बी.एम. इस्तेमाल किया.
- दाता बी.एम. की स्वीकृति स्थानांतरण के बाद पहले दिन में होता है, के बाद से गैर बी.एम. पुनर्गठन पशुओं की अधिक से अधिक 14 दिनों के जीवित नहीं रह सकते. हालांकि, एक 4 से 6 सप्ताह के लिए प्रतीक्षा करने के लिए बी.एम. सभी डिब्बों की पूरी तरह से वसूली की अनुमति चाहिए. Bactrim (Roche) विकिरण के बाद पहले सप्ताह के दौरान पानी (2 मिलीग्राम / एमएल) के लिए जोड़ा गया है जीवाणु संक्रमण के जोखिम को कम.
- भ्रूण थाइमस प्रत्यारोपण पहले से ही 2 में वर्णित किया गया. संक्षेप में, isogenic चूहों के जोड़े प्रजनन शुरू और (सहवास के सबूत) हर दिन plugging की जांच करने के लिए. उन्हें अलग खामियों को दूर महिलाओं और सीओ pregn के 15 दिन 2 euthanizeएंसि (प्लग का अवलोकन गर्भावस्था के एक दिन है). भ्रूण और thymuses निकालें. स्थानांतरण जब तक ठंड पीबीएस में भ्रूण thymuses रखें.
- Thymuses प्रत्यारोपण, anesthetize ketamin (120 μg / माउस के वजन के छ) / (16 / माउस वजन के μg छ) xylazine साथ बी.एम. प्राप्तकर्ता नग्न चूहों प्रदर्शन और उन्हें एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर 37 डिग्री सेल्सियस जब तक वे मिल रखना बेहोश है.
- शल्य चिकित्सा गुर्दे बेनकाब thymuses का प्रत्यारोपण प्रदर्शन. पहले ChloraPrep (CareFusion इंक) और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा साफ़. फिर, 1 वापस पार्श्व जानवर के शरीर के अंग, 2 मिमी bellow पिछले वक्ष रिब की त्वचा पर कटौती सेमी बनाते हैं.
- Peritoneal गुहा कट और इस गुहा के बाहर खींच गुर्दे. गुर्दे कैप्सूल में एक स्केलपेल ब्लेड के साथ एक छोटा सा सतही कटौती करें. एक बहुत पतली टिप के साथ संदंश का प्रयोग प्राप्तकर्ता माउस के गुर्दे कैप्सूल के नीचे एक थैली बनाने और इस थैली में 4 thymic lobes को जोड़ने.
- गुर्दे ख रखो ack अपनी जगह के लिए, एक या दो टांके के साथ peritoneal गुहा सीवन, और तब बंद माउस त्वचा वही सिवनी पद्धति का उपयोग करके. वैकल्पिक रूप से, sutures शल्य चिकित्सा गोंद का उपयोग किया जा सकता है है.
- एनाल्जेसिक (Butorphanol 5 मिलीग्राम / किग्रा) सही subcutaneously सर्जरी खत्म करने के लिए जानवर दर्द से बचने और एक हीटिंग पैड में पशुओं को रखना जब तक वे संज्ञाहरण से उबरने के लिए शुरू करने के बाद सुई. चूहे व्यक्तिगत प्रत्यारोपण के बाद पहले 3 दिनों के लिए टाँके हटाने से पिंजरे साथी को रोकने के लिए बंदी हैं. 1 सप्ताह के बाद टांके निकालें.
- नग्न चूहों टी कोशिकाओं नहीं है. इसलिए, आप + या रक्त में सीडी 4 CD8 + टी कोशिकाओं के प्रतिशत की निगरानी के द्वारा थाइमस भ्रष्टाचार स्वीकृति का मूल्यांकन कर सकते हैं. प्रति सप्ताह एक बार, थाइमस प्रत्यारोपण के बाद 2 सप्ताह, जानवरों के खून और विरोधी CD4 और विरोधी CD8 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (Mabs) के साथ खून दाग. जब सीडी 4: CD8 अनुपात 2:01 लगभग है, प्रतिरोपित थाइमस पूरी तरह कार्यात्मक (चित्रा 1) है.
सभी सामग्री आप अग्रिम में की जरूरत है और उन्हें डाल अलग तैयार करें.
- Ketamin / xylazine (1.5 आइटम वर्णित एक ही खुराक) के साथ पशुओं anesthetize और 37 में उन्हें एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर जगह डिग्री सेल्सियस Rhodamine B (20 मिग्रा / पीबीएस में मिलीलीटर) आइसोथियोसाइनेट Dextran नसों के 100 μl इंजेक्षन करने के लिए रक्त के प्रवाह के भविष्य दृश्य की अनुमति है.
- पहले आइटम 1.6 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिरोपित थाइमस युक्त गुर्दे बेनकाब.
- अपनी मूल स्थिति में लौटने से गुर्दे को रोकने के लिए, टांके के साथ त्वचा चीरा के पार्श्व पक्षों बंद.
- यह नम रखने के लिए अंग के शीर्ष पर पीबीएस - लथपथ कपास का एक टुकड़ा रखें.
- हीटिंग पैड जानवर धारक मंच (2A चित्रा) के शीर्ष पर रखो.
- पशु पशु धारक, अंग (चित्रा 2B) में हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखो.
- दोनों पक्षों पर एक क्लैंप मीटर के साथ अंग चुटकीपतली एल्यूमीनियम पन्नी (चित्रा 2C) की ade.
- पशु धारक बंद और शीर्ष हीटर के रूप में के रूप में अपने ऊतक (चित्रा 2 डी) के लिए करीब संभव जांच जगह है. यह हीटर जांच लगातार अंग तापमान उपायों और हीटर के लिए इस जानकारी को भेजता है बिजली के वर्तमान को समायोजित करने के लिए, यह 37 पर रख डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस - लथपथ कपास निकालें और कम पिघलने agarose (पीबीएस में 2%) में 30 डिग्री सेल्सियस अपनी तैयारी के शीर्ष पर जोड़ने.
- शीर्ष हीटर (चित्रा 2 ई) के साथ पूरी तैयारी कवर. इस हीटर पर एपर्चर में वहाँ एक उद्देश्य (चित्रा 2 एफ) से agarose अलग coverglass है. माउस संज्ञाहरण मॉनिटर और एक आधा खुराक को बढ़ावा देने हर 40 मिनट इंजेक्षन. छवि अधिग्रहण के बाद, सीओ 2 के साथ जानवरों euthanize.
नोट: एल्यूमीनियम पन्नी क्लिप और शीर्ष हीटर की तस्वीरें चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं.
3. दो photon इमेजिंग अधिग्रहण
हम एक ईमानदार "प्रेयरी चरम XY" दो photon माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया. हमारी प्रणाली एक तिवारी के साथ सुसज्जित है: नीलम लेजर, एक साथ 4 चैनल अधिग्रहण के लिए चार शीर्ष PMTs और एक 20x पानी विसर्जन उद्देश्य.
- तिवारी पर मुड़ें: नीलम लेजर और पूरे खुर्दबीन प्रणाली.
- वांछित तरंगदैर्य के अनुसार dichroic दर्पण और फिल्टर सेट जोड़ें. हमारे मामले में हम एक ओलिंप-BX2 Chroma एक 565 एनएम dichroic दर्पण युक्त धारक, एक 525/50 एनएम (Foxp3 GFP संकेत के लिए) फिल्टर, और एक 595/50 एनएम फिल्टर (रक्त वाहिकाओं के अंदर संकेत Dextran rhodamine-B के लिए इस्तेमाल किया ). लेजर तरंग दैर्ध्य रेंज इस्तेमाल किया 880 900 एनएम के बीच किया गया था.
- खुर्दबीन जानवर धारक जोड़ें कनेक्ट और सभी heaters पर बारी, शीर्ष हीटर एपर्चर पर पानी जोड़ने के लिए, पानी में ध्यान से कम उद्देश्य, और एक पोत या कुछ GFP-Tregs पर ध्यान केंद्रित.
- खुर्दबीन एक्स के साथ, y, z बाह्य नियंत्रण, जल्दी ऊतक का सर्वेक्षण करने के लिए एक क्षेत्र का पता लगाने ब्याज की.
- PMTs पर हासिल करने के लिए रंग जुदाई अनुकूलन और पृष्ठभूमि पर पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक लेजर के मात्रा को कम समायोजित करें. लेजर की न्यूनतम राशि का उपयोग करने के लिए अपने ऊतक की तस्वीर क्षति से बचने की कोशिश करो.
- एक बार हितों के क्षेत्र में स्थित है, समय चूक इमेजिंग शुरू करते हैं. हमारे मामले में, एक ठेठ 5D (एक्स, y, z, टी, और रंग) के अधिग्रहण प्रोटोकॉल एक 50 ऊतक सुक्ष्ममापी गहराई मात्रा के अनुक्रमिक छवियों, 4.0 z-कदम एक्स, और 140 सुक्ष्ममापी के y लंबाई सुक्ष्ममापी में विभाजित प्राप्त होते प्रत्येक. प्रत्येक मात्रा लगभग 30 सेकंड का अधिग्रहण हो लेता है. इसलिए, 60 अधिग्रहण छवि अधिग्रहण के 30 मिनट के आसपास प्रदर्शन करेंगे.
- संस्थागत सर्वर से डेटा स्थानांतरण और ImageJ, Imaris, या Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए बहु आयामी प्रतिपादन और सेल ट्रैकिंग प्रदर्शन.
4. प्रतिनिधि परिणाम
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चित्रा 1. भ्रूण थाइमस स्वीकृति और समारोह बी.एम. को पुनर्प्राप्त करने के बाद, भ्रूण thymuses बी.एम. पुनर्गठन पशुओं के लिए प्रत्यारोपित किया गया, थाइमस प्रत्यारोपण के बाद दो सप्ताह, इन चूहों प्रति सप्ताह एक बार लहूलुहान थे विरोधी सीडी 4 या विरोधी CD8 के साथ धुंधला टी सेल subtypes के प्रतिशत की निगरानी Mabs. हम माना जाता है thymus सफलतापूर्वक एक सीडी 4 के साथ पशुओं में स्वीकार किया गया था: 1.5-2.0:1 आसपास CD8 अनुपात (ए). अपनी कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए, हम कुछ थाइमस प्रतिरोपित पशुओं का बलिदान और WT चूहों (बी) के साथ विभिन्न thymocyte subpopulations के प्रतिशत की तुलना में. subpopulations (विरोधी CD25 और विरोधी CD44 Mabs के साथ धुंधला से), (डी पी, सीडी 4 सीडी 8 + thymocytes +) डबल - सकारात्मक (- CD8 thymocytes CD4 डी.एन.) और एक सकारात्मक CD4 (सपा) डबल नकारात्मक का प्रतिशत + या सीडी 8 + thymocytes इन जानवरों के बीच समान थे .
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चित्रा 2. पशु धारक विधानसभा गहरा anesthetized के बाद, जानवर एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर डाल दिया है, पहले पशु धारक मंच (ए) के शीर्ष पर घुड़सवार. प्रतिरोपित गुर्दे युक्त थाइमस (बी) का सामना करना पड़ रहा है. एक एल्यूमीनियम पन्नी बंद करना नाजुक पूरे गुर्दे (सी) यह जगह में रखने pinches. चित्र 1C डालने में विस्तार से क्लैंप से पता चलता है. जानवर धारक के शीर्ष भाग जगह (डी) में डाल दिया है. पीबीएस - लथपथ कपास अंग के शीर्ष गर्म कम पिघलने agarose द्वारा प्रतिस्थापित से निकाल दिया जाता है, और शीर्ष हीटर (ई) जोड़ा जाता है. अंत में, पूरे विधानसभा खुर्दबीन के लिए स्थानांतरित कर रहा है, यहाँ उद्देश्य (एफ) द्वारा प्रतिनिधित्व किया.
चित्रा 3. धारक भागों का विवरण इन चित्रों एल्यूमीनियम पन्नी क्लैंप (ए) (बी) गुर्दे पकड़े दिखा. भी क्षेत्र में, जहां प्रतिरोपित थाइमस स्थित है नोट. यह लगभग क्षेत्र इंगित करता हैथाइमस कैप्सूल में कटौती और जेब बनाने के लिए भ्रूण थाइमस डाल. शीर्ष हीटर coverglass (सी) सिलिकॉन गोंद के साथ अपने नीचे के भाग (डी) के लिए तय किया गया था.
1 मूवी Foxp3 - GFP थाइमस जहाँ oxygenation और तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) के शारीरिक स्तर पूरी प्रक्रिया के दौरान रखा गया था + thymocytes अंदर की intravital इमेजिंग. रक्त और Tregs के आंदोलन के प्रवाह पर ध्यान दें. ये गति और मापा जा सकता है प्रकाशित आंकड़ों के साथ तुलना फिल्म को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 2. Intravital जहां छवियों 30 में हासिल किया गया एक thymus अंदर Tregs इमेजिंग डिग्री सेल्सियस नोट रक्त के प्रवाह के रखरखाव के बावजूद आंदोलन और कोशिकाओं के गोल आकार के अभाव फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस पत्र में हम एक जीवित जानवरों के अंदर thymocytes के दो photon इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया. हम भी कुछ पैरामीटर है कि एक सावधानी से नियंत्रण चाहिए जैसे रक्त के प्रवाह की निरंतरता और इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान अंग तापमान के रखरखाव, वर्णित है. बहरहाल, सावधान अंग को स्थिर रखने के प्रयासों के बावजूद, "अंग बहती" के रूप में गति कलाकृतियों हो सकता है. पोस्टीरियर छवि सुधार विशेष रूप से इस प्रयोजन के लिए डिजाइन एल्गोरिदम के विकास के द्वारा किया जा सकता है. इसके अलावा छवि विश्लेषण भी नए प्रोटोकॉल के विकास का स्रोत है जो त्रुटियों को कम करना चाहता है हो सकता है.
थाइमस जहां सभी टी कोशिकाओं का उत्पादन कर रहे हैं, इसलिए अंग है, यह अंग जहां प्रतिरक्षाविज्ञानी γδ की पीढ़ी को समझने में दिलचस्पी है, CD4, या CD8 टी कोशिकाओं अपना ध्यान केंद्रित करेंगे. सबसे टी कोशिकाओं के विषय में अध्ययन की संख्या में मतभेद और / या इन ग के स्थिरता पर आधारित हैं/ इन विट्रो में vivo में जोड़तोड़ में विभिन्न बाद ells. हालाँकि, केवल में vivo दृश्य के बाद हम 3-7 homeostasis को बनाए रखने में शामिल प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं के बीच बातचीत का पालन सकता है. इसलिए, thymocytes के vivo अवलोकन में शायद एक सबसे महत्वपूर्ण लापता जानकारी के लिए बेहतर टी कोशिका जीव विज्ञान को समझने की . Intravital TPM टी सेल आंदोलनों और बातचीत का एक विस्तृत चित्र प्रदान करता है और हम यहाँ का प्रदर्शन कैसे यह विस्तृत thymocyte अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हर तकनीक की अपनी सीमाएं है. जबकि intravital इमेजिंग अधिग्रहण शरीर के अंदर की कोशिकाओं के व्यवहार को दर्शाती के लिए सबसे सही प्रणाली है, यह भी सच है कि अंगों की छवि अधिग्रहण explanted कम श्रमसाध्य है और प्रतिरक्षा प्रणाली 8,9 के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी एकत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, एक इनकार नहीं कर सकता intravital तरीकों इमेजिंग सर्जरी की आवश्यकता anesthetized पशुओं में ऊतकों और रक्त वाहिकाओं का पर्दाफाश,से प्रति जो पूरे अंग फिजियोलॉजी 10 में एक परिवर्तन का कारण बन सकता है. फिर भी, वहाँ गैर invasively तरीकों कि शल्य चिकित्सा प्रक्रिया 11 और नए तरीकों की वजह से कलाकृतियों को समाप्त कर रहे हैं विकसित किया जा रहा हैं कि बेहतर अग्रिम में तैयार 12 इस्तेमाल किया जा पशुओं. इसलिए, नए शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं और tolls या कम से कम intravital इमेजिंग अधिग्रहण के वास्तविक सीमाओं बाईपास होगा और अधिक से अधिक वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ हो.
हमने दिखा दिया है कि हम विधि वर्णित है संभव है और यह vivo में प्रणालीगत जोड़तोड़, ऐसी दवा प्रशासन में सभी रिपोर्टों, कि हम इस्तेमाल किया है. इस प्रकार, हम इस पद्धति का उपयोग के साथ पूर्व vivo पहले से ही उपलब्ध तकनीक के साथ क्रम में करने के लिए पूरक हैं और आगे thymocytes विकास के विषय में अध्ययन को मजबूत सुझाव है.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा, डा. Nuno मोरेनो के लिए रसद Foxp3 की GFP / GFP की तरह के दान के लिए हमारे पशु धारक और हीटिंग पैड और डॉ. विजय कुमार Kuchroo बनाने में मदद के लिए धन्यवाद डॉ. डेविड Olivieri करना चाहते हैं चूहों. यह काम "Fundação पैरा Ciência ई TECNOLOGIA" (FCT, पुर्तगाल), अनुदान PTDC/EBB-BIO/115514/2009 # द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
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