Summary
En hurtig måde at gennemføre immunfarvning af zebrafisk embryonale hjerte er beskrevet. Sammenlignet med hele montere immunfarvning tilgang, dramatisk denne metode øger penetration af de antistoffer, der gør det muligt at få billeder i høj opløsning, der afslører cellulære / subcellulære strukturer i hjertet inden for en meget reduceret behandlingstid.
Abstract
Zebrafisk foster bliver et populært in vivo hvirveldyr model for at studere hjertets udvikling og menneskelig hjertesygdomme på grund af sin fordelagtige embryologi og genetik 1,2. Omkring 100-200 embryoner, som er let tilgængelige hver uge fra et enkelt par af voksne fisk. Den gennemsigtige embryoner, der udvikler ex utero gør dem ideelle til at vurdere hjerte defekter 3. Udtrykket af genet kan manipuleres via morpholino teknologi eller RNA injektion 4. Desuden frem genetiske skærme har allerede genereret en liste over mutanter, der påvirker forskellige perspektiver af cardiogenesis 5.
Hele mount immunfarvning er en vigtig teknik i denne dyremodel til at afsløre udtryk mønster af de målrettede protein til et bestemt væv 6. Imidlertid har billeder i høj opløsning, der kan afsløre cellulære eller subcellulære strukturer været vanskeligt, hovedsagelig på grund af fysiske Statusmeddelelseion af hjertet og de fattige penetration af antistoffer.
Her præsenterer vi en metode til at imødegå disse flaskehalse ved at dissekere hjerte først og derefter gennemføre farvningen processen på overfladen af et objektglas. For at forhindre tab af lille hjerte prøver og for at lette løsning håndtering, vi begrænset hjertet prøverne inden for en cirkel på overfladen af de objektglas trukket af en immEdge pen. Efter farvning, kan fluorescens signaler direkte iagttages af en sammensat mikroskop.
Vores nye metode forbedrer indtrængningen for antistoffer, da et hjerte fra en embryonale fisk kun består af nogle få cellelag. Billeder i høj kvalitet fra intakte hjerter kan opnås inden for en meget reduceret procession tid til zebrafisk embryoner i alderen fra dag 2 til 6 dage. Vores metode kan potentielt udvides til pletten andre organer dissekeret fra enten zebrafisk eller andre små dyr.
Protocol
1. Udarbejdelse af dias og befugtes kammer
- Den befugtet kammer kan foretages fra en kasse, såsom en tømt tip boks. Wrap både kammer og dækslet med aluminiumsfolie for at beskytte prøver fra lys.
- Inde i kammeret, sætte en bunke våde papirservietter til at opretholde fugtigheden i kammeret, hvilket vil forhindre hjertet prøver fra tørring. Indstil en lille mikroplade på toppen af køkkenrulle som et rack til dias.
- Tegn enten linjer eller cirkler på overfladen af et objektglas ved hjælp af immEdge pennen for at gøre brønde til hjerte prøver med en dimension ca 5x5 mm. Lad objektglassene tørre.
- Sæt dias i befugtet kammeret og tilføje 50ul frisk 4% formaldehyd i hver brønd.
2. Dissektion af embryonale hjerte
- Bedøver fiskene foster i E3 æg vand 7. indeholdende 0,4% tricaine i omkring 1 minut, indtil fisken stopper kroppens bevægelse, men stadig har normal hjerterytmeat slå.
- Put en konkav objektglas på scenen af en dissektion mikroskop. Overfør embryoner til konkav godt.
- Juster lyset kombination af dissektionsmikroskop til klart at afsløre hjertet. Afhængig af personlige præferencer, kan det enten være mørkt felt eller DIC-lignende polariseret lys tilstand.
- Rens to insulin sprøjter med 75% ethanol, og derefter tørre.
- Juster dissektion mikroskop til højere forstørrelse og fokus på hjertet. Fysisk at fastlåse et foster ved at stikke en nål spidsen ind i blommen-somite grænsen tæt ind til hovedet. Indsæt en anden kanyle tæt på hjertet regionen og trække hjertet hurtigt ud. Hvis hjertet ikke er helt adskilt fra det embryon, afbrød tilbageværende tilsluttede væv mellem hjertet og æggeblomme.
- Juster mikroskop til lavere forstørrelse og fokusere på de adskilte hjertet. Brug en 10μl pipetteman og indstil den til 1μl volumen. Anvend spidsen af pipetteman til enten tegne eller røre vedhjerte prøve, således at den isolerede hjerte vil enten være inden for eller knyttet til overfladen af spidsen.
- Dyp pipettespidsen i 4% formaldehyd løsning på forberedt dias og trykke pipetten stempel til at frigive hjertet ind i løsningen. Spændingen i vandoverfladen hjælper også med til at frigøre hjertet fra pipettespidsen til løsningen. Put mindre end 3 hjerter i hver brønd.
3. Immunfarvning
- Luk kammeret og læg den på en shaker med et blidt vuggende bevægelse. Fix hjertet prøven i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Tør vandet på bagsiden af dias og sætte dias på scenen af en dissektion mikroskop for buffer udveksling.
- Dyp tip fra en 10μl pipetteman ind i en tom region i hver brønd og holde spidsen så langt som muligt fra hjertet prøver. Tag forholdsregler for at undgå hjerte er knyttet til spidsen, da hjerter kan bevæge sig med vandstrømmen, når løsningen er trukket ind i spidsen. Skiftspidsen lokalisering, hvis det er nødvendigt.
- Aflever løsningen på en væv og undgå fremstilling af enhver bobler i spidsen, da hjertet prøven let går tabt under tilstedeværelse af luftbobler. At holde hjertet prøver delvist tør for en kort tid kan hjælpe hjerter være tilsluttet til dias.
- Tilføj 50μl PBST til at dække hjertet prøve og inkuber i befugtet kammeret i en langsom vuggende bevægelse i 5 min. Gentag skylles en ekstra gang. Efter dette trin, kan hjertet prøver opbevares i befugtet kammer op til 1 uge ved 4 ° C.
- Bloker hjertet prøven med 10% får serum i PBST i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubér hjertet prøve med primære antistoffer, såsom 1:200 fortynding af β-catenin antistof og 1:200 fortynding af mef2 specifikt antistof, i 10% får serum / PBST i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask hjertet prøven med PBST tre gange (5 min. Hver) ved stuetemperatur.
- Prøven inkuberes med sekundæreantistoffer, såsom 1:1000 fortynding af Alexa-mærkede anti-mus og / eller anti-kanin antistoffer i PBST for 0,5 time.
- Vask hjerte prøver med PBST tre gange (5 min. Hver) ved stuetemperatur.
4. Imaging
- Fjern PBST og tilsæt 10 μl Mounting Medium til hver brønd. Rock kammeret i flere minutter, indtil opløsningen bliver klar.
- Fjern det meste af Mounting Medium og dækker alle de brønde i et dias med et mikroskop dække glas (24x50).
- Billede fisk hjerte ved hjælp af Zeiss Axioplan 2 mikroskop udstyret med ApoTome (Carl Zeiss).
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på et billede, der afslører membran og kerner af alle zebrafisk cardiomyocytter er vist i Fig. 1. mef2c og β-catenin antistoffer blev brugt sammen til at farve hjertet prøver dissekeret fra 52 HPF zebrafisk foster. Mens mef2c antistof pletter kerner af cardiomyocytter, β-cateninantistof afslører kanten af hver celle 8-10. Ved at justere den fase af den sammensatte mikroskop, kan billeder af hjertet prøverne korrigeret til samme orientering, hvilket vil gøre det muligt observation af ydre krumning og indre krumning i hjertet 11. Det samlede cardiomyocyte antal, cardiomyocyte cellestørrelse, og rundhed kan derefter måles.
Et andet eksempel, som afslører sarcomeric strukturen i en embryonale hjerte er vist i Fig. 2. Vi udførte immunfarvning bruger F59, en myosin antistof, i en dissekeret embryonale hjerte. Den myofibril netværk i en hel embryonale hjerte kan tydeligt afsløret ved lavere forstørrelse, mens den tværstribede bånd af tykke filamenter kan afsløres ved højere forstørrelse (Fig 2) 6.
Figur 1. Immunfarvning af mef2 (rød) og β-catenin (grøn) for at vise kerner og outlInes af cardiomyocytter i en zebrafisk ventrikel. Skala bar = 10μm
Figur 2. Immnostaining af myosin at vise den tykke glødetråden i en zebrafisk ventrikel ved enten lav forstørrelse (A) eller høj forstørrelse (B). Skalalinjen = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med klassiske hele montere immunfarvning metoder, har vores metode følgende fordele. For det første kan meget stærkere fluorescerende signaler være konsistent som følge af forbedret penetration. I hele mount immunfarvning metode, hvilket er betydeligt den tætte hud væv omkring hjertet reduceret udbredelsen af mange antistoffer, hvilket resulterer i en høj baggrund i hele kroppen. Dette problem er især alvorlig for embryoner ældre end 3-dages post-befrugtning (DPF). I modsætning hertil kun dissekerede hjerter bestå af nogle få cellelag, der gør meget bedre gennemtrængning. For det andet på grund af den meget forbedrede penetration, kan hele processen med at immunfarvning blive reduceret fra 1 dag til bare flere timer. Vi har med succes reduceret inkubationstid fra 1 time til 30 minutter for nogle antistoffer, såsom Actinin, Integin-linked-kinase (ilk), og β-catenin specifikke antistoffer. For det tredje, billeder i høj opløsning konsekvent kan fås fra intakte hjerterat afsløre cellulære / subcellulære information. På grund af lokaliseringen af hjertet inde i perikardial sæk som ligger ved siden af blommesækken, kan højere forstørrelse objektivlinser ikke anvendes til billede intakt embryoner. Derfor vil hjertet skal dissekeres, hvis billeder af et intakt hjerte er nødvendige. Men rengøringsmidler såsom Triton-X-100, der bruges til at forbedre penetration i hele montere farvningsproceduren svække embryoner. Som følge heraf er hjerter let ødelagt under dissektion procedure. I modsætning hertil er en levende hjerte meget stærkere, som let kan adskilles fra tilgrænsende væv. Derfor er intakte morfologi lettere opretholdes ved hjælp af den foreslåede metode. Selvom dissekere en lille zebrafisk hjerte kan virke udfordrende, kan de fleste mennesker let kan gennemføre denne procedure efter flere praksis.
Vi har brugt denne metode til at farve hjerter i alderen fra 2 DPF til 6 DPF. På grund af sin fysiske placering, hjerter fra selv jarlIER iscenesat embryoner er vanskelige at dissekere. Det er endnu ikke afgøres, om denne metode kan justeres til larve eller voksen hjerter. Det er værd at påpege, at lokale skader på hjertet kan opstå under dissektion proces, som involverer fysisk magt. Denne komplikation kan overvindes ved at vurdere flere hjerter, og derefter vælge billeder med ensartede resultater og de bedst vedligeholdte morfologi.
På grund af stærkt forbedret opløsning, kan denne metode bruges til at afsløre både cellulære og subcellulære strukturer i et udviklingsland zebrafisk hjerte. For eksempel har vi allerede anvendt denne metode til at tælle antallet af cardiomyocytter, at kvantificere de enkelte cardiomyocyte størrelse, for at vurdere spredning og apoptose, og at afsløre processen med sarkomeret forsamling 6,12. Sammen med unikke genetiske værktøjer i zebrafisk, vil den nuværende metode lette undersøgelsen af hjerte-kar-biologi i denne in vivo model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Beninio Jomok for hans hjælp i zebrafisk dyrehold. Dette arbejde er finansieret af NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
