Summary
Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.
Abstract
Mekanik güçlerin üretme ve algılama kanser metastazı 1, aterogenez 2 ve 3 yara iyileşmesi ile doğrudan ilgili olan, hücre fizyolojisi her yerde görülen bir yönüdür. Bu örneklerin her birinde, hücreler çevreleri üzerinde kuvvet uygularlar ve aynı enzimatik remodel ekstraselüler matriks (ECM) hem de. ECM kuvvetlerin etkisi böylece 4-7 büyük olasılıkla onun biyolojik ve tıbbi önemi nedeniyle önemli bir ilgi alanı haline gelmiştir.
Gibi optik tuzaklama 8, atomik kuvvet mikroskobu 9, ve manyetik cımbız 10,11 olarak tek bir molekülün teknikleri araştırmacılar bireysel proteinler üzerinde kuvvetleri uygulayarak moleküler düzeyde enzim fonksiyonu soruşturma için izin. Bu tekniklerin, manyetik cımbız (MT) Düşük maliyet ve yüksek verimlilik için dikkat çekicidir. MT ~ 1-100 pN aralığında kuvvetleri uygulamak ve milisaniye zamansal çözünürlük sağlayabilir,ayrıca tek moleküllü seviyesi 12 az enzim mekanizmasının çalışma eşleştirilir nitelikleri. Burada tek bir protein moleküllerinin proteoliz tarihinde yürürlüğe etkisini incelemek için son derece parallelizable MT tahlil raporu. Bu matris metalloproteinaz 1 (MMP-1) tarafından bir trimeric kolajen peptid proteolizin spesifik bir örnek sunmak; Bununla birlikte, bu tahlilde kolayca diğer substratlar ve proteazlar incelemek için adapte edilebilir.
Protocol
1. Akış Hücre Hazırlık
- Lamelleri (# 1.5, 22x22 mm ve 22x40 mm, VWR) sonication kullanılarak temizlenir.
- Lamelleri tutarak ve (bkz: adım 2) sonikatör uyum gösterme yeteneğine sahip küçük bir cam kaba lamelleri ekleyin.
- Izopropanol ile kabın doldurmak ve 20 dakika boyunca bir banyo içinde sonikatör ses dalgalarına maruz.
- Izopropanol atın ve bir Barnsted MilliQ aparatı veya benzer bir cihaz tarafından üretilen deiyonize bol su ile lamelleri durulayın. Su kabı doldurun ve 20 dakika boyunca ses dalgalarına maruz.
- Sonikasyon sonra, filtrelenmiş ve tozsuz bir hava akımı içinde lamelleri kurutun. (Yani hiçbir leke) temiz görünen sadece lamelleri kullanın.
- Yavaşça alev birkaç saniye lamelleri kalan toz ve nem onları temizlemek için: aşırı ısı nedeniyle coverslip çarpıtmak için özen, bir Bunsen beki ile üretilen bir gaz alevi ile lamelleri geçmektedir. Bu adım artık yüzeyi temizlerkirleticiler.
- Çift taraflı seloteyip kullanarak, iki arada lamelleri takın. Bantı kesiniz ~ uzunluğu 3 cm, genişliği 0,3 cm. Ortasında 1.6 cm kanalı terk 22x40 mm coverslip üzerindeki bandı takın. Yavaşça bant yapıştırılır düzgün emin olmak için coverslip basmaya bir pipet kullanın.
2. Manyetik Cımbızlar Kurulum ve Kalibrasyon
- Manyetik cımbız 10,12 önceden açıklandığı gibi kalıcı nadir toprak mıknatıslar kullanarak kurulum vardı. Bir alüminyum L-braketi, 1 mm çapında iğne deliği ile inşa ve dik bir z-çevirmen (Thorlabs) cımbız yüksekliği modüle etmek için monte edildi. İki kalıcı nadir toprak mıknatıslar manyetik tuzak (Şekil 1) oluşturmak için iğne deliği her iki tarafında üzerinde dirsek bağlanmıştır.
- DNA hazırlığı: 5 've 3' olarak etiketlenmiş lambda faj DNA biotin ve digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) ile bitiyorsa, mag kalibre etmek için kullanılanmanyetik cımbız.
- 10 dakika boyunca 60 ° konjuge oligonükleotid ve ısı ° C biyotin 40 nM olan, 2 ul 4 nM λ-DNA 50 uL karıştırılır. 1 saatten fazla oda sıcaklığında Sonra yavaş yavaş serin.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA ligazı ekleyin ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında ligate.
- 45 dakika boyunca oda sıcaklığında 400 nM digoxigenin konjuge oligonükleotid ve inkübe 2 uL ekleyin.
- 10 mM ATP 1,5 uL ekleyin ve 3 saat boyunca λ-DNA digoxigenin konjuge oligonükleotid ligasyonu devam etmektedir.
- 100 kDa dönüş filtreleri (Microcon UltraCell YM-100) ile aşırı oligonükleotidler ve DNA ligaz çıkarın. TE tamponunda 1000 kat tampon değişimi toplam aşırı oligos kaldırmak için yeterlidir. Not: DNA kesme yol açacaktır çünkü dönüş hızları> 500xG kullanmak önemlidir.
- Bu DNA i sağlamak için bir% 0.7 agaroz jel üzerinde elektroforez yoluyla DNA'nın bir numune incelemeks doğallığından veya makaslanmış değil.
- DNA konsantrasyonu ölçün. Uygun numune hacmi çok küçük olabilir, çünkü bir Nanodrop UV-Vis spektrometre (Thermo Scientific) kullanılması önerilir.
- 1. bölümde tarif edildiği gibi akış hücreleri hazırla.
- Akış hücresi için DNA eki için, anti-digoxigenin antikor ekleyin (koyun IgG; 1 mg mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Almanya) ve 15 dakika boyunca cam yüzeye yapışma sağlar.
- 1x PBS içinde 2 mL -1 mg BSA,% 0.1 Tween-20 ekleyerek DNA spesifik olmayan yapışmasını önlemek için akış hücresi yüzeyinde dinginleştirmek. 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Adım 2.5 tekrarlayın.
- Λ-DNA fuctionalized 50 pM ekleyin ve 15 dakika coverslip eklemek için izin verir.
- 1x PBS ile aşırı DNA silsin.
- 2,8 um boncuklar = 20 ug mL -1; streptavidin kaplı boncukların süperparamanyetik (1 um boncuklar = 2 ug mL -1 ekleme
- 1x PBS ile aşırı boncuk silsin.
- Manyetik Cımbızlar Kalibrasyon
- Uzağa Örnek yüzey (> 15 mm) olduğu bir konuma hareket ettirmek daimi mıknatıslar.
- Mikroskopta hazırlanan akış hücresi yerleştirin.
- Akış hücresi üzerindeki pozisyona daimi mıknatıslar taşıyın.
- Uzaklıkta cam yüzeyler hem boncuklar odaklanarak λ DNA fonksiyonlandırılmış boncuk odak düzlemi seçin. Doğru odak düzlemine istenilen boncuk parlak bir merkeze sahip olduğu biridir.
- 500 kare için 80 Hz veya daha az boncuk hareket bir video çekin.
- Yakın Örnek yüzeyine mıknatıs hareket eder. 5 mm aşan mesafeler için 1 mm artışlarla taşımak. 1 ve 5 mm arasındaki mesafeler için 0.5 mm artışlarla taşımak. 1 mm'den daha az mesafeler için 0,25 mm artışlarla taşımak.
- Her yeni cazibe konumunda adımları 2.11.5 ve 2.11.6 tekrarlayın.
- Her bir veri içinayarlamak, 2B Gauss uyum kullanarak boncuk merkezi izleyebilirsiniz.
- Kullanarak Brownian dalgalanmalar yoluyla gücü hesaplayın:
k B T Boltzmann termal enerji burada, L λ-DNA'nın uzunluğu, <X 2> sentroid pozisyonu içinde varyans.- Rolloff frekansını bulmak için bir güç spektrumu Lorentz oturması ile kuvvet hesabı kontrol ederek güçleri doğruluğunu onaylayın. Uygulanan kuvvet ile ilişkili rolloff frekansı ile ilgilidir:
F 0 rolloff frekansı olduğu, bir boncuk yarıçapı, ve μ akışkan viskozitesi 12'dir.
3. Akış Hücreler Kolajen Peptid Eklenti
Bizim metodoloji uygulanması için somut bir örnek vermek için, biz bir trimeric kollajen modeli peptid proteoliz karakterize laboratuvarımızda son çalışmalarını açıklamak. Biz bu genel yaklaşımın genel olarak diğer proteinlerin ve polinükleotidler uygulanabilir tahmin ediyoruz.
- Kollajen modeli peptid üçlü sarmal oluşumunu zorlamak için 10 5x myc etiketi, (GPP), kollajen takip arınma, bir N-terminal 6x His-tag oluşur oluşturan α1 artıkları 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), MMP- 1 tanıma sitesinin, foldon sekansı (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ve bir C-terminali KKCK biyotin-maleimid ile etiketlenmesi kolaylaştırmak için. Foldon T4 faj protein fibritin türemiştir ve N ya da erimiş zaman kolajen modeli trimerler stabilize - ya da C-terminali 13,14.
- Daha önce tarif edildiği gibi 4,15 kolajen peptid ve MMP-1 proteinleri ifade edilmiş ve saflaştırılmış edildi. </ Li>
- Anti-myc akış hücresi yüzeyinde bağlanmasını sağlamak için anti-myc (15 ug mL -1) 20 dakika oda sıcaklığında inkübe akış hücresi ve eklemek.
- Adım 2,5 tarif edildiği gibi aynı şekilde 5 mg mL -1 BSA kullanılarak proteinlerin spesifik olmayan bağlanma önlemek için akış hücresi dinginleştirmek.
- 150 pM kolajen peptid ekleyin ve 45 dakika myc etiketi aracılığıyla antikor eklemek için izin verir.
- PBS tamponu kullanarak fazla kolajen silsin.
- Streptavidin kaplı süperparamanyetik boncuk (1 mikron boncuklar = 2 mg mL-1 ve 2.8 mikron boncuk = 20 mg mL-1) ve onlara 45 dakika boyunca kollajen moleküllerine eklemek izin. Ekle 1 um boncuklar PBS içinde istenen konsantrasyonuna seyreltildi edilmelidir. 3 um Boncuklar daha sonra PBS ile resolubilized kuvvetli mıknatıslar, kullanarak çözeltisi ayrılmalıdır. Bu süreç, 3 defa tekrarlanır edilmelidir. Biz bu adımı ge için gerekli olduğunu farkt 3 um boncuklar yüzeyi-immobilize kolajen peptit bağlamak.
4. Kuvvet Proteoliz Assay
- Bir kez akış hücresi düşük, ~ 1 pN kuvvet altında manyetik tuzak görüntü akış hücresi, kolajen peptit ve manyetik boncuklar ile monte edilir. Deneyimlerimize göre, boncuklar bir alt bazen zayıf bir non-spesifik şekilde yüzeye yapıştırılır. Mütevazı kuvvetin uygulanması bu boncuklara kurtarılmış olmasını sağlar.
- Akış hücresi için aktif enzim ekleyin. Bu durumda, MMP-1 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric asetat) ilave edildi ve 3 saat için 37 ° C'de inkübe tarafından önceden aktive edildi. Aktivasyon SDS-PAGE kullanılarak teyit edildi.
- Yakında akış hücresi manyetik cımbız cihazın içine yeniden tanıtıldı olarak, genellikle birkaç yüz ekli boncuk veren, bakış birkaç alanları kapsayan bir video kaydedebilirsiniz. Bu, t = 0 olacaktır.
- T dönerken görünümü çeşitli alanlarda kayıt aynı işlemi (tekrarlayınTüm ayırmak boncuk veya başka proteoliz ayırt oluncaya kadar, normal süre noktalarda aynı görüş alanı) o.
- Kinetik veri analizi
- Farklı zaman noktalarında görüş çeşitli alanlarda boncuk saymak ve onları giriyoruz. T = 0 boncuklar sayısına göre, her bir zaman noktasında boncuklar ortalama sayısına bölünmesiyle boncuklar numarası normalize. Bu boncuk mutlak sayısı deneyden deney farklı olacaktır, çünkü biz, farklı deneyler proteolizin fiyatlarını karşılaştırın sağlar.
- Zamanın bir fonksiyonu olarak oranı çizilir. Bu durumda, bir üstel bozulma artı bir sabit onu donatılmış.
f (t) (ya da kollajen molekülleri unproteolyzed) eklenmiş boncuklar oranı olduğu, t zaman, bir kollajen bir kemer tutturulmuştur boncuklar fraksiyonu, b bozunma oranı sabit olduğu ve Cnon-spesifik bağlı boncuk bölümüdür.- Aynı deney MMP-1 kollajen proteoliz üzerindeki kuvvetin etkisini aydınlatmak için kuvvet ve MMP-1 biyokatalist tekrarlanır.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Yukarıda protokolü enzimatik proteoliz üzerindeki kuvvetin etkisini incelemek için manyetik cımbızları (Şekil 1) arasında yeni bir kullanımını açıklar. Biz gözlenen Brownian dalgalanmaların büyüklüğü ve değişen mıknatıs pozisyonlar (Şekil 2) roll-off frekansı hesabı her ikisini de kullanarak 1 mikron ve 3 mikron boncuk için cımbız kalibre. Kuvveti proteoliz deneylerde, kurulum DNA kolajen (Şekiller 3, 4) ile değiştirilir olması dışında benzer. Kalan boncuk normalleştirilmiş sayı proteoliz oranları (Şekil 5) bulmak için zamanın fonksiyonu olarak çizilebilir ve bu süreç olabilirenzim konsantrasyonu ve güçleri değişen tekrarlandı.
Şekil 1. Manyetik tuzak kalibrasyon işlemini şematik (ölçekli değil). İki kalıcı nadir toprak mıknatıslar süperparamanyetik boncuk çeker bir manyetik alan oluşturur. Yukarı ve aşağı mıknatıs Tercüme uygulanan kuvvet ayarlar. Boncuklar iki mıknatıs arasındaki bir iğne deliğinden geçen ışık ile geleneksel parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi işlemidir Ankastre:. Image 40x hava amacı ile çekilen. Keskin, yuvarlak lekeler coverslip yüzeyine yapışan boncuk karşılık gelir. Out-of-focus nesneleri müstakil boncuk vardır.
Şekil 2. 1 mikron (solda) ve 2.8 mikron (sağda) boncuk için numune yüzeyinden mıknatıs uzaklığın bir fonksiyonu olarak kalibre kuvvet Arsalars. Veri ampirik fonksiyonu için uygun bulundular 
, Burada x mıknatıs mesafedir. A = 31.8, b = 5.61, ve c 1 mikron boncuk ve için = 4.39 a = 140, b 3 mikron boncuk = 3.10 ve c = 1.86. Bu değerler, belirli bir cihaz ve deneysel bir geometri özgü olan ve her bir cihazın tek tek kalibre edilmesi gerekir. Her noktada hata çubukları boncuk boyutu değişkenliği nedeniyle boncuk bazında bir kordonu üzerine uygulanan kuvvet bir ~% 10 değişkenlik göstermektedir. Uygulanan kuvvet boncuklar hacmi ile orantılıdır ve boncuk hacmi (üretici özelliklerine göre) ortalama üzerinde ~% 9 değişir.
Şekil 3. Kuvvetleri proteoliz assay kurulum (Not ölçekli). Kollajen modeli trimer m yoluyla lameller yüzeyine yapışık olduğuSK / anti-myc konjugasyon. Streptavidin kaplı boncukların süperparamanyetik bir biyotin-streptavidin bağı ile kolajen trimerler bağlıdırlar. Aktif MMP-1 kesim zamanla kolajen, boncuklar yüzeyden ayırmak ve odak düzlemi uzaklaşmaya neden olur.
Şekil 4. Zamanın bir fonksiyonu olarak proteoliz şematik çizgi. Karikatür proteoliz zamanla görüş örnek bir alan oluşur gösterir. Zamanla, MMP-1 keser kolajen ve boncuk ayırmak ve manyetik alan etkisi altında odak düzlemi uzaklaşın.
Şekil 5. Proteoliz oranları uygulanan kuvvet 16 bağlıdır. , 6.2 pN (3 uM MMP-1, kırmızı) ve 13 pN (0.2 uM MMP-1; mage; Gösterildi 1.0 pN (siyah 3 uM MMP-1) toplanan verilerNTA). Proteolizin oranları (uyum parametreleri) şunlardır: 0.22 ± 0.02 dk -1 (1 pN), 0.46 ± 0.09 dk -1 (6.2 pN) ve 2.08 ± 0.18 dk -1 (13 pN). Uzun süre puan (> 15 dakika) unproteolyzed boncuk fraksiyonu farklı deneyler arasında ~ 0.25 yaklaşık sabit kalır. Hata çubukları her noktada gözlem sayısı yansıtan Poisson istatistikleri karşılık gelir. N boncuklar için her bir zaman noktasında hata n, 1/2 'dir. Ekli boncuklar fraksiyonunda hata propagation.1 um boncuklar 1,0 pN ve 6,2 pN deneyler ve 2,8 um boncuklar 13 pN deneyler için kullanıldı için kullanıldı hata hesaplandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, klasik bir tek bir molekül tekniği için yeni bir kullanımını açıklar. Manyetik cımbız, bir maliyet-etkin şekilde yüksek verimli tek bir molekül testleri orta sağlar. Ancak, tüm deneysel teknikler gibi zorluklar ve potansiyel tuzaklar vardır.
Manyetik cımbız Sınırlamalar
Optik bir tuzak ile karşılaştırıldığında MT aygıtının mekansal ve zamansal çözünürlüğü düşük. Bundan başka, burada açıklanan basit MT tarafından üretilen kuvvetleri rutin AFM deneylerde erişilen kuvvetleri önemli ölçüde daha az 30 pN veya daha az, bulunmaktadır. Bu sınırlama bir erdem olabilir: MT de alt-pN kuvvetler uygulamak için uygundur.
Örneğin buraya cihazı gibi bir optik kapanı veya AFM, konvansiyonel MT, farklı olarak, bu parçacıkların bir manipülasyon izin vermezler. Optik tuzakları genellikle MT dikey bir çekme deneyler için en uygun edilirken, coverslip paralel kuvveti uygulamak için kullanılır. Elektromanyetiktik MT artan karmaşıklığı pahasına olsa da, bu sınırlamalar ele.
Cımbız Kalibrasyon
Kuvvet kalibrasyonu için Brownian dalgalanma ve güç spektrum analizi ikisi de sınırlamaları vardır. Biz Brownian dalgalanma yöntemi kamera bulanıklığı özellikle duyarlı olduğu bulundu. Kare hızı arttıkça (pozlama süresi azalmış) hesaplanan kuvvet azalmıştır. Brownian dalgalanmalar hesaplanan kuvvetler% 10 içindeki güç spektrumu kullanılarak hesaplanan kuvvetler ile kabul edene kadar Uygulamada, çerçeve oranı arttı. Tersine, güç spektrum analizi kamera bulanıklığa karşı daha sağlam, ama uygulamak için biraz daha zordur. Biz sonuçların sağlamlığını kontrol etmek için hem hesaplama öneririz.
Biz Paso büyüklüğü ve ~% 10 oranında uygulanan kuvvet değişimleri manyetik partikül içeriği sonucu bu varyasyonlar unutmayın. Bu etki bizim son bir deney olması önemli değildiHer ölçüm boncuk yüzlerce üzerinde biz ortalama neden olur. Ancak, her gergin boncuk eşsiz bilgiler elde deneyleri, potansiyel olarak daha doğru bir kalibrasyon yöntemi gerektirebilir.
Tek nokta ekleri sağlamak için Kontrolleri
Belirli, odaklı, tek-nokta ekleri ulaşmak çoğu zaman tek bir molekül çalışmalarda pratik bir sorundur. Aşağıdaki kontroller antikor için kolajen özel eki doğruladı ve kollajen boncuk:
- BSA ile pasifize bir akış hücresi sadece boncuk eklendi.
- Anti-myc, BSA ile pasifize ve ardından ekledi boncuk eklendi.
- Anti-myc eklendi, BSA ile pasifleştirilmiştir non-biyotinile kollajen eklendi ve ardından boncuklar eklendi.
- BSA ile pasifize olmayan biyotinile kollajen ve ardından ekledi boncuk eklendi.
- BSA ile pasifize, biyotin kollajen ve ardından ekledi boncuk eklendi.
- Anti-myc Eklendi, BSA ile pasifize, biotin eklendiylated kollajen ve ardından ekledi boncuk.
Durumlarda ek serisinin bazı bileşen kasten unutulmuş 1-5, yerde 0-4 boncuk görünümü (80,000 mikron 2) Alan başına akış hücresi bağlı görüldü. Sadece tüm ek kısımlar mevcut durumda 6,, biz ~ 30-60 2.8 mikron boncuk ve yüzeye bağlı 80-200 1 mikron boncuk gördün. Proteoliz kinetiği yeterli tek bir üstel artı güçlü bir sınırlama basamağı sadece bir oranı ve dolayısıyla tek bir köstek olduğunu düşündürmektedir bir sabit terim tarafından uygun olduğu görülmektedir. Sabit terim muhtemelen non-spesifik coverslip bağlı olan boncuk yansıtır.
Biz deney için çalıştı antikor ve protein konsantrasyonları rapor. Yeni bir tahlil geliştirirken, her bileşen için konsantrasyonları bir geniş muayene edilmelidir. BSA bizim deneyde bir yüzey pasivasyon ajan olarak iyi çalıştı. Bununla birlikte, bu arayahod her koşulda çalışmayabilir. Yüzey pasivasyon için diğer protokolleri de kullanılmaktadır başarı ile. Örnekler polietilen glikol fonksiyonelleştirilmiş cam levhaya 17, bir bloke edici ajan olarak desteklenir lipid bilayers 18 veya kazein içerir.
Veri analizi ile ilgili notlar
Etkileşimleri - force proteoliz deneylerde, kovalent olmayan (örneğin streptavidin biotin) ayrışması nedeniyle bazı non-spesifik dekolmanı (özellikle yüksek güçleri 19 ') her zaman vardır. Biz Adhikari'nin et açıklanan hiçbir MMP-1 gibi çeşitli MMP-1 konsantrasyonları, at proteoliz ölçerek bu olguyu açıklayabilir. Tüm kuvvetleri için çeşitli MMP-1 konsantrasyonlarda al. Ölçüm proteoliz us katalitik etkinliği k kedi / enzim K M hesaplamak için kullanılan Michaelis-Menten eğrileri, oluşturmasına olanak sağlar. Enzim, çeşitli konsantrasyonlarda kullanılmaz Alternatif olarak, eğer öneririzBir kontrol ölçümü non-spesifik dekolmanı fiyatında çıkarmak için verilen kuvvetler hiçbir enzim ile yapılabilir.
Potansiyel uygulamalar
Manyetik cımbız geniş bir güç aralığını kapsar. Uygulanan edilebilir kuvvetleri boncukların boyutu bağlıdır. 1 mikron ve 2.8 mikron boncuk ara güçlerine boncuklar kullanarak, erişilebilir güçleri ve deneyimlerimizi üst üste iyi çalışır.
Biz benzer deneysel yaklaşımlar 21 ve bağlayıcı etkileşimleri 22 unfolding, kuvvet bağımlı proteoliz 4,20 okuyor geniş bir uygulama olabileceğini tahmin ediyoruz. Biz ve diğerleri 23 odak boncuk dışında kırınım halkaları yarıçapı coverslip 23 boncuk göreli konumunu izlemek için hassas bir vasıta olduğunu gözlemlemekteyiz. Genellikle bu şekilde kullanılmıyor olsa da, MT testler nanometre-hassas ölçüm sağlama kapasitesine sahip olduğuna inanıyoruzprotein yapı dinamiğinin urements. Bu ek bilgi kuvveti bağımlı proteoliz veya bağlayıcı ölçümler bağlamında özellikle değerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Bilimsel Arabirimi (ARD), NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü Programı çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Yüksek Lisans Bursu (ASA de Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ile desteklenmiştir ) ve Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü Younger predoctoral Bursu (JC). Yazarlar mikroskopi ekipman loaning James Spudich teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x22) | VWR | 48366-067 | |
| Micro Cover Glass #1.5 (22x40) | VWR | 48393-048 | |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 | |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 | |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 | |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D | |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 | |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 | |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis | |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis | |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | ||
| z-translator | Thorlabs | MTS50 | |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
