Summary
En metode for foto-innkapsling av celler i en krysskoblet PEG hydrogel er beskrevet. Hypoksisk signalering innenfor innkapslet murine insulinoma (MIN6) aggregater spores ved hjelp av et fluoriserende fargestoff system. Dette systemet tillater seriell undersøkelse av celler i en hydrogel stillas og korrelasjon av hypoksisk signalering med endringer i celle fenotype.
Abstract
I Diabetes mellitus type 1, autoimmun ødeleggelse av bukspyttkjertelen β-cellene resulterer i tap av insulin produksjon og potensielt dødelig hyperglykemi. Som et alternativ behandling alternativ til eksogene insulin injeksjon, har transplantasjon av funksjonelle pankreas vev blitt utforsket 1,2. Denne tilnærmingen gir løfte om en mer naturlig, langsiktig restaurering av normoglycemia. Beskyttelse av donor vev fra vertens immunforsvar er nødvendig for å forhindre avstøtning og innkapsling er en metode som brukes for å oppnå dette målet.
Biologisk-avledet materialer som alginat 3 og agarose 4, har vært den tradisjonelle valg for kapsel konstruksjon, men kan indusere betennelse eller fibrotiske overvekst 5 som kan hindre næringsstoffer og oksygen transport. Alternativt syntetisk poly (etylenglykol) (PEG)-baserte hydrogeler er ikke nedverdigende, lett functionalized, tilgjengelig på høy renhet,har kontrollerbar pore størrelse, og er ekstremt biokompatible, 6,7,8. Som en ekstra fordel, kan PEG hydrogeler dannes raskt i en enkel foto-crosslinking reaksjon som ikke krever bruk av ikke-fysiologiske temperaturer 6,7. En slik prosedyre er beskrevet her. I crosslinking reaksjonen, UV nedbrytning av photoinitiator, 1 - [4 - (2-Hydroxyethoxy)-fenyl]-2-hydroxy-2-metyl-1-propan-1-ett (Irgacure 2959), produserer frie radikaler som angriper vinyl karbon-karbon dobbelt bånd dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking på kjeden slutter. Crosslinking kan oppnås innen 10 minutter. PEG hydrogeler konstruert på en slik måte har vist seg å gunstig støtte celler 7,9, og den lave photoinitiator konsentrasjon og kortvarig eksponering for UV-stråling ikke er skadelig for levedyktighet og funksjon av den innkapslede vev 10. Mens vi methacrylate vår PEG med metoden som er beskrevet nedenfor, kan PEGDM også directly kjøpes fra leverandører som Sigma.
En iboende konsekvens av innkapsling er isolering av celler fra en vaskulære nettverk. Tilførsel av næringsstoffer, spesielt oksygen, er derfor redusert og begrenset av diffusjon. Dette reduserte oksygen tilgjengelighet kan særlig påvirke β-celler der insulin sekretoriske funksjon er svært avhengig av oksygen 11-13. Capsule sammensetning og geometri vil også påvirke diffusjon priser og lengder for oksygen. Derfor har vi også beskrive en teknikk for å identifisere hypoksisk celler i løpet av vår PEG kapsler. Infeksjon av celler med en rekombinant adenovirus gir en fluorescerende signal til å bli produsert når intracellulære hypoksi-induserbar faktor (HIF) veier er aktivert 14. Som HIFs er de primære regulatorer av transcriptional respons på hypoksi, de representerer et ideelt mål markør for påvisning av hypoksisk signalering 15. Denne tilnærmingen gjør det mulig for enkel og rask påvisning av hypoxic celler. Kort fortalt har adenovirus sekvensen for en rød fluorescerende protein (Ds Red DR fra Clontech) under kontroll av en hypoksi-responsive element (HRE) trimer. Stabilisering av HIF-1 fra forhold med lavt oksygennivå vil drive transkripsjon av fluorescerende protein (Figur 1). Ytterligere detaljer om bygging av dette viruset har vært publisert tidligere 15. Viruset er lagret i 10% glycerol ved -80 ° C til så mange 150 mL alikvoter i 1,5 ml sentrifugerør ved en konsentrasjon på 3,4 x 10 10 PFU / mL.
Tidligere undersøkelser i vårt laboratorium har vist at MIN6 cellene innkapslet som tilslag opprettholde sin levedyktighet gjennom fire uker med kultur i 20% oksygen. MIN6 aggregater kultivert på 2 eller 1% oksygen viste både tegn på nekrotiske celler (fortsatt ca 85-90% levedyktig) ved farging med Etidiumbromid samt morfologiske endringer i forhold til celler i 20% oksygen. Den glatte sfærisk form av aggregatene vises på 20% var lost og aggregater dukket opp mer som uorganiserte grupper av celler. Mens lav oksygen stresset ikke føre til en markant nedgang i levedyktighet, er det klart påvirker MIN6 aggregering og funksjon målt ved glukose-stimulert insulinsekresjon 15. Western blot analyse av innkapslet celler i 20% og 1% oksygen viste også en signifikant økning i HIF-1α for celler dyrket i forhold med lavt oksygennivå som korrelerer med uttrykket av DsRed DR protein.
Protocol
1. PEGDM syntese og fotoaktive PEGDM macromer løsning forberedelse
- Vei 2g av PEG (lineær, 10.000 Da) i et 40 ml hetteglass med en hard plast cap.
- Tilsett ca 308μL av methacrylic anhydride og løst cap hetteglasset.
- Mikrobølgeovn hetteglasset på høy i 2 minutter i en standard innenriks mikrobølgeovn. Iført varme hansker, grundig vortex flasken, så mikrobølgeovn på høy for ytterligere 5 minutter.
- Kort la hetteglasset kjølig nok til å håndteres med hansker. Slipp den og sakte legge metylenklorid mens virvlende hetteglasset. Legg nok slik at løsningen synes klart og homogent, virvling prøven etter behov. Det totale volumet av metylenklorid brukes bør være 1,5 til 2 ml.
- Utløse PEGDM i 200 ml kaldt, vakte dietyleter ved å legge løsningen dropwise.
- Samle PEGDM ved vakuumfiltrering og la den tørke.
- Oppløs PEGDM i en tilstrekkelig mengdeav avionisert vann (vanligvis 100 -150 ml).
- Dialyser løsningen mot avionisert vann for 5 dager i dialyse rør med en molekylvekt cut-off på 1000 DA. Skift vann en gang daglig.
- Delmengde løsningen i passende beholdere og fryses ved -80 ° C over natten. Lyophilize løsningen for 4 dager for å gi en renset hvitt PEGDM pulver. Oppbevar pulver ved 4 ° C når den ikke er i bruk.
- Å forberede en fotoaktive PEGDM løsning, først utarbeide en 0,5 vektprosent photoinitiator stamløsningen ved å løse opp Irgacure 2959 i avionisert vann. Vortex løsningen og lagre den i mørket.
- Tilbered en 10 wt% PEGDM og 0,025 vekt% Irgacure 2959 løsning i Hank er Balanced Salt Solution (HBSS). Vortex grundig for å sikre oppløsning av PEGDM. Vi vanligvis forberede 1 ml av denne løsningen på en gang.
- Steriliser løsningen ved å filtrere det gjennom et 0,2 mikrometer sprøyte filteret inn en 1,8 mL mikrosentrifuge tube. Pakk røret i aluminiumsfolieog oppbevar ved 4 ° C
2. Kultur, infeksjon, og aggregering av MIN6 celler
- MIN6 celler dyrkes i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 7mm glukose, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, og 0,5 mikrogram / ml amphotercin B i et fuktet miljø ved 37 ° C og 5% CO 2.
- For å løsne cellene fra den behandlede kulturen flasken overflate, Aspirer medium, skyll cellene med 37 ° C kalsium / magnesium-free HBSS, Aspirer HBSS, deretter tilsett 2 mL 37 ° C trypsin-EDTA løsning og la cellene til Inkuber i 3 minutter.
- Fast jar siden av kolbe til å banke cellene gratis, deretter legge 8 mL 37 ° C medium og kraftig pipette cellen suspensjonen opp og ned å ta vare ikke å innføre bobler.
- Pipetter cellene i en steril 15 ml sentrifugerør og utføre en celletall ved hjelp av en hemocytometer eller annen celle telle prosedyre.
- Ved utarbeidelsen å infisere celler med makervirus, først fastslå det totale antall celler for å bli smittet og beregne volumet av viruset suspensjon kreves for å oppnå den ønskede mangfold av infeksjon (MOI) (50 til 100 infeksiøse partikler per celle).
- Spe viruset i HBSS ved nøye pipeting riktig mengde virus suspensjonen i en pre-alikvoteres volumet av HBSS i en 1,8 mL mikrosentrifuge tube. 50 mL av HBSS per brønn av aggregering av celler er hensiktsmessig.
- Spre cellene ved pipeting dem opp og ned i rør deres, så pipettér de nødvendige volum for å oppnå 400 000 celler per brønn i brønnene til en 6-godt suspensjon kultur plate.
- Legg til passende volum av fortynnet virus hver brønn for å oppnå ønsket MOI.
- Legg medium til hver brønn for å bringe det totale volum opp til 1,7 ml.
- Sett platen på en orbital shaker inne i inkubatoren. Sett shaker på en lav innstilling, slik at mediet forsiktig vasker rundt brønnene (~ 100 rpm). La cellene til aggregate for 24-36 timer. Aggregater med en omtrentlig diameter på 75-175 mikrometer skal formes.
3. Innkapsling av celler i PEGDM
- Cellene kan være innkapslet som en dispersjon (trinn 2,4) eller etter aggregering (trinn 2.10). Siden hydrogel forløperen PEGDM løsning er en væske, kan cellene har en tendens til å bosette seg før crosslinking og hydrogel formasjon. Hvis settling forventes å skje raskt, for eksempel med større aggregater, kan det være gunstig å produsere hydrogel i to trinn, slik at cellene bosette seg til en sentral planet av gel. En ett-trinns hydrogel syntese prosedyre hensiktsmessig for spredt celler er vist (figur 2) og to-trinns prosedyre er vist som godt (figur 3) og detaljert nedenfor (03.02 til 03.09).
- Lag et fartøy hvor hydrogel vil bli dannet ved å kutte den koniske spissen ut av en 1 ml plastsprøyte og plassere den åpne ende opp i et rack.
- Pipetter 20 mL av fotoaktive PEGDM såforurensning inn i den åpne enden av sprøyten på stempelet slik at volumet dekker hele stempelet overflaten. Juster stempelet i små trinn for å oppnå en flat væske overflate.
- Plasser pipettér i racket og posisjon stativet under en UV-lampe (365nm, ~ 7 mW / cm 2) i ca 8 minutter å tillate hydrogel crosslinking. I løpet av denne tiden, kan utarbeidelsen av cellene være begynt
- Pipet et volum som inneholder ønsket antall celler / tilslag til en 1,8 mL mikrosentrifuge tube, cap, og sentrifuger røret på 130 g i 5 minutter.
- Ved hjelp av en micropipettor, nøye fjerne media uten å forstyrre cellen pellet på tuppen av røret. Som media hodet nærmer seg pellets, kan det være nyttig å bruke en finere, 10 mL pipette spissen.
- Forsiktig cellepelleten suspenderes i 20 mL av fotoaktive PEGDM løsning (bruk en bred åpning pipettér tips hvis arbeider med aggregater) og legge den cellesuspensjon til sprøyten på toppen av the tidligere krysskoblet hydrogel porsjon.
- Utsette sprøyten til en ytterligere 8 minutter av UV-lys for å fullføre byggingen av hydrogel. Når du er ferdig, bør cellene være helt innkapslet i sylindriske hydrogel (figur 3).
- Løs ut hydrogel fra sprøyten og inn 1 mL HBSS i brønnen av en 24-brønns plate kort vaske gel. Overfør gel til 1 ml av media i brønnen av en 24-brønns plate og kultur under de ønskede forholdene.
Fire. Hypoksi sporing
- På ethvert tidspunkt under kulturen, image cellene med fluoriserende mikroskopi å spore initiering av hypoksisk signalering. Avhengig av hva som blir fotografert, kan du bildet i multi-brønn plate eller overføre gelen til et objektglass før plassering på mikroskopet scenen. Peak eksitasjon av Ds Red oppnås ved 556nm og topp utslipp skjer på 586nm. Utslipp er ganske intens og dermed fotobleking har ikke blitt observed å være problematisk. Lag tid mellom initiering av protein produksjon og første signal deteksjon er ca 12 timer. Signal er spesifikt nok til å identifisere individuelle signalering celler, men løsningen kan være utilstrekkelig for å bestemme intracellulære signal lokalisering. I signalering celler, er signal vanligvis observert jevnt gjennom hele cytoplasma. Signal intensitet kan også øke med forlenget eksponering til hypoksi, men vi har ennå ikke helt bestemt om dette skyldes økt protein uttrykk, total protein akkumulering, eller forsinket protein modning.
5. Representative resultater
Et representativt eksempel på MIN6 tilslag innkapslet i en PEG hydrogel er vist i Figur 4. Den krysskoblet gel vil være solid i hele, tar form av fartøyet der reaksjonen ble utført. En gel med glatte ytre flater er å foretrekke for implantasjon til hjelp i forebygging av et fremmedlegeme rerespons. Innenfor gel, bør celle aggregater være fullt vedlagt i matrise og homogent fordelt til muliggjøre bedre næringsstoff transport.
Representative bilder av hypoksisk signalering i MIN6 aggregatene er avbildet i figur 5. Identisk MIN6 aggregater infisert med markøren virus ble dyrket i enten 20% O 2 (5a) eller 1% O 2 (5b) for 44 timer før bildet tas.
Figur 1. Skjematisk av aktiviteten til våre hypoksi markør system. Adenoviral innsetting av Ds Red DR genet og oppstrøms HRE arrangøren gir for hypoksi-indusert produksjon av fluorescerende protein under kontroll av HIF-1.
Figur 2. Prosessuelle flow chart for den enkle trinn innkapsling av dispergert MIN6 celler i en crosslinked PEGDM hydrogel. For hver gel, er de spredt celler suspendert i 40μL av fotoaktive PEGDM macromer løsning. Dette er plassert i en halshugget 1 ml sprøyte og hydrogel er dannet under 365nm UV lys etter 10-12 minutter. Ved ferdigstillelse er hydrogel disken fjernes fra sprøyten, vasket og lagt i en middels fylt bra plate for inkubasjon.
Figur 3. Prosessuelle flow chart for dual-trinnet innkapsling av samlet MIN6 celler i en krysskoblet PEGDM hydrogel. For hver gel, er en halv-gel første dannes ved UV crosslinking av 20μL av fotoaktive PEGDM macromer løsning for 8 minutter. MIN6 aggregatene er nøye suspendert i en ekstra 20μL av fotoaktive macromer løsning som er lagt på toppen av pre-formet halv-gel. Den fullstendige gel er dannet ved en ytterligere 8 minutter med UV-eksponering med tilslag fullstendig innkapslet i den medialeFlyet av gel.
Figur 4. Bilde av en 40μL hydrogel henhold 20X forstørrelse. MIN6 aggregater (~ 400 000 totalt celler) er tydelig i gel. Hydrogel diameter er ca 6mm (bar = 1mm).
Figur 5. Fluorescent hypoksi signalering i samlet MIN6 celler i et PEGDM hydrogel. Celler som var innkapslet, og deretter plassert i inkubasjon ved 20% O 2 for 44 timer vises ikke hypoksi signalering (a) mens celler som var innkapslet deretter inkubert i 2% O 2 for 44 timer vise klare, allestedsnærværende signal. (Bar = 100μm) (b).
Discussion
Metoden som presenteres her gir en rask og enkel teknikk for celle innkapsling i en PEG hydrogel med minimal bruk av ikke-fysiologiske forhold. PEG representerer et meget nyttig innkapsling materiale for sine biokompatibilitet og enkel modifisering. Enkel variant av PEG prosent i fotoaktive løsning, for eksempel kan brukes til å justere mekaniske egenskaper, som for eksempel compressive modulus, og transport egenskaper gjennom porestørrelse. Dessuten er PEG enkelt endres ved tilsetning av sidekjeder. PEG hydrogeler derfor representerer både en lovende klinisk enhet og en fleksibel plattform for in vitro forskning
En metode for sporing av hypoksi i PEG-innkapslet cellene har også vært presentert. Denne metoden er nyttig for enkelhet av hypoksi deteksjon og for å unngå behovet for å ofre cellene av interesse. Teknikken kan brukes til en rekke typer celler i en rekke forhold gjør seg ossefulness bred. For eksempel kan hypoksi som et signal for stamcelle differensiering spores i stamcelleforskningen micromass kulturer. Imidlertid kan denne metoden bare kan anvendes for å spre celle systemer eller system hvor spredt cellene er senere aggregert. Dessuten kan påvisning av fluorescerende signal være vanskelig i større eller tettere vev.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Takket være Kristi Anseth lab ved University of Colorado, Boulder for generøst å forsyne MIN6 celler. Midler til dette prosjektet har blitt gitt av NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
- Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
- Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
- Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
- Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
- Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
- Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
- Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
- Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).
