Bir çapraz PEG hidrojel hücrelerin fotoğraf kapsülleme için bir yöntem açıklanmıştır. Kapsüllü fare İnsulinoma (MIN6) agrega içinde Hipoksik sinyal floresan marker sistemi kullanılarak izlenir. Bu sistem değişiklikleri ile hücre fenotipi hipoksik sinyal hidrojel iskele ve korelasyon içinde hücre seri muayene sağlar.
Diabetes mellitus tip 1, insülin üretim kaybı ve potansiyel olarak öldürücü hiperglisemi, pankreas beta-hücrelerinin sonuçları otoimmün yıkım. Eksojen insülin enjeksiyonuna alternatif bir tedavi seçeneği olarak, fonksiyonel pankreatik doku nakli 1,2 incelenmiştir. Bu yaklaşım, normoglycemia daha doğal, uzun vadeli bir restorasyon söz sunuyor. Konağın bağışıklık sistemi donör doku Koruma ret ve kapsülleme bu amaca ulaşmanıza yardımcı olmak için kullanılan bir yöntemdir önlemek için gereklidir.
Aljinat 3 ve agaroz 4 biyolojik olarak elde edilen malzemeler, kapsül yapımı için geleneksel bir seçim var ama inflamasyon veya fibrotik aşırı çoğalma 5 besin ve oksijen taşıma engel neden olabilir . Alternatif olarak, sentetik poli (etilen glikol) (PEG) bazlı hidrojel, yüksek saflıkta, kolayca Fonksiyonlu, olmayan onur kırıcıkontrol edilebilir gözenek büyüklüğüne sahip ve son derece 6,7,8, biyouyumlu. PEG hidrojeller ek bir fayda olarak, fizyolojik olmayan sıcaklıklarda 6,7 uygulama gerektirmez, basit bir fotoğraf crosslinking reaksiyon hızla oluşmuş olabilir . Böyle bir prosedür burada tanımlanmıştır. Crosslinking reaksiyon, photoinitiator UV bozulması, 1 – [4 – (2-metil)-fenil]-2-hidroksi-2-metil-1-propan-1-(Irgacure 2959), serbest radikaller üretir saldırı hangi zincir dimethacrylated PEG (PEGDM) indükleyici crosslinking vinil karbon-karbon çift bağları sona erer. Crosslinking 10 dakika içinde elde edilebilir. Olumlu hücreleri 7,9 desteklemek için böyle bir şekilde inşa PEG hidrojeller gösterilen, düşük photoinitiator konsantrasyon ve kısa UV radyasyona maruz kalma, 10 kapsüllü bir doku canlılığı ve fonksiyonu için zararlı değildir. PEG yöntemi ile aşağıda açıklanan biz metakrilat iken, PEGDM dir.Basınçlı Sigma gibi sunucuları satın aldı.
Kapsülleme doğal bir sonucu vasküler bir ağ hücrelerin izolasyonu. Bu nedenle besin temini, özellikle oksijen azalır ve difüzyon ile sınırlıdır. Bu düşük oksijen kullanılabilirliği, özellikle insülin salgı işlevi 11-13 oksijen son derece bağımlı β-hücreleri etkileyebilir . Kapsül kompozisyon ve geometri için difüzyon oranları ve uzunlukları aynı zamanda oksijen etkisi olacaktır. Bu nedenle, biz de PEG kapsül içinde hipoksik hücrelerin belirlenmesi için kullanılan bir tekniktir açıklar. Rekombinant adenovirüs hücreleri Enfeksiyon, hücre içi hipoksi-indüklenebilir faktör (HIF) yollar 14 aktive edildiğinde bir floresan sinyali sağlar . HIFs hipoksiye transkripsiyonel yanıt birincil düzenleyiciler olarak, hipoksik sinyalizasyon (15) tespiti için ideal bir hedef işaretleyici temsil eder. Bu yaklaşım, Hypoxi kolay ve hızlı algılama sağlarc hücreleri. Kısaca, adenovirüs, hipoksi duyarlı bir unsuru (HRE) trimer kontrolü altında kırmızı floresan proteini (Clontech Ds Kırmızı DR) için sıra vardır. Düşük oksijen koşullarının HIF-1 stabilizasyonu floresan protein (Şekil 1) transkripsiyonunu sürücü olacaktır. Bu virüsün inşaat Ek ayrıntılar daha önce 15 olarak yayınlanmıştır . , Virüs -80% 10 gliserol saklanır ° C 3.4 x 10 10 pfu / ml 'lik bir konsantrasyon 1,5 mL santrifüj tüplerine 150 mcL alikotları .
Laboratuarımızda Önceki çalışmalar, agrega,% 20 oksijen kültür 4 hafta boyunca canlılığını korumak MIN6 hücreleri kapsüllü göstermiştir. MIN6 2 kültüre agrega veya% 1 oranında oksijen etidyum bromür ile boyanarak yanı sıra% 20 oksijen hücrelere göre morfolojik değişiklikler nekrotik hücreler her iki işaretleri (% 85-90 hakkında hala canlı) gösterdi. Agrega,% 20 oranında görüntülenir pürüzsüz bir küre şeklini lost ve agrega hücrelerin düzensiz gruplar gibi göründü. Düşük oksijen stres canlılığı içinde belirgin bir düşüşe neden olmasa da, açıkça MIN6 agregasyonu ve glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması 15 olarak ölçülen fonksiyonu etkiliyor. Kapsüllü hücrelerin% 20 ve% 1 oranında oksijen Western blot analizi de HIF-1α DsRed DR protein ekspresyonu ile ilişkilidir düşük oksijen şartlarında kültür hücreleri için önemli bir artış gösterdi.
Burada sunulan yöntem, fizyolojik olmayan koşullarda minimum kullanımı ile PEG hidrojel hücre kapsülleme için hızlı ve basit bir yöntem sunuyor. PEG biyouyumluluk ve modifikasyon kolaylığı için çok yararlı kapsülleme malzemesi temsil eder. Basit farklılıklar fotoaktif çözüm PEG yüzdesi, örneğin, gözenek boyutu ile mekanik basınç modülü gibi özellikleri, ve taşınım özellikleri ayarlamak için kullanılır. Ayrıca, PEG yan zincirler ilavesi ile kolayca değiştirilebilir. PEG hidrojeller, bu nedenle, gelecek vaat eden bir klinik cihaz ve in vitro araştırma için esnek bir platform temsil
PEG-kapsüllü hücreleri hipoksi izleme için bir yöntem de sunulmuştur. Bu yöntem, hipoksi algılama basitliği ve ilgi hücreleri feda etmeye gerek önlemek için yararlıdır. Teknik koşulları, bize çeşitli hücre tiplerinin çeşitli uygulanabilirgeniş efulness. Örneğin, kök hücre farklılaşması için bir işaret olarak hipoksi, kök hücre Micromass kültürlerde takip edilebilir. Ancak, bu yöntem sadece hücreleri daha sonra toplanmış dağınık olan hücre sistemleri veya sistem dağıtmak için uygulanabilir. Ayrıca, floresan sinyal algılama, büyük ya da yoğun dokularda zor olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Cömertçe MIN6 hücreleri sağlamak için, Boulder, Colorado Üniversitesi'nden Kristi Anseth laboratuara teşekkür ederiz. NSF tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |