Summary
Метод фото-инкапсуляции клеток в сшитый гидрогель ПЭГ описан. Гипоксическая сигнализации в инкапсулированные мышиной инсулиномы (MIN6) агрегатов отслеживать с помощью флуоресцентного маркера системы. Эта система позволяет серийный изучения клеток в гидрогель эшафот и корреляции гипоксического сигнализации с изменениями в клеточный фенотип.
Protocol
1. PEGDM синтеза и фотоактивных PEGDM макромера приготовления раствора
- Взвесьте 2g ПЭГ (линейный, 10000 Da) в 40 мл флакон стекло с жестким пластиковым колпачком.
- Добавьте примерно 308μL метакриловой ангидрида и свободно колпачок флакона.
- Микроволновая флакон на высоко в течение 2 минут в стандартной бытовой микроволновой печи. Ношение теплостойкие перчатки, тщательно вихрь флаконе, то микроволновая печь на высоко в течение еще 5 минут.
- Кратко позволяют флакон для охлаждения достаточно, чтобы обращаться с перчатками. Открывать его и медленно добавить метиленхлорид в то время как закрученной флаконе. Добавить настолько, что решение представляется ясным и однородной, вортексе образца по мере необходимости. Общий объем метиленхлорид использоваться, должны быть 1,5 - 2 мл.
- Осадок PEGDM в 200 мл холодной, перемешивают диэтиловый эфир, добавляя по каплям раствор.
- Сбор PEGDM путем вакуумной фильтрации и дайте ему высохнуть.
- Растворите в PEGDM достаточное количестводеионизированной воды (как правило, 100 -150 мл).
- Диализировать решение против деионизованной воде в течение 5 дней у диализных трубок с молекулярной массой отсечки в 1000 Da. Замените воду один раз в день.
- Алиготе решение в соответствующие контейнеры и заморозить при -80 ° С в течение ночи. Lyophilize решение в течение 4 дней для получения очищенного белого порошка PEGDM. Хранить порошок при температуре 4 ° С, когда он не используется.
- Чтобы приготовить раствор фотоактивных PEGDM, сначала подготовить 0,5 мас фотоинициатора маточный раствор путем растворения Irgacure 2959 в деионизованной воде. Вихревые решения и хранить его в темноте.
- Подготовка 10 мас PEGDM% и 0,025% масс Irgacure 2959 решение в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS). Vortex полностью, чтобы обеспечить растворение PEGDM. Как правило, мы подготовить 1 мл этого раствора за один раз.
- Стерилизовать раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм в шприц 1,8 мл трубки микроцентрифужных. Оберните трубки в алюминиевой фольгеи хранят при температуре 4 ° C
2. Культура, инфекции, и агрегации MIN6 клетки
- MIN6 клетки культивируют в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 7мм глюкозы, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина и 0,5 мкг / мл amphotercin B во влажной среде при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Чтобы освободить из клетки обрабатываемой поверхности колбы культуры, аспирация среды, промыть ячейки с 37 ° C кальций / магний без HBSS, аспирация HBSS, затем добавить 2 мл 37 ° C трипсина-EDTA решения и позволяют клеткам инкубировать в течение 3 минут.
- Твердо банку сторону колбы стучать клетки бесплатно, затем добавить 8 мл 37 ° C средних и энергично пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, стараясь не ввести пузыри.
- Внесите клеток в стерильных 15 мл центрифужную пробирку и выполнять клеток использованием гемоцитометра или другие процедуры подсчета клеток.
- При подготовке для заражения клеток с производителемВирус сначала необходимо определить общее количество ячеек, которые будут инфицированы и рассчитать объем суспензии вируса, необходимых для достижения желаемого множественности заражения (МВД) (50 до 100 инфекционных частиц на клетку).
- Развести вируса в HBSS, тщательно pipeting необходимое количество суспензии вируса в предварительно аликвоты объемом HBSS в 1,8 трубки микроцентрифужных мл. 50 мкл HBSS на лунку агрегирования клеток необходимо.
- Дисперсные клеток pipeting их вверх и вниз в трубки, а затем пипеткой необходимый объем для достижения 400 000 клеток на лунку в лунки 6-луночный планшет культуры подвески.
- Добавить соответствующий объем разбавленного вируса в каждую лунку для достижения желаемого МВД.
- Добавить среду в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1,7 мл.
- Место пластину на орбитальный шейкер внутри инкубатора. Установить шейкер на низкое значение, так что средний нежно моет вокруг скважин (~ 100 оборотов в минуту). Разрешить клетки агрегацииТе для 24-36 часов. Агрегаты с приблизительным диаметром 75-175 мкм должна быть сформирована.
3. Инкапсуляции клеток в PEGDM
- Ячейки могут быть воплощен в виде дисперсии (шаг 2.4) или после агрегации (шаг 2.10). С PEGDM гидрогеля предшественником решение жидкость, клетки могут оседает до сшивания и гидрогель образования. Если урегулирование как ожидается, произойдет быстро, например, с более крупными агрегатами, это может быть полезно для получения гидрогеля в два этапа, так что клетки оседают на центральной плоскости геля. Один шаг гидрогеля синтеза процедура подходит для рассеянных клеток показано на рисунке (рис. 2) и двухступенчатая процедура показана, а также (рис. 3) и подробно описаны ниже (3.2-3.9).
- Создать сосуд, в котором гидрогель будет формироваться за счет сокращения конический наконечник офф 1 мл пластиковый шприц и размещение его в открытом конечном итоге в стойку.
- Внесите 20 мкл фотоактивных PEGDM такlution в открытый конец шприца на поршень убедившись, что объем покрывает всю поверхность поршня. Отрегулируйте поршень с небольшим шагом для достижения ровной поверхности жидкости.
- Место пипетки в стойку и положение стойки под УФ-лампы (365 нм, ~ 7 мВт / см 2) в течение примерно 8 минут, чтобы дать для гидрогеля сшивания. За это время подготовки клетки могут быть начаты
- Внесите том, содержащий необходимое количество клеток / агрегатов в 1,8 трубки микроцентрифужных мл, крышки, и центрифуга трубке при 130 г в течение 5 минут.
- Использование micropipettor, осторожно удалите СМИ, не нарушая клеточный осадок на кончике трубки. Как сообщил руководитель медиа подходы гранулы, оно может быть полезно использовать более тонкий, 10 мкл кончиком пипетки.
- Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 20 мкл фотоактивных PEGDM решение (использовать широкий рот пипеткой наконечник, если работать с агрегатами) и добавить клеточной суспензии в шприц сверху-йэлектронной ранее сшитый гидрогель части.
- Expose шприц, чтобы еще 8 минут ультрафиолета для завершения строительства гидрогеля. Когда закончите, клетки должны быть полностью инкапсулируется в цилиндрических гидрогеля (рис. 3).
- Извлечь гидрогель из шприца и в 1 мл HBSS в скважине 24-луночного планшета кратко мытья гелем. Передача геля 1 мл средства массовой информации в лунку 24-луночного планшета и культуры под требуемым условиям.
4. Гипоксия слежения
- В любой момент в течение культуру, образ клетки с помощью флуоресцентной микроскопии для отслеживания начала гипоксического сигнализации. В зависимости от того, что вы можете отображаемого изображения в мульти-луночного планшета или передачи гель на предметное стекло микроскопа до размещения на столике микроскопа. Пик возбуждения Ds Красной достигается при 556nm и пик излучения приходится на 586nm. Эмиссия является довольно интенсивным и, таким образом фотообесцвечивания не наблюдаемыеред проблематичным. Временной лаг между началом производства белка и первое обнаружение сигнала составляет примерно 12 часов. Сигнал достаточно конкретным, чтобы выявить отдельные сигнализации клеток, но разрешение может быть недостаточно для определения внутриклеточной локализации сигнала. В сигнализации клетки, сигнал, как правило, наблюдается равномерно по всей цитоплазме. Интенсивность сигнала может также увеличить с расширенной экспозиции к гипоксии, хотя мы еще не полностью определены, если это из-за увеличения экспрессии белка, в целом накопление белка, или задержка созревания белка.
5. Представитель результаты
Типичный пример MIN6 агрегатов инкапсулированных в гидрогель PEG показано на рисунке 4. Сшитый гель будет твердой всему, принимая форму сосуда, в котором реакция была выполнена. Гель с гладкой внешней поверхности предпочтительнее для имплантации, чтобы помочь в предотвращении иностранной валюты телаотклика. В гель, клеточных агрегатов должно быть полностью закрыто в матрице и однородно распределенные для обеспечения лучшего перенос питательных веществ.
Представитель изображений гипоксических сигнализации в MIN6 агрегаты изображенный на рисунке 5. Идентичные MIN6 агрегатов инфицированных вирусом маркер культивировали в любом 20% O 2 (5а) или 1% O 2 (5, б) в течение 44 часов до захвата изображения.
Рисунок 1. Схема деятельности нашей гипоксии системы маркеров. Аденовирусные вставки Ds Красной DR гена и вверх по течению HRE промоутера позволяет гипоксия-индуцированный производство флуоресцентного белка под контролем HIF-1.
Рисунок 2. Процедурные схема для пошагового инкапсуляции дисперсных MIN6 клеток в крosslinked PEGDM гидрогеля. Для каждого гель, рассеяны клетки взвешены в 40μL из макромера решение PEGDM фотоактивных. Это находится в обезглавленной 1 мл шприц и гидрогель образуется при 365 нм УФ-светом через 10-12 минут. После завершения гидрогеля диск удаляется из шприца, промывают и помещают в среду заполненные луночный планшет для инкубации.
Рисунок 3. Процедурные схема для двойного шага инкапсуляция агрегированных MIN6 клеток в сшитый PEGDM гидрогеля. Для каждого гель, полу-гель прежде создан УФ сшивание 20 мкл макромера фотоактивных PEGDM решение в течение 8 минут. MIN6 агрегатов тщательно взвешенные в дополнительные 20 мкл фотоактивных макромера решение, которое добавляется в верхней части предварительно сформированных полу-гель. Полный геля формируется еще 8 минут ультрафиолетового облучения с агрегатами полностью инкапсулируются в медиальнойплоскости геля.
Рисунок 4. Изображение 40μL гидрогеля под 20-кратным увеличением. MIN6 агрегаты (~ 400 тысяч общего числа клеток) отчетливо видны в гель. Гидрогель диаметром примерно 6 мм (бар = 1 мм).
Рисунок 5. Флуоресцентные гипоксии сигнализации в агрегированном MIN6 клеток в PEGDM гидрогеля. Клетки, которые инкапсулируются и затем помещаются в инкубации при 20% O 2 в течение 44 часов не отображаются гипоксии сигнализации (), тогда как клетки, которые были инкапсулированные затем инкубировали в 2% O 2 в течение 44 часов дисплей ясно, повсеместного сигнала. (Бар = 100 мкм) (б).
Discussion
Метод, представленный здесь предлагает быстрый и простой метод для сотовых инкапсуляции в гидрогель ПЭГ с минимальным использованием не-физиологических условиях. ПЭГ представляет собой очень полезный материал для инкапсуляции его биосовместимость и простота модификации. Простое изменение PEG процент в светочувствительный раствор, например, может быть использован для настройки механические свойства, такие как сжатие модулем и транспортные свойства через размером пор. Кроме того, ПЭГ легко модифицируется путем добавления боковых цепей. PEG гидрогели, следовательно, представляют собой как перспективный клинический устройства и гибкую платформу для лабораторного исследования
Метод для слежения за гипоксии в ПЭГ-инкапсулированные клетки также были представлены. Этот метод полезен для простоты гипоксии обнаружения и для избежания необходимости жертвовать клетки интерес. Методика может быть применена к различным типам клеток в различных условиях вносит свой намиefulness широк. Например, гипоксия, как реплика для стволовых дифференцировки клеток могут быть отслежены в стволовых клеточных культур Micromass. Однако этот метод может быть применен только для разгона клеточные системы или системы, в которой рассеяны клетки позже суммируются. Кроме того, обнаружение флуоресцентного сигнала может быть затруднено в большей или плотной ткани.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Благодаря Кристи Anseth лаборатории Университета Колорадо, Боулдер для снабжать MIN6 клеток. Финансирование этого проекта была предоставлена NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
- Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
- Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
- Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
- Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
- Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
- Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
- Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
- Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).
