Summary
यांत्रिक बलों फेफड़ों के विकास और फेफड़ों की चोट में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ, हम एक कृंतक भ्रूण फेफड़ों प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं और fibroblasts को अलग करने और उन्हें यांत्रिक एक का उपयोग कर उत्तेजना को बेनकाब विधि का वर्णन
Abstract
यांत्रिक दोहराव साँस लेने जैसे आंदोलनों के द्वारा और द्रव बढ़ाव द्वारा utero में उत्पन्न बलों सामान्य फेफड़ों के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं. फेफड़ों के विकास का एक प्रमुख घटक वायुकोशीय प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं, फेफड़े surfactant की प्रमुख स्रोत का भेदभाव है. इन कोशिकाओं भी वायुकोशीय लुमेन, मेजबान रक्षा, और चोट की मरम्मत के तरल पदार्थ homeostasis में भाग लेते हैं. इसके अलावा, बाहर फेफड़ों पैरेन्काइमा कोशिकाओं को सीधे यांत्रिक वेंटीलेशन के दौरान किया जा सकता है जन्म के बाद अतिरंजित खिंचाव को अवगत कराया. हालांकि, सटीक आणविक और सेलुलर तंत्र है जिसके द्वारा फेफड़ों की कोशिकाओं को फेफड़ों के विकास को प्रभावित और फेफड़ों की चोट को बढ़ावा देने के यांत्रिक उत्तेजनाओं भावना पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. यहाँ, हम एक सरल और उच्च शुद्धता प्रकार द्वितीय कोशिकाओं और fibroblasts कृंतक भ्रूण फेफड़ों से अलग विधि प्रदान करते हैं. फिर, हम इन विट्रो प्रणाली, Flexcell तनाव यूनिट में वर्णन है, भ्रूण कोशिकाओं को यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करने के लिए, में यांत्रिक बलों का अनुकरणभ्रूण फेफड़ों के विकास या फेफड़ों की चोट. यह प्रायोगिक प्रणाली भ्रूण फेफड़ों खिंचाव उजागर कोशिकाओं में आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हमारी प्रयोगशाला कई रिसेप्टर्स और संकेत प्रोटीन है कि भ्रूण फेफड़ों के विकास और फेफड़ों की चोट में mechanotransduction में भाग लेने की पहचान की है.
Protocol
1. प्लेटों के ईसीएम प्रोटीन के साथ कोटिंग
- बाँझ शर्तों के तहत, ठंड प्लेट प्रति बाँझ 1X पीबीएस के 12 मिलीग्राम के साथ laminin की 120 μg मिश्रण.
- Bioflex अनुपचारित प्लेटें ले लो और एक अच्छी तरह से समाधान की 2ml जोड़ने (laminin की अंतिम एकाग्रता 2 μg / 2 सेमी). वैकल्पिक रूप से, अन्य ईसीएम प्रोटीन ऐसे कोलेजन-1 के रूप में है, इस्तेमाल किया जा सकता है [10 μg / 2 सेमी, fibronectin [5 μg / 2 सेमी, vitronectin [0.5 μg / 2 सेमी या elastin [10 μg / 2 सेमी. कोटिंग तकनीक क्या यह laminin कोटिंग के लिए वर्णित है के समान है. यकीन है कि कुओं को पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं.
- प्लास्टिक के साथ प्लेट लपेटें और एक सपाट सतह पर 4 डिग्री सेल्सियस पर डाल सोखना करने के लिए कुओं के नीचे laminin की अनुमति के लिए रात भर. इन स्थितियों में, प्लेट कम से कम एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है, जबकि अभी भी अच्छा ईसीएम समारोह को बनाए रखना है.
- अगले दिन, बाँझ शर्तों के तहत, 1X पीबीएस के साथ कुओं 3 बार धोना.
- प्लेटें 1X पीबीएस के साथ 3 बार unadsorbed प्रोटीन को दूर कुल्ला.
- 37 ° DMEM में सी प्लेट रखें जब तक कोशिकाओं 2.14 कदम से अलग कर रहे हैं.
2. भ्रूण कृंतक फेफड़ों प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं का अलगाव
अलगाव से पहले दिन विभिन्न आकार नायलॉन autoclaved और तैयार meshes के साथ स्क्रीन कप है.
- माउस / चूहा समय गर्भवती से गर्भ की E17 19 पर भ्रूण फेफड़ों प्राप्त करते हैं. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार DMEM मध्यम युक्त ट्यूब में ऊतक स्थानांतरण और यह बर्फ पर जगह है.
- एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में पाचन बफर (10 मिलीलीटर). इस खंड के लिए, माउस / चूहा से लगभग 20 भ्रूण से फेफड़े के ऊतकों में प्रयोग किया जाता है.
8.5 मिलीलीटर DMEM
0.5 मिलीलीटर 500mm पीएच 7.4 HEPES
5 मिलीग्राम 1 Collagenase
5 मिलीग्राम Collagenase 1A
1 मिलीलीटर चिकन सीरम, निष्क्रिय गर्मी - मिश्रण अच्छी तरह से जब तक सभी घटकों को भंग कर रहे हैं और बाँझ हुड के अंदर एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर. चोटीदार ट्यूब के एक नहाने के पानी में 37 पाचन बफर युक्त डिग्री सेल्सियस रखें
- निकालें - शंक्वाकार ट्यूब से 2.1 कदम से DMEM मध्यम और एक बाँझ पेट्री डिश में ऊतक हस्तांतरण.
- क़ीमा बाँझ कैंची या रेजर ब्लेड के साथ अच्छी तरह से फेफड़ों ऊतक टुकड़े 1 मिमी से भी कम करने के लिए और चोटीदार ट्यूब में 2.3 कदम से पूर्व गर्म पाचन बफर युक्त ऊतक हस्तांतरण.
- Pipetting और नीचे ऊतक डाइजेस्ट:
10 मिलीलीटर विंदुक के साथ 100 बार
5 मिलीलीटर विंदुक के साथ 100 बार
पाश्चर विंदुक के साथ 100 बार - 1300 rpm पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए homogenate अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली DMEM के 15 मिलीलीटर से अधिक 20% FBS में कोशिकाओं से युक्त फिर से निलंबित.
- 100 के साथ स्क्रीन कप ले लो -, 30 - और 15 माइक्रोन नायलॉन meshes और जगह वेंउन्हें बाँझ 150 मिलीलीटर beakers के पर.
- 2.8 कदम से सेल homogenate जोड़ें और क्रमिक रूप से 100 के माध्यम से फ़िल्टर, 30, और 15 माइक्रोन जाल स्क्रीन कप.
- DMEM से अधिक 10% FBS गैर उपकला कोशिकाओं का निस्पंदन की सुविधा के साथ कई washes के बाद और 15 माइक्रोन meshes के clumped से 30 गैर फ़िल्टर कोशिकाओं को ले लीजिए.
- 15 माइक्रोन जाल है जो ज्यादातर शामिल हैं fibroblasts से छानना त्यागें.
- 30 मिनट (का फ्लास्क प्रति सेल निलंबन की approximatelly10 मिलीलीटर) के लिए 2 75 सेमी बोतल में 2.11 कदम से कोशिकाओं incubating के द्वारा आगे प्रकार द्वितीय कोशिकाओं को शुद्ध.
- सतह पर तैरनेवाला और गोली कोशिकाओं के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 1300 आरपीएम पर ले लीजिए.
- ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली सीरम मुक्त DMEM में कोशिकाओं से युक्त फिर से निलंबित. मेजबान की मात्रा संसाधित ऊतक की राशि पर निर्भर करता है. लगभग हम थाली कोशिकाओं के बराबर एक अच्छी तरह से (2 मिलीग्राम) में एक भ्रूण से प्राप्त आदेश में achiपूर्व संध्या 60-70% के बीच अगले दिन confluency.
- Bioflex छह अच्छी तरह से प्लेट पर थाली सेल निलंबन laminin या fibronectin साथ Precoated.
3. भ्रूण कृंतक फेफड़ों fibroblasts का अलगाव
- एक ही प्रकार द्वितीय कोशिकाओं अलगाव के लिए ऊपर वर्णित 2.11 अप करने के लिए चरणों का पालन करें.
- और 2 75 सेमी पर 37 ° C पर 30-60 मिनट के लिए थाली fibroblasts पालन करने के लिए अनुमति देते हैं, 15 माइक्रोन (अनुमानित मात्रा 10-15 मिलीलीटर है पिछले धोने बिना) जाल से छानना ले लो.
- Supernantant महाप्राण (व्यंजन) और सीरम मुक्त DMEM सेते हैं और के साथ रात भर की जगह.
- अगले दिन, 0.25% (wt / वॉल) 0.4 मिमी EDTA और उन्हें Bioflex fibronectin साथ Precoated प्लेटों पर थाली में trypsin साथ कोशिकाओं फसल.
4. फेफड़ों की कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करने के लिए प्रयोगात्मक प्रणाली
- बीज सीरम मुक्त (2 मिलीलीटर अच्छी तरह /) DMEM और उन्हें देते हैं और spre में Bioflex संस्कृति प्लेटों पर कोशिकाओं (लगभग 50% संगामी)विज्ञापन के लिए कम से कम प्रयोग से पहले 6. सामान्य में यांत्रिक तनाव को लागू करने से पहले 24 घंटों के आसपास के लिए हमारी प्रयोगशाला संस्कृति में कोशिकाओं का कहना है. यदि कक्षों की एक विशिष्ट संख्या प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं, अलगाव के बाद, प्रकार द्वितीय कोशिकाओं सीरम मुक्त DMEM में रखा जाता है 75 सेमी 2 बोतल और अगले दिन, कोशिकाओं trypsinized, कर रहे हैं गिना और फिर वरीयता प्राप्त है.
- अगले दिन, मीडिया ताजा सीरम मुक्त (2 मिलीलीटर अच्छी तरह /) DMEM और Bioflex प्लेटों के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं Flexcell FX-5000 तनाव यूनिट में बढ़ रहे हैं. Monolayers कोई अधिक से अधिक 80 से% संगामी प्रयोगों की दीक्षा से पहले होना चाहिए.
- Equibiaxial तनाव झिल्ली के लिए लागू किया जाता है. तनाव का आहार vivo में यांत्रिक बलों के अनुकरण पर निर्भर करता है (चर्चा देखें).
- गैर बढ़ाकर समानांतर में सभ्य झिल्ली पर विकसित कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है.
- प्रयोगों के अंत में, monolayers जीन अभिव्यक्ति पर बदलाव (उदाहरण surfactant प्रोटीन सी के लिए) का विश्लेषण करने के लिए संसाधित किया जा सकता हैइसके अलावा, समय पीसीआर वास्तविक पश्चिमी धब्बा, आदि से प्रोटीन बहुतायत से monolayers immunocytochemistry प्रयोगों के लिए तय किया जा सकता है. इस तकनीक के लिए, निर्धारण के बाद, silastic झिल्ली प्लेटों से बाहर काट रहे हैं और गिलास स्लाइड पर घुड़सवार और एंटीबॉडी के साथ permeabilization ऊष्मायन पहले एक बढ़ते एजेंट के रूप में पानी की 10-20 μl का उपयोग. सतह पर तैरनेवाला भी वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, आदि की उपस्थिति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 चित्रा 2 E18 भ्रूण माउस प्रकार द्वितीय कोशिकाओं के शो प्रतिनिधि चरण विपरीत तस्वीरें इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक का उपयोग अलग है.
चित्रा 3 दर्शाता है कि यांत्रिक तनाव भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर एक मार्कर के रूप में प्रोटीन - सी surfactant के भेदभाव को प्रेरित करता है.
चित्रा 1 प्रतिनिधि.resentative तस्वीर चरण विपरीत भ्रूण प्रकार द्वितीय कोशिकाओं के clumped उपस्थिति दिखाने के अलगाव के बाद लिया है.
चित्रा 2. E18 भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं के रूप में Bioflex laminin साथ लेपित प्लेट पर यहाँ और मढ़वाया वर्णित अलग थे. तस्वीर अगले दिन लिया गया था बाद गैर फैला कोशिकाओं paraformaldehyde में में तय किया गया. कक्षों की पवित्रता से 90 के लिए निर्धारित किया गया था ± उपकला कोशिका और सपा सी के लिए आकारिकी Immunostaining की सूक्ष्म विश्लेषण द्वारा 5%.
चित्रा 3 भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं. 40 चक्र / 16h के लिए मिनट में 5% चक्रीय तनाव से अवगत कराया गया एक) surfactant प्रोटीन सी (सपा सी) mRNA के दिखा रहा है कि तनाव प्रकार द्वितीय सेल भेदभाव विभिन्न substrates के ईसीएम का उपयोग कर लाती अभिव्यक्ति के उत्तरी धब्बा. . + / - लक्षण जोखिम या नहीं प्रतिनिधित्व करते हैंप्रशिक्षित क्रमशः. डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं + / - SEM, n = 3, * पी <0.05) बी प्रतिदीप्ति immunocytochemistry यांत्रिक तनाव को सपा सी भ्रूण प्रकार द्वितीय कोशिकाओं में प्रोटीन (हरा) स्तर उजागर या नहीं (नियंत्रण) का प्रदर्शन छवियों. यह नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained गया. बार, तीन प्रयोगों से 10 माइक्रोन. सी) पश्चिमी धब्बा परिणाम है कि यांत्रिक खिंचाव दिखा सपा - सी प्रोटीन बढ़ जाती है. N = 3 * पी <0.05.
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Discussion
इस पांडुलिपि में, हम एक भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं और fibroblasts अलग और यांत्रिक उत्तेजना Flexcell तनाव उपकरण का उपयोग करने के लिए उन्हें बेनकाब करने की विधि का वर्णन करता है. उपकला कोशिकाओं की भेदभाव 1,2 का आकलन और रिसेप्टर और संकेत खिंचाव 3-9 से सक्रिय रास्ते अध्ययन हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, इस विधि को भी करने के लिए सेल यांत्रिक 10,11 चोट से प्रेरित प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Collagenase के साथ फेफड़े के ऊतकों की पाचन प्रक्रिया पर आधारित है. यह पाचन के बाद एक साथ पेड़ों का झुरमुट प्रकार द्वितीय कोशिकाओं की प्रवृत्ति का लाभ लेता है. इस तकनीक का प्रदर्शन करते हुए महत्वपूर्ण कदम नख़रेबाज़ ऊतक हैं अच्छी तरह से फेफड़े की पाचन और अच्छी तरह से धोने पर 30 और 15 माइक्रोन meshes के गैर फ़िल्टर कोशिकाओं को गैर उपकला कोशिकाओं का निस्पंदन सुविधा और इसलिए प्रकार द्वितीय कोशिकाओं का अधिक से अधिक शुद्धता को प्राप्त करने की सुविधा .
हमारी प्रयोगशाला मीटर का उपयोग करता हैembranes कोलेजन या laminin तहखाने झिल्ली के ईसीएम संरचना अनुकरण के साथ लेपित. हालांकि, जब कोशिकाओं को 20% के बढ़ाव को उजागर कर रहे हैं, कोशिकाओं सब्सट्रेट से खिंचाव के दौरान अलग और fibronectin एक वैकल्पिक सब्सट्रेट के रूप में विचार किया जाना चाहिए हो सकता है.
एक अन्य महत्वपूर्ण विचार के लिए 100% सेल monolayers के संगम खिंचाव से पहले दिया है कि इस सेल करने वाली सेल के बजाय सेल मैट्रिक्स संपर्क संपर्क को बढ़ावा देने और इसलिए हो सकता है कोशिकाओं को 'अर्थ' द्वारा स्थापित बढ़ाव का प्रतिशत नहीं हो सकता है, से बचने के लिए है प्रोटोकॉल.
Flexcell तनाव यूनिट एक निर्वात का उपयोग करता है एक लचीला नीचे संस्कृति थाली ख़राब है. निर्वात केंद्रीय सिलेंडर पद के आवेदन पर प्रत्येक झिल्ली फैला है, झिल्ली सतह भर में एक समान रेडियल और परिधीय तनाव पैदा और इसलिए vivo में स्थितियों में equibiaxial बढ़ाव, प्रदान करने के लिए इसी तरह (कार्टून, योजनाबद्ध सिंहावलोकन वीडियो देखने के लिए, अनुमति के साथ, डॉ. ए जे banes फ्लेक्ससेल इंटरनेशनल कॉर्पोरेशन, www.flexcellint.com). इस प्रणाली को निर्दिष्ट तनाव आहार द्वारा एक परिभाषित, नियंत्रित स्थिर या चक्रीय विरूपण प्रदान करता है. भ्रूण साँस लेने की गतिविधियों की नकल 40-60 चक्र / मिनट पर एक चक्रीय 2.5-5% खिंचाव के बीच खिंचाव आहार लागू किया जाता है. बढ़ाव के प्रतिशत पर समझौता नहीं है कि भ्रूण साँस लेने के दौरान भ्रूण फेफड़ों होश. कुछ लेखकों का मानना है कि 5% बढ़ाव उपयुक्त 12 है जबकि अन्य जांचकर्ताओं का कहना है कि 2.5% और vivo में 13,14 स्थितियों में की प्रतिनिधि है. करने के लिए लगातार बढ़ाव दबाव के अनुकरण के लिए, एक 2.5% निरंतर खिंचाव प्रोटोकॉल प्रयोग किया जाता है. फेफड़ों की चोट की नकल करने के लिए, 20% 40 चक्र / मिनट में चक्रीय खिंचाव प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक के संभावित सीमाओं लोड हो रहा है पोस्ट करने के लिए परिधीय झिल्ली के क्षेत्र में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के विरूपण की वृद्धि शामिल हैं. एक और सीमा असमर्थता बढ़ाव से अधिक 15-20% प्रदान करने के लिए अगर एक उच्च चक्र दर प्रयोग किया जाता है (40 चक्र / मिनट के ऊपर है).
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
NIH अनुदान HD052670 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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