Summary
VisioTracker представляет собой автоматизированную систему для количественного анализа визуального представления личинок и взрослых рыб небольших основан на регистрации движений глаз. К услугам гостей полный контроль над визуальными свойствами стимулов и анализ в реальном времени, обеспечивая высокую пропускную исследований в таких областях, как визуальная система развития и функции, фармакологии, исследований нейронные цепи и сенсомоторной интеграции.
Abstract
Расследование визуальной разработки системы и функции необходимость количественной модели поведения визуального представления, которые легко выявить, надежные и простые манипулировать. Подходящая модель была найдена в оптокинетических ответ (ОКР), рефлексивное поведение присутствует во всех позвоночных из-за его высокой стоимости выбор. ОКР включает в себя медленный стимул следующих движений глаз чередуются с быстрым сбросом саккад. Измерение такого поведения легко осуществляется у рыбок данио личинки, в связи с его ранней и стабильной начала (полностью разработаны через 96 часов после оплодотворения (HPF)), и извлечение преимуществ из глубоких знаний о генетике рыбок данио, на протяжении десятилетий одной из благоприятствования модели организмов в этой области. Между тем анализ аналогичных механизмов у взрослых рыб приобрел значение, особенно для фармакологических и токсикологических приложений.
Здесь мы опишем VisioTracker, полностью автоматизированные, высокой throughpuТ-системы для количественного анализа визуального представления. Система основана на исследованиях, проведенных в группе профессора Стефана Neuhauß и был вновь разработанные системы TSE. Он состоит из иммобилизации устройство для мелкой рыбы контролируется высококачественного видео камеры с высоким разрешением зум-объектив. Рыба контейнер находится в окружении барабан экран, на котором компьютерные модели стимула может проецироваться. Движения глаз, фиксируются и автоматически анализирует пакет VisioTracker программного обеспечения в режиме реального времени.
Анализ данных позволяет немедленное признание таких параметров, как медленные и быстрые фазы продолжительность, частота движения цикла, медленные фазы усиления остроты зрения и контрастной чувствительности.
Типичные результаты позволяют, например, быстрой идентификации визуального мутантов системы, которые показывают без видимых изменений в морфологии дикий тип, или определение количественного эффекта фармакологических или токсических и мутагенныхАгенты по визуальной производительности системы.
Protocol
1. Разведение рыбы
Эмбрионы были сохранены и вырос в стандартных условиях (марка 2002) и поставленный по развитию дней после оплодотворения (DPF). Взрослые и личинок на 5 DPF были использованы для измерений.
2. Экспериментальная процедура
- Подготовка инструмента
Личинки: личинки рыб были встроены в 3% подогретого (28 ° C), метилцеллюлоза, чтобы предотвратить движения тела. Эмбрионы были размещены спинной стороне в VisioTracker, с видом на проектирование экрана. Взрослые рыбы: Рыба была кратко наркозом в дозе 300 мг / л MS-222, вставляется в устройство иммобилизации и помещен в VisioTracker. Перед началом измерений были начаты, они остались для восстановления в течение 1-2 мин.
- Поколение стимул моделей
Стимул шаблоны, состоящие из вертикальных черно-белых синусоидальной решетки вращаются вокруг рыбы были созданыс помощью собственного программного пакета. Они могут быть модулированной через пакет программного обеспечения в соответствии с формой волны, контрастность, интенсивность, угловой скорости и пространственных частот. Модели были проецируется на экран с помощью цифрового проектора свет, содержащиеся в VisioTracker. Примерное расстояние между глазами рыбы, и на экране составила 4,5 см, а размер проецируемого изображения на экране была 360 градусов по горизонтали и 55 град по вертикали. Для личинок рыб, направление стимуляции был изменен с частотой 0,33 Гц для уменьшения саккады частоты. Взрослые рыбы были стимулированы однонаправленно, и только глаза стимулируется в височно-на-носовой направление считалось, поскольку носовые к временным глазу скоростью в целом значительно ниже и менее постоянным (см. Мюллер и Neuhauß, 2010).
- Запись движений глаз
Светлое поле изображением головы рыбы подают в инфракрасной видеокамерой. Инфракрасная подсветка рыбы была осуществлена FROM ниже. Камера записанных изображений со скоростью 5 кадров / сек (личинки) или 12,5 кадров / сек (для взрослых), соответственно. Изображения обрабатываются автоматически, исправленное и сглаженные формы для глаз. Глаз ориентацию по отношению к горизонтальной оси, затем определяется автоматически и глаз скорость рассчитывается по собственной пакет программного обеспечения. Малые движения рыбы автоматически корректируется на программное обеспечение. Все записи и анализа была достигнута в режиме реального времени.
3. После обработки экспериментальных данных
- Сырые измерения скоростей глаза были отфильтрованы для саккад, чтобы извлечь медленно фазовой скорости.
- Саккады-фильтром кривым глазом скорости были сглажены скользящей средней с раздвижным окном 7 кадров.
- Глаз скорость была усредненная кадров с одинаковыми условиями стимул.
- Для личинок рыб, глаза скорость была усредненная оба глаза.
4. Представитель результаты:
Для данио рерио личиночной, бампер мутант был выбран. В этом мутант, эпителиальных клеток hyperproliferate, что приводит к уменьшению размеров объектива и внематочная расположение объектива. Эти морфологические изменения отражаются значительное снижение контрастной чувствительности и остроты зрения (Schonthaler и соавт., 2010). На рисунке 1 показано различие в контрастной чувствительности бампер мутантов по сравнению с диким типом братьев и сестер. Бампером мутантов больше не смогут приспособиться глаз скорость по мере уменьшения стимула контраст. По аналогии, когда стимул пространственных частот увеличивается, то есть ширина полосы стимула снижается, бампер мутантов также демонстрируют снижение остроты зрения (рис. 2)
Зависимость взрослых данио рерио видеотехникал производительностью от условий окружающей среды была исследована путем воздействия на рыбу в той или иной концентрации алкоголя в их бак для воды в течение 30 минут, а затем измерения оптокинетических ответа при различных условиях стимула. Взрослые данио рерио показывают заметное снижение контрастной чувствительности, когда поддерживается в увеличении концентрации алкоголя (рис. 3). Аналогичное дозозависимое снижение общей скорости глаз в широком диапазоне пространственных частот можно наблюдать, когда рыба обрабатывались с увеличением концентрации алкоголя (рис. 4). Лечение алкоголизма Кроме того, в зависимости от дозы снижает глазодвигательных производительность при более сложных задач на примере увеличения скорости стимула (рис. 5).
Рисунок 1. Данио рерио личиночной скорость глаз зависит от стимула контраст. 10 бампера мутантов и 10 дикого типа братья и сестры были проанализированы на 5 DPF при изменяющихся с timulus условиях полосой контраст. График показывает среднюю скорость глаза ± 1 SEM.
Рисунок 2. Данио рерио личиночной скорость глаз зависит от пространственной частоты. 10 бампера мутантов и 10 дикого типа братья и сестры были подвергнуты различной шириной полосы стимулов в 5 денье и анализировали, как описано. График показывает среднюю скорость глаза ± 1 SEM.
Рисунок 3. Взрослых данио рерио шоу концентрации алкоголя-зависимое снижение контрастной чувствительности. Взрослые данио рерио были сохранены в той или иной концентрации алкоголя, как указано в течение 30 минут и проанализированы при различных стимулов условиях полосой контраст. График показывает среднюю временную к носовой глаза скорости ± 1 SEM из 9 рыбы в группе (за исключением контрольной группы: N = 11).
E 4 "SRC =" / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Взрослых данио рерио шоу алкоголя зависимости от концентрации снижение общего движения глаз в широком диапазоне стимула ширина полосы. Взрослые данио рерио были сохранены в той или иной концентрации алкоголя, как указано в течение 30 минут и проанализированы при различных стимулов условиях полосой шириной. График показывает среднюю временную к носовой глаза скорости ± 1 SEM из 9 рыбы в группе (за исключением контрольной группы: N = 11).
Рисунок 5. Взрослых данио рерио шоу алкоголя зависимости от концентрации снижение общего движения глаз в широком диапазоне стимула скорости. Взрослые данио рерио были сохранены в той или иной концентрации алкоголя, как указано в течение 30 минут и проанализированы при различных условиях стимул скорости. График показывает среднюю временную к носовой глаза скорости ± 1 SEM из 9 рыбы в группе (за исключением контрольной группы:n = 11).
Discussion
Важность ОКР для исследования зрительных функций было признано в научном сообществе в течение длительного времени (Пасха и 1996 Nicola, 1997), и попытки по-настоящему количественной парадигме начались более десяти лет назад. Пасха и Николя (1996) разработана система с моторизованные вращающиеся барабаны полосатые, где видеозапись движения глаз были проанализированы вручную. Эта система страдает от отсутствия иммобилизации эмбрионов рыб, которые требуют частой эксплуатации репозиционирование, и может обнаружить отслеживания движений глаз лишь с большим трудом. Шагом вперед стало использование видео-полосатый барабан прогнозируемых в целях обеспечения более переменных компьютерной презентацией стимула (Roeser и Байер, 2003;. Rinner и др., 2005a).
Главным образом вручную кадр за кадром анализ видеозаписей записи оказалось чрезвычайно трудоемким, и в определенной степени препятствует наблюдателя смещения (Beck и соавт.,2004). Автоматизированный анализ в режиме реального времени было предложено разрешить использование поведенческой обратной связи обучения механизмов (Major и соавт., 2004). Использование инфракрасной подсветкой и регулируемой частотой вращающегося раздражители была пионером Beck и соавт. (2004). Тем не менее, система, описанная там использовался только для личинок, а также анализ был проведен в автономном режиме. Кроме того, VisioTracker позволяет осуществлять полный контроль над стимулами, включая изменение стимула в ходе эксперимента, что позволяет большую гибкость и спонтанное влияние на ход эксперимента. Кроме того, создание цифрового стимул используется VisioTracker преодолел проблемы, упомянутые ранее, с ускорением инертная масса полосатый барабан стимулом (Beck и соавт., 2004).
Личинки сдержанность метилцеллюлоза существенно не мешать движению глаз и не имеет никаких долгосрочных последствий для рыбок данио благополучия. Личинок рыб были успешноподдерживаются встроенные в метилцеллюлозы в течение нескольких дней, пока кислород через кожу становится недостаточным для спроса с увеличением возраста (Qian и соавт., 2005).
Сдерживающих взрослых рыб методом одинаково легко на животных. Короткая продолжительность эксперимента, в сочетании с возможностью быстрого обмена испытаний на животных для другой, далее добавляет к положительным животных аспектов системы. Так как жабры постоянно вспыхнул водой, удобно всплеск воды с любыми химическими выбором для изучения его влияния на движения глаз и визуальное исполнение. Точно так же вымывания эксперимента могут быть добавлены без необходимости обращаться с животными между экспериментами.
Пиксель шума в кадре была сведена к минимуму путем сглаживания алгоритмы проприетарное программное обеспечение VisioTracker, что позволяет очень точно измерить положение глаз и угловой скорости. Кроме того, для облегчения статистическихАнализ, программного обеспечения отфильтровываются скачкообразных движений, которые происходят при фиксированной скорости и не вносят вклад в экспериментальную заявлении. Усреднение скорости кривых над 7 кадров видео способствовала последующего анализа.
VisioTracker открывает новое измерение для многих различных областях исследований. Система и ее предшественников уже были успешно использованы для количественной визуальное представление у рыбок данио личинки, используя такие параметры, как острота зрения, контрастная чувствительность и легкой адаптации (Rinner и соавт., 2005a, Schonthaler и соавт., 2010), по функциональному анализу конуса фоторецепторов следующие манипуляции членов визуального каскада трансдукции (например, Rinner и др., 2005b, Реннингер и др., 2011.)., или анализ визуальных дефектов в мутанта личинки данио (например, Schonthaler и др., 2005, 2008;. Bahadori и соавт., 2006). Взаимозависимости морфологического и функционального созревания зрительной системыбыла изучена ОКР измерения показывают, что острота зрения в основном, но не полностью ограничено фоторецепторов расстояние в личиночной стадии (Хауг и соавт., 2010).
VisioTracker одинаково подходит для анализа зрительной функции у взрослых данио рерио и других аналогичных размеров видов рыб (Мюллер и Neuhauß (2010), настоящего доклада).
Возможно также использовать систему в исследованиях таких областях, как токсикология и фармакология которого вещества, которые будут исследованы могут быть добавлены в поток воды окружающих взрослых жабры рыб. Кроме того, универсальность VisioTracker позволяет более тщательный анализ для примера ontogenetics зрительной функции, нейронные функции цепи и развития, или сенсомоторного контроля (см. обзор в Huang и Neuhauß, 2008).
Disclosures
Оливер DR Schnaedelbach и Хольгер D. Russig являются сотрудниками TSE Systems GmbH, которая производит зрительной системы отслеживания производительности, используемые в этой статье. Производство этой статье был организован TSE Systems GmbH. Стефан CF Neuhuass является сотрудником Университета Цюриха, который получает вознаграждение от системы TSE для каждой системы продаются.
Acknowledgments
KPM была поддержана ЕС FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
- Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome. Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).
- Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms. Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).
- Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. Zebrafish, Practical Approach Series. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Visual acuity in zebrafish: behavior and histology. Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).
- Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).
- Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).
- Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish. Zebrafish. 2, 189-196 (2005).
- Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae. Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).
- Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).
- Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).
- Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles. Development. 135, 387-399 (2008).
- Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness. Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).
- Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision. Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).
