Summary
Den VisioTracker är ett automatiserat system för kvantitativ analys av visuella prestanda larver och små vuxna fiskar baserad på registrering av ögonrörelser. Den har full kontroll över visuella stimulans egenskaper och analys i realtid, vilket möjliggör hög kapacitet forskning inom områden som visuellt systemutveckling och funktion, farmakologi, neurala studier krets och sensomotoriska integrationen.
Abstract
Utredningar det visuella systemet utveckling och funktion kräver kvantifierbara beteendemodeller av visuell prestanda som är lätta att framkalla, robust och enkel att hantera. En lämplig modell har hittats i optokinetic responsen (OKR), en reflexiv beteende i alla ryggradsdjur på grund av sin höga val värde. Den OKR innebär långsamma stimulus-följande rörelser ögonen varvat med snabba återställning saccades. Mätningen av detta beteende lätt utförs i zebrafisk larver på grund av sin tidiga och stabila debut (fullt utvecklad efter 96 timmar efter befruktning (HPF)), och som omfattas av den ingående kunskap om zebrafisk genetik, under årtionden en av de gynnade modellen organismer i detta område. Samtidigt analys av liknande mekanismer i vuxen fisk har blivit allt viktigare, särskilt för farmakologiska och toxikologiska tillämpningar.
Här beskriver vi VisioTracker, ett helautomatiskt med hög throughput-system för kvantitativ analys av visuella prestanda. Systemet är baserat på forskning som utförts i gruppen professor Stephan Neuhauss och ny utformning av TSE Systems. Den består av en immobiliserande anordning för små fiskar övervakas av en högkvalitativ videokamera utrustad med en högupplösande zoomobjektiv. Fisken behållaren omges av en trumma skärm, på vilken datorgenererade stimulusmönster kan projiceras. Ögonrörelser registreras och automatiskt analyseras av VisioTracker mjukvarupaket i realtid.
Dataanalys kan omedelbart erkännande av parametrar såsom långsam och snabb fas varaktighet, rörelse cykel frekvens, långsam fas vinst, synskärpa och kontrastkänslighet.
Typiska resultat kan till exempel snabb identifiering av visuella systemet mutanter som visar någon uppenbar förändring av vildtyp morfologi, eller fastställandet av kvantitativa effekter av farmakologisk eller giftiga och mutagenaagenter på visuella prestanda.
Protocol
1. Uppfödning av fisk
Embryon hölls och uppvuxen under normala omständigheter (Brand 2002) och stegvis enligt utvecklingen i dagar efter befruktning (DPF). Vuxna och larver vid 5 dpf utnyttjades för mätningar.
2. Experimentellt förfarande
- Framställning av instrument
Larver: fisklarver bäddades in i 3% förvärmd (28 ° C) metylcellulosa att förhindra kroppsrörelser. Embryona placerades ryggsidan upp i VisioTracker, inför den utskjutande skärmen. Vuxen fisk: Fisk var kort bedövas i 300 mg / l MS-222, passas in i immobiliseringsanordningen och placeras i VisioTracker. Innan mätningarna inleddes, var de kvar för att återhämta sig under 1-2 minuter.
- Generering av stimulans mönster
Stimulans mönster bestående av vertikala svart-vitt sinus-våg gitter roterande runt fisken skapadesmed hjälp av egenutvecklade programvara paketet. De kan vara moduleras genom programpaketet enligt vågform, kontrast, intensitet, vinkelhastighet och rumslig frekvens. Mönster har projiceras på skärmen med hjälp av en digital ljusprojektor som finns i VisioTracker. Det ungefärliga avståndet mellan fiskens öga och skärmen var 4,5 cm och projektion storlek på skärmen var 360 grader horisontellt och 55 deg vertikalt. För larver fisk, var riktningen för stimulering ändras med en frekvens av 0,33 Hz för att minska frekvensen saccade-rörelser. Vuxen fisk stimulerades riktning och bara ögat stimuleras timliga till nasal riktning ansågs då nasal till temporal ögon hastighet i allmänhet är betydligt lägre och mindre konstant (se Mueller och Neuhauss, 2010).
- Inspelning av ögonrörelser
En ljus-fält bild av fiskens huvud matades till en infraröd videokamera. Infraröd belysning av fisk utfördes from nedan. Kameran inspelade bilder med en hastighet av 5 bilder / sekund (larver) eller 12,5 bildrutor / sekund (vuxna), respektive. Bilderna bearbetas automatiskt, korrigeras och jämnas till ögonform. Eye orientering i förhållande till den horisontella axeln bestämdes sedan automatiskt och ögon hastighet beräknades genom den egenutvecklade programvaran. Små rörelser fisken automatiskt korrigeras av programvaran. All registrering och analys uppnåddes i realtid.
3. Post-experimentella databehandling
- Råa mätningar av ögat hastigheter filtrerades för saccade-rörelser för att extrahera långsamt fashastigheten.
- Saccade-rörelser-filtrerade öga hastighet kurvor jämnas med ett löpande medelvärde med ett glidande fönster på 7 ramar.
- Eye hastighet var medelvärde över ramar med samma stimulans förhållanden.
- För larver fisk, var öga hastighet genomsnitt över båda ögonen.
4. Representativa resultat:
För larver Zebrafish var stötfångaren mutanten väljs. I denna mutant, linsepitelceller hyperproliferate, vilket leder till minskad lins storlek och ektopisk placering av linsen. Dessa morfologiska förändringar reflekteras av en betydande minskning av kontrast känslighet och synskärpa (Schonthaler et al., 2010). Figur 1 visar skillnaden i kontrast känslighet stötfångaren mutanter jämfört vildtyp syskon. Stötfångare mutanter allt misslyckas att justera ögat hastighet som minskar stimulans kontrast. Analogt, när stimulus spatiala frekvensen ökas, dvs stimulans strimlingsstorlek minskas, likaså stötfångare mutanter visas hur nedsatt synskärpa (fig 2)
Beroendet av vuxna Zebrafish visuaL prestanda på miljöförhållanden undersöktes genom att utsätta fisken för varierande koncentrationer av alkohol i tank vatten i 30 minuter och därefter mäta optokinetic svaret under varierande stimulans förhållanden. Vuxen Zebrafish visar en markant reduktion i kontrast känslighet när bibehålls i ökande alkoholkoncentrationer (Fig. 3). En liknande dosberoende minskning av den totala öga hastighet över ett brett område av spatiala frekvenser kunde observeras när fisken behandlades med ökande koncentrationer alkohol (fig 4). Alkohol behandling dessutom dosberoende minskar ögonmuskelförlamningar prestanda till mer krävande uppgifter som exemplifieras av ökade stimulanspaket hastigheter (Fig. 5).
Figur 1. Zebrafish larver öga hastighet är beroende av stimulans kontrast. 10 stötfångare mutanter och 10 vildtyp syskon analyserades vid 5 dpf under varierande s timulus rand kontrast förhållanden. Grafen visar genomsnittlig öga hastighet ± 1 SEM.
Figur 2. Zebrafish larver öga hastighet är beroende av rumslig frekvens. 10 stötfångare mutanter och 10 vildtyp syskon utsattes för olika bredder stimulans rand vid 5 dpf och analyserades såsom beskrivits. Grafen visar genomsnittlig öga hastighet ± 1 SEM.
Figur 3. Vuxen Zebrafish visar alkohol koncentrationsberoende minskning i kontrast känslighet. Vuxen Zebrafish hölls i varierande koncentrationer alkohol som anges för 30 minuter och analyserades under varierande kontrast stimulans rand förhållanden. Diagrammet visar den genomsnittliga temporala till nasal öga hastighet ± 1 SEM av 9 fiskar per grupp (utom kontrollgrupp: n = 11).
e 4 "src =" / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg "/>
Figur 4. Vuxen Zebrafish visar alkohol koncentrationsberoende minskning av den totala ögonrörelse över ett brett spektrum av stimuli rand bredd. Vuxen Zebrafish hölls i varierande koncentrationer alkohol som anges för 30 minuter och analyserades under varierande bredd stimulans rand förhållanden. Diagrammet visar den genomsnittliga temporala till nasal öga hastighet ± 1 SEM av 9 fiskar per grupp (utom kontrollgrupp: n = 11).
Figur 5. Vuxen Zebrafish visar alkohol koncentrationsberoende minskning av den totala ögonrörelse över ett brett spektrum av stimulans hastigheter. Vuxen Zebrafish hölls i varierande koncentrationer alkohol som anges för 30 minuter och analyserades under olika driftförhållanden stimulans hastighet. Diagrammet visar den genomsnittliga temporala till nasal öga hastighet ± 1 SEM av 9 fiskar per grupp (utom kontrollgruppen:n = 11).
Discussion
Betydelsen av OKR för studier av synfunktionen har erkänts i det vetenskapliga samfundet under en längre tid (påsk & Nicola 1996, 1997), och försök att verkligen kvantifiera paradigm har börjat långt över ett decennium sedan. Påsk och Nicola (1996) utvecklat ett system med motoriserad roterande randiga trummor, där videoinspelning av ögonrörelser analyserades manuellt. Detta system drabbats av bristen på immobilisering av fisk embryot, som ofta har krävt manuell ompositionering och kunde detektera spårning rörelser ögon endast med stor svårighet. Ett steg framåt att använda en video-projicerad randig trumma för att möjliggöra mer varierande genererade dator stimulans presentation (Roeser & Baier, 2003,. Rinner et al, 2005a).
Den mest manuella, ram-för-bildruta analys av videoinspelade inspelningar har visat sig vara extremt arbetskrävande, och i viss mån hindras av observatör bias (Beck et al.2004). Automatiserad analys i realtid föreslogs att tillåta användning av beteendemässiga återkopplingsmekanismer lärande (Major et al., 2004). Användningen av infraröd belysning och frekvensstyrda roterande stimuli har banat väg genom Beck et al. (2004). Emellertid beskrivna systemet finns endast har använts för larver, och analys genomfördes off-line. Vidare medger VisioTracker fullständig kontroll över stimuli, däribland att ändra stimulans under experimentet, varigenom större flexibilitet och spontan inflytande på förloppet av experimentet. Dessutom, övervann digitala stimulans skapas som används av VisioTracker problem nämnts tidigare med acceleration av inerta massan av en randig stimulans trumma (Beck et al., 2004).
Larver återhållsamhet med metylcellulosa inte signifikant stör ögonrörelser och inte har några långsiktiga effekter på zebrafisk välbefinnande. Fiskyngel har framgångsriktupprätthålls inbäddade i metylcellulosa under flera dagar, tills syretillförsel genom huden blir otillräcklig för efterfrågan med stigande ålder (Qian et al., 2005).
De vuxna fiskarna återhållande metod är lika lätt på djuret. Den korta tid försöket, tillsammans med möjligheten att snabbt byta ut försöksdjur för en annan en, bidrar ytterligare till den positiva djurskyddsaspekterna av systemet. Eftersom gälarna kontinuerligt spolas med vatten, är det lämpligt att spika vattnet med någon kemikalie val att studera dess effekt på ögonrörelser och visuell prestanda. Likaså en wash-out experiment kan tillsättas utan att man behöver hantera djuret mellan experimenten.
Pixel brus i videobilden minimerades genom utjämning algoritmer den egenutvecklade VisioTracker programvara som möjliggör mycket exakta mätningar av ögats position och vinkelhastighet. Vidare, för att underlätta en statistiskanalys programvara filtreras bort saccadic rörelser som uppstår vid fasta hastighet och inte bidrar till den experimentella uttalande. En utjämning av hastighet kurvor över 7 videobildrutor underlättas senare analys.
Den VisioTracker öppnar en ny dimension för många olika forskningsområden. Systemet och dess föregångare redan har använts med framgång för att kvantifiera visuella prestanda i zebrafisk larver, med parametrar som synskärpa, kontrast känslighet och lätta anpassning (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), för funktionell analys av kon fotoreceptorer efter manipulation av medlemmarna i den visuella transduktion kaskad (t.ex. Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011.)., eller analys av visuella defekter i mutant zebrafisk larver (t.ex. Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). Samspelet av morfologiska och funktionella mognaden av det visuella systemethar studerats av OKR mätningar som visar att synskärpan huvudsakligen men inte helt begränsas av fotoreceptor avstånd i larvstadier (Haug et al., 2010).
Den VisioTracker passar lika bra att analysera visuell funktion i vuxen zebrafisk och andra liknande storlek fiskarter (Mueller och Neuhauss (2010), denna rapport).
Det är också tänkbart att använda systemet i forskningsområden som toxikologi och farmakologi där ämnen som skall undersökas kan läggas till vattenflödet kring de vuxna fiskarna gälarna. Dessutom möjliggör mångsidighet VisioTracker mer noggranna analyser av till exempel ontogenetics av synfunktionen, neurala kretsen funktion och utveckling, eller sensomotoriska kontroll (se recension i Huang & Neuhauss, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach och Holger D. Russig är anställda av TSE Systems GmbH som producerar det visuella systemets prestanda spårning används i denna artikel. Produktion av den här artikeln var sponsrad av TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass är anställd vid universitetet i Zürich, som erhåller ersättning från TSE Systems för varje sålt system.
Acknowledgments
KPM stöddes av EU FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
- Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome. Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).
- Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms. Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).
- Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. Zebrafish, Practical Approach Series. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Visual acuity in zebrafish: behavior and histology. Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).
- Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).
- Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).
- Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish. Zebrafish. 2, 189-196 (2005).
- Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae. Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).
- Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).
- Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).
- Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles. Development. 135, 387-399 (2008).
- Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness. Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).
- Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision. Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).
