Summary
MALDI-TOF massespektrometri var vellykket brukt til å overvåke amid hydrogen / deuterium utveksling i protein kinase Pak2 aktivering.
Abstract
Amid hydrogen / deuterium utveksling (H / D utveksling) kombinert med massespektrometri har vært mye brukt til å analysere grensesnittet til protein-protein interaksjoner, protein bygningsmessige endringer, protein dynamikk og protein-ligand interaksjoner. H / D utveksling på ryggraden amid stillingene har vært brukt til å måle deuteration satser på mikro-regioner i et protein ved massespektrometri 1,2,3. Oppløsningen på denne metoden avhenger pepsin fordøyelsen av deuterert protein av interesse til peptider som normalt spekter 3-20 rester. Selv om oppløsningen av H / D utveksle målt ved massespektrometri er lavere enn én rester oppløsningen målt ved heteronukleære Enkelt Quantum Coherence (HSQC) metode for NMR, den massespektrometri måling i H / D utveksling er ikke begrenset av størrelsen på protein 4. H / D utveksling er utført i en vandig løsning som opprettholder protein konformasjon. Vi tilbyr en metode som utilizes den MALDI-TOF for deteksjon 2, i stedet for en HPLC / ESI (electrospray ionisering)-MS system 5,6. Den MALDI-TOF gir nøyaktige masse intensitet data for peptider av fordøyd protein, i dette tilfellet protein kinase Pak2 (også kalt γ-Pak). Proteolyse av Pak 2 er utført i en frakoblet pepsin fordøyelsen. Denne alternative metoden, når brukeren ikke har tilgang til en HPLC og pepsin kolonne koblet til massespektrometri, eller når pepsin kolonnen HPLC ikke resulterer i en optimal fordøyelse kart, for eksempel tungt disulfide-limt secreted fosfolipase A 2 (SPLA 2). Benytte denne metoden, vi lykkes overvåkes endringer i deuteration nivået under aktiveringen av Pak2 av caspase 3 cleavage og autophosphorylation 7,8,9.
Protocol
1. Pak2 Activation
- Legg den aktuelle pre-testet mengde caspase 3-20 mL av 12 mg / ml Pak2 i buffer A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, og 2 mM DTT ved pH 7,5) og Inkuber ved 34 ° C i 30 min å fullt ut holde seg og aktivere Pak2.
- Analyser cleavage produkter ved SDS-PAGE (10%) og Coommassie blå flekker.
- Legg til spaltes Pak2 til aktivering buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) ved pH 7,5, i 20 mL til en endelig konsentrasjon på 10 mg / ml Pak2, og inkuber på 34 ° C i 30 min til fullt aktivere Pak2 av autophosphorylation på 8 steder.
- Bekreft fulle spalting av Pak2 ved migrasjon av P34 og P27 fragmenter som bestemmes av SDS-SIDE 10. Riktig verifisering av autophosphorylation forholdene er gjort via autoradiografi i et eget eksperiment ved hjelp av (32 P) ATP eller massespektrometri å oppdage phosphopeptides.
2. Identifikasjonav Pepsin-samleversjon Pak2 Fragments
- Tilsett 1 ml av 0,1% Trifluroacetic Acid (TFA) ved pH 2,5 til vaske agarose perler to ganger før bruk. Så, sentrifuger prøvene for 15 sek ved 2000 xg å fjerne perlene.
- Legg Pak2 (20 mikrogram i 2 mL på 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl og 2 mM DTT ved pH 7,5) til 100 mL av 0,1% TFA, og inkuber prøven for 5 min med 30 mL av pepsin-konjugert agarose perler .
- Stabilisere seg en omvendt fase HPLC C18 kolonne med en primær løsemiddel system på 0,1% TFA ved pH 2,5. Den pepsin fordøye (50 mL) er elueres ved hjelp av en lineær 100-min gradient fra 0 - 80% acetonitril som inneholder 0,1% TFA ved en vannmengde på 0,2 ml / min. Fraksjoner blir samlet inn hvert 2 min.
- Tørk HPLC fraksjoner med en hastighet-Vac (3 t) og resuspender prøvene i en løsning av acetonitril (5 mL) og 0,1% TFA (5 mL) ved pH 2,5.
- I utgangspunktet er hver brøkdel screenes for peptider med MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA).
- De 16 fraksjoner som inneholder peptider er utsatt for tandem massespektrometri med en Q-TOF massespektrometer og et QSTAR XL oMALDI MS / MS å identifisere fragmenter.
- Sekvensen av hvert peptid er bekreftet av produktet ioner generert av tandem massespektrometri med den teoretiske m / z forholdstall basert på den primære sekvensen av Pak2 bruker Protein Prospector nettsted ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. Måling av amid H / D Utveksling
- Hold alle løsninger og reagenser som trengs for H / D utveksling ved 25 ° C i vannbad. ATP er oppløst i vann og pH er justert til 7,0 før bruk. Den ekstra 4mm ATP i D 2 O buffer er å hindre ATP skilt fra Pak2 etter fortynning.
- Iverksette H / D utveksling ved tilsetting av 18 mL av buffered D 2 O (50 mM mopper pH 6,98, 125 mM NaCl) til 2 mL (20 mikrogram) Av Pak2 i en buffer som inneholder 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 2 mM DTT, resulterer i en Pak2 nivå på 10 mg / ml og en pH på 7,0 ved 0 ° C.
- Inkuber prøvene i tre eksemplarer i H / D bytte for 0, 0,5, 1, 3, 5 og 10 min, eller 24 h.
- Slukke H / D utveksling prosessen ved å legge til 180 mL av iskald 0,1% TFA på 2,2 pH, som bringer pH til 2,5 i en endelig volum på 200 mL. For prøvene inneholder ATP, 180 mL av iskald 0,11% TFA ved pH 2.2 er brukt for å opprettholde pH på 2,5 i slukket tilstand.
- Legg til en delmengde (100 mL) av hvert slukket prøve til 30 mL av aktivt pepsin-konjugert agarose perler. Den pepsin fordøyelse er lov til å fortsette på is i fem min og prøvene er vortexed hvert 30 sek.
- Avslutt fordøyelsen ved sentrifugering av prøven for 15 sek ved 5000 xg ved 4 ° C for å fjerne pepsin.
- Raskt fryse prøvene i flytende N 2 og oppbevar ved -80 ° C for ikke mer enn 2dager før MALDI-TOF analyse.
- Matrisen for MALDI er 5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) oppløst i en løsning (01:01:01) av acetonitril, etanol og 0,1% TFA ved pH 2,5 og holdt ved 0 ° C.
- Delvis tine hver prøve raskt og bland 1 mL av hver prøve med 1 mL av matrise og flekk på en 4 ° C MALDI sikteplate.
- Påfør en moderat vakuum til plate å tørke flekker i 30 sek før MALDI-TOF analyse. Tiden mellom tining av prøven og spektrum henting er ca 3 min.
- Acquire MALDI-TOF masse spektra med PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Skaffe data på en 2-GHz samplingsfrekvens på 100 000 data-kanaler, med en 20.000-V akselererende spenning, og en 65% grid spenning med forsinket ekstraksjon med en 180-ns puls forsinkelse. Ett hundre skanninger gjennomsnitt i 2 min. Den MALDI-TOF instrument er ikke begrenset til merke eller noen spesiell programvare.
- Bruk av data Explorer 4.0 dataprogram til calculspiste deuteration av hvert fragment.
- Beregn ryggen utveksling basert på forholdet mellom den faktiske innlemmet deuteron nummer ved 24-timers av H / D utveksle delt på alle mulige utskiftbare områder, som er ryggraden amider unntatt N-terminal amid (Figur 1).
Fire. Representant Resultater:
Den caspase cleavage og autophosphorylation er verifisert av SDS-PAGE Commassie farging. Inaktive Pak2 er en enkelt bånd av 58 kDa. Caspase spalting av Pak2 er fullført, og produserer to fragmenter, P27 og P34 som vandrer separat. Migrering av autophosphorylated P27 og P34 viser en overlapping på gel på grunn av den tilbakestående migrasjon av det fullt fosforylert p27 fragment (figur 2).
H / D utveksling eksperimenter blir utført flere ganger mellom 0 og 10 min (figur 3). Som et eksempel, den tiden løpet av deuterium innlemmelse i m / ZPEAK 1697,85 inaktive Pak2 består av flere isotoper topper som vist ved forskyvning av massen konvolutten over tid.
Figur 1. Likning for beregning av deuteration.
Figur 2. Autophosphorylation og caspase spalting av Pak2. Caspase-kløyvde Pak2 (venstre felt), intakt inaktive Pak2 (midtre kjørefelt) og caspase-kløyvde autophosphorylated Pak2 (høyre felt) ble analysert ved SDS-PAGE og Coommassie blå flekker. Tilpasset fra Hsu, YH et al 2.
Figur 3. Mass spekteret av en tid i løpet av deuterium innlemmelse for inaktive Pak2. Inaktive Pak2 ble utsatt for H / D exchange for 00-10 min og analyseres av MALDI-TOF. Et eksempel på den utvidede isotopiske distribusjon av MALDI-TOF av peak m / z 1697,85 løpet av den tiden løpet av H / D utveksling vises. Den stiplede røde linjen angir gjennomsnittet av massen konvolutten og skiftet av massen konvolutten viser deuteration av et peptid.
Discussion
Identifikasjon av Pepsin-samleversjon Fragmenter er et kritisk trinn i H / D utveksling eksperiment. Feil identifikasjon av peptid kan føre til en feil konklusjon. Pepsin-fordøyd Pak2 er elueres gjennom en omvendt fase HPLC C18 kolonne for å få en ren bakgrunn. I våre forsøk var totalt 40 fraksjoner samles inn og utsatt for MALDI-TOF. Flere peptider kan identifiseres i hver av fraksjonene. Den peptider ble utsatt for tandem massespektrometri (Q-TOF MS / MS og oMALDI MS / MS) for å identifisere sine sekvenser. MS / MS spektra av et peptid bør ha minst tre produkt ioner for å bekrefte identifikasjonen av peptid.
Data Explorer 4.0 dataprogram (Applied Biosystems) utfører den innledende baseline korrigering og støy filtrering. Hver spekteret må kalibreres basert på to sekvensert topper. Vi kalibrerer vår spekteret av den teoretiske massen av undeuterated m / z som er 923,45 og 1697,84. Than masse nøyaktighet etter kalibrering kan nå 10 ppm. Ved deuteration kan mono-isotopen skifte til et høyere masse. Enhetlig skritt øker til disse m / z forholdstall ga forbedret massene forbundet med deuteration. Toppen intensiteter av massen konvolutten vil ikke påvirke deuteration nivå. Men toppen intensiteter av isotopiske toppene i en bestemt masse konvolutt er avgjørende for beregning av gjennomsnittlig masse. Det første trinnet for beregning av den inkorporerte deuteron er å trekke peptid massen av ikke-deuterert sample fra deuterert prøven. Tre andre faktorer, D 2 O fortynning, gjenværende deuterons i sidekjeder og ryggen utveksling, må videre vurderes i beregningen (Figur 1). D 2 O fortynningen er fortynningsfaktoren av D 2 O etter blanding prøven og D 2 O buffer for å starte H / D utveksling. Den gjenværende deuteron (4,5%) i sidekjeder av pepsin-digested peptider må trekkes fra. Ryggen-utveksling er den uunngåelige tap av deuteration i alle deuterert og pepsin-fordøyd peptider i massen måleprosessen.
Den mest løsemiddel tilgjengelige peptid (m / z = 1105,60) etter 24-timers av H / D utveksle representerer en full deuteration regionen. Det innarbeidet deuteron tall for hver av peptidene er forskjellen mellom Tyngdepunktet av deuterert og ikke-deuterert Pak2 peptisk peptider. Den mest deuterert peptid m / z 1105 ble valgt til å representere hele deuteration da Pak2 var på 24 hr av H / D utveksling. The Back Bytteforholdet ble beregnet ved det faktiske innlemmet deuteron antall på 24 timer for H / D utveksle delt på alle mulige utskiftbare nettsteder på peptid m / z 1105.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis fra National Institutes of Health Grant GM-26738 (til JAT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
