Summary
MALDI-TOF espectrometria de massa foi utilizado com sucesso para monitorar a troca hidrogênio / deutério amida em proteína quinase PAK2 ativação.
Abstract
Troca hidrogênio / deutério amida (H / D de câmbio) acoplado com espectrometria de massa tem sido amplamente utilizado para analisar a interface de interações proteína-proteína, mudanças conformacionais de proteínas, dinâmica de proteína e proteína-ligante interações. H / D de câmbio sobre as posições amida espinha dorsal tem sido utilizada para medir as taxas de deuteração do micro-regiões em uma proteína por espectrometria de massa 1,2,3. A resolução deste método depende da digestão da proteína pepsina deuterado de interesse em peptídeos que, normalmente, faixa 3-20 resíduos. Embora a resolução de H / D de troca medido por espectrometria de massa é menor do que a resolução resíduo única medida pelo único método Quantum Coherence heteronucleares (HSQC) da RMN, a medição de espectrometria de massa em H / D de câmbio não é limitada pelo tamanho da proteínas 4. H / D de câmbio é realizada em uma solução aquosa que mantém a conformação da proteína. Nós fornecemos um método que utilizes o MALDI-TOF para a detecção de dois, em vez de um HPLC / ESI (ionização electrospray)-MS sistema 5,6. A MALDI-TOF fornece dados precisos intensidade de massa para os peptídeos da proteína digerida, neste caso, a proteína quinase PAK2 (também chamado de γ-Pak). Proteólise de Pak 2 é realizado em uma digestão pela pepsina offline. Este método alternativo, quando o usuário não tem acesso a uma coluna de HPLC e pepsina conectado a espectrometria de massa, ou quando a coluna de pepsina em HPLC não resultar em um mapa melhor digestão, por exemplo, o bissulfeto-ligados fortemente secretado Fosfolipase A 2 (SPLA 2). Utilizando este método, conseguimos monitoradas as mudanças no nível deuteração durante a ativação da caspase PAK2 por clivagem 3 e autofosforilação 7,8,9.
Protocol
1. PAK2 Ativação
- Adicione a quantidade pré-testados apropriado de caspase 3-20 mL de 12 mg / ml em tampão PAK2 A e (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, e 2 em pH 7,5) incubar a 34 ° C por 30 min plenamente decompor e PAK2 ativar.
- Analisar os produtos de dissociação por SDS-PAGE (10%) e coloração Coommassie azul.
- Adicione o PAK2 clivada para a ativação de buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) em pH 7,5, em 20 l para uma concentração final de 10 mg / ml PAK2, e incubar a 34 ° C por 30 min para ativar completamente PAK2 por autofosforilação em 8 sites.
- Confirmar clivagem cheio de PAK2 pela migração do p34 e p27 fragmentos como determinado por SDS-PAGE 10. Verificação adequada das condições autofosforilação é feita através de autoradiografia em um experimento separado usando (32 P) ATP ou espectrometria de massa para detectar fosfopeptídeos.
2. Identificaçãode pepsina-digerida PAK2 Fragments
- Adicionar 1 ml de 0,1% de ácido Trifluroacetic (TFA) em pH 2,5 para lavar as contas agarose duas vezes antes de usar. Então, centrifugue as amostras por 15 segundos a 2.000 xg para remover as contas.
- Adicionar PAK2 (20 mg em 2 mL de 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl e 2, pH 7,5) para 100 l de TFA 0,1%, e incubar a amostra por 5 min com 30 mL de contas pepsina-conjugado de agarose .
- Equilibrar uma coluna de HPLC de fase reversa C18 com um sistema primário de solvente de TFA 0,1% em pH 2.5. O resumo da pepsina (50 ul) é eluída usando um gradiente de 100 min-linear de 0-80% de acetonitrila contendo TFA 0,1% a uma vazão de 0,2 ml / min. Frações são coletadas a cada 2 min.
- Seca as frações de HPLC com uma velocidade-vac (3 h) e ressuspender as amostras em uma solução de acetonitrila (5 mL) e TFA 0,1% (5 mL), pH 2.5.
- Inicialmente, cada fração é testado para peptídios usando o MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager STR DE (PE Biosystems, Foster City, CA, EUA).
- As 16 frações contendo peptídeos são submetidos a espectrometria de massa em tandem utilizando um espectrômetro de massa Q-TOF e um QStar XL oMALDI MS / MS para identificar os fragmentos.
- A seqüência de cada peptídeo é verificado pelos íons produto gerado pela espectrometria de massa em tandem com a teórica m / z relações com base na seqüência primária de PAK2 usando a Protein Prospector website ( http://prospector.ucsf.edu/ ) 11.
3. Medição de amida H / D Câmbio
- Mantenha todas as soluções e reagentes necessários para H / D de câmbio em 25 ° C em banho-maria. ATP é dissolvido em água eo pH é ajustado para 7,0 antes da utilização. O adicional de 4 mM ATP na 2 D O tampão é para prevenir ATP dissociada PAK2 após a diluição.
- Iniciar H / D de troca através da adição de 18 mL de tampão D 2 O (50 mM pH 6,98 MOPS, 125 mM NaCl) a 2 mL (20 mg) De PAK2 em um tampão contendo 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl (pH 7,5) e 2, resultando em um nível PAK2 de 10 mg / ml e um pH de 7,0 a 0 ° C.
- Incubar as amostras em triplicata na troca H / D de 0, 0,5, 1, 3, 5 e 10 min, ou 24 h.
- Extinguir o H / D processo de troca, adicionando 180 mL de gelada TFA 0,1% em pH 2.2, que traz o pH para 2,5 em um volume final de 200 mL. Para as amostras contendo ATP, 180 mL de gelo frio TFA 0,11% em pH 2.2 é utilizado para manter o pH de 2,5 na condição saciada.
- Adicionar uma alíquota (100 l) de cada amostra a 30 mL saciada de contas ativadas pepsina-conjugado de agarose. A digestão pepsina é permitido proceder em gelo por cinco minutos e as amostras são centrifugadas a cada 30 seg.
- Terminar a digestão por centrifugação da amostra por 15 segundos a 5.000 xg a 4 ° C para remover a pepsina.
- Rapidamente congelar as amostras em N 2 líquido e armazenar a -80 ° C para não mais de 2dias antes da MALDI-TOF análise.
- A matriz para MALDI é de 5 mg / ml de α-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido (CHCA) dissolvido em uma solução (1:1:1) de etanol, acetonitrila e TFA 0,1% em pH 2,5 e mantidos a 0 ° C.
- Parcialmente descongelar cada amostra rapidamente e misture 1 ml de cada amostra com 1 ml de matriz e local em um 4 ° C placa-alvo MALDI.
- Aplicar um vácuo moderado ao prato para secar os pontos em 30 segundos antes de MALDI-TOF análise. O tempo entre o descongelamento da amostra e recuperação de espectro é de cerca de 3 min.
- Adquirir MALDI-TOF espectros de massa com um Voyager Biosystems PerSeptive STR DE. Aquisição de dados em uma taxa de amostragem de 2 GHz a 100 mil canais de dados, com uma tensão de 20.000 V de aceleração, e uma tensão de rede usando 65% de extração atrasada com um atraso de pulso de 180 ns. Cem exames são em média de 2 min. O instrumento MALDI-TOF não se restringe a qualquer marca ou qualquer outro software específico.
- Usar o Data Explorer programa de computador 4.0 para calculcomeu o deuteração de cada fragmento.
- Calcular o câmbio de volta com base na razão entre o número deuteron real incorporado em 24 hr de H / D troca dividido por todos os possíveis locais de troca, que são a espinha dorsal amidas exceto a amida N-terminal (Figura 1).
4. Resultados representativos:
A clivagem caspase e autofosforilação são verificados por SDS-PAGE coloração Commassie. PAK2 inativos é uma banda única de 58 kDa. Clivagem da caspase PAK2 está completa, e produz dois fragmentos, p27 e p34 que migram separadamente. A migração de p27 e p34 autofosforilada mostra uma sobreposição no gel devido à migração retardada do p27 totalmente fosforilados fragmento (Figura 2).
Experimentos H / D de câmbio são realizadas várias vezes entre 0 e 10 min (Figura 3). Como exemplo, o tempo de incorporação de deutério na m / zpeak 1.697,85 de PAK2 inativo é composto de vários picos de isótopos, como mostrado pela mudança do envelope de massa ao longo do tempo.
Figura 1. Equação para o cálculo da deuteração.
Figura 2. Autofosforilação e clivagem caspase de PAK2. Caspase clivada PAK2 (faixa esquerda), PAK2 inativos intacta (meio lane) e caspase clivada PAK2 autofosforilada (pista direita) foram analisadas por SDS-PAGE e coloração Coommassie azul. Adaptado de Hsu, YH et al 2.
Figura 3. Espectro de massa de um curso do tempo de incorporação de deutério para PAK2 inativo. PAK2 inativos foi submetido a H / D exchaESL para 00-10 min e analisados por MALDI-TOF. Um exemplo da distribuição expandida isotópica de MALDI-TOF de pico m / z 1.697,85 durante o curso do tempo de H / D de câmbio é mostrado. A linha vermelha pontilhada indica a média do envelope de massa e da mudança do envelope de massa mostra o deuteração de um peptídeo.
Discussion
Identificação dos fragmentos Pepsin-digerida é uma etapa crítica da experiência de troca H / D. Identificação incorreta do peptídeo pode levar a uma conclusão errada. PAK2 pepsina-digerida é eluído através de uma coluna de fase reversa HPLC C18 para obter um fundo limpo. Em nossos experimentos, um total de 40 frações foram coletadas e submetidas a MALDI-TOF. Peptídeos múltiplos puderam ser identificados em cada uma das frações. Os peptídeos foram submetidos a espectrometria de massa (Q-TOF MS / MS e oMALDI MS / MS) para identificar suas seqüências. Os espectros MS / MS de um peptídeo deve ter pelo menos três íons produto para confirmar a identificação do peptídeo.
O Data Explorer programa de computador 4.0 (Applied Biosystems) realiza a correção inicial, e filtragem de ruído. Cada espectro deve ser calibrado com base em dois picos seqüenciado. Nós calibrar nosso espectro pela massa teórica do undeuterated m / z que são 923,45 e 1.697,84. TEle precisão massa após a calibração pode chegar a 10 ppm. Após deuteração, o mono-isótopos podem se deslocar para uma maior massa. Aumenta o passo unitário para estes índices m / z rendeu as massas melhorada associada deuteração. As intensidades de pico do envelope de massa não afetará o nível deuteração. No entanto, o pico de intensidade dos picos de isótopos em um envelope de massa específica são fundamentais para o cálculo da massa média. O primeiro passo do cálculo do deutério é incorporada subtraindo a massa de peptídeos da amostra não-deuterado a partir da amostra deuterado. Três outros fatores, a diluição D 2 O, os dêuterons residual nas cadeias laterais eo intercâmbio de volta, terá de ser ainda considerados no cálculo (Figura 1). A D 2 O diluição é o fator de diluição de D 2 O após a mistura da amostra e D 2 O tampão para iniciar a troca H / D. O deutério residual (4,5%) nas cadeias laterais da pepsina-digestpeptídeos ed precisa ser subtraído. A parte de trás de troca é a perda inevitável de deuteração em todos os peptídeos deuterado e pepsina-digerida no processo de medição de massa.
O peptídeo mais acessíveis solvente (m / z = 1.105,60) após 24 horas de H / D de câmbio representa uma região deuteração completo. O número deuteron incorporados para cada um dos peptídeos é a diferença entre o centróide do deuterado e não deuterado peptídeos péptica PAK2. O peptídeo mais altamente deuterado m / z 1105 foi selecionado para representar deuteração cheia quando PAK2 foi de 24 h de H / D de câmbio. A Relação de Troca Voltar foi calculado pelo número deuteron real incorporado em 24 hr de H / D troca dividido por todos os possíveis locais de troca de peptídeo m / z 1105.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado em parte do National Institutes of Health Grant GM-26738 (para JAT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
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