Summary
यहाँ हम 1 अच्छा विनिर्माण (जीएमपी) अभ्यास अनुरूप गर्भनाल रक्त, मुख्य रूप से अनुभवहीन टी कोशिकाओं के एक स्रोत से वायरस विशेष साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (सीटीएल) के उत्पादन की विधि का वर्णन है.
Abstract
स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के वायरस के संक्रमण के बाद मौत का सबसे आम कारणों में गर्भनाल रक्त के बाद, विशेष रूप से कर रहे हैं (सीबी) प्रत्यारोपण (सीबीटी) जहां सीबी वायरस अनुभवी टी कोशिकाओं जो संक्रमण से प्राप्तकर्ता की रक्षा कर सकते हैं 1 सराहनीय संख्या शामिल नहीं है. 4 हम और दूसरों से पता चला है कि वायरस विशेष सीटीएल सेरोपॉज़िटिव दाताओं से उत्पन्न होती है और प्राप्तकर्ता को संचार सुरक्षित और सुरक्षात्मक 5-8 हालांकि, हाल ही में जब तक, वायरस विशेष टी कोशिकाओं गर्भनाल रक्त से उत्पन्न नहीं, हो सकता है की वजह से कर रहे हैं. वायरस विशेष स्मृति टी कोशिकाओं के अभाव.
एक बेहतर भोले टी कोशिकाओं की vivo भड़काना परिस्थितियों में नकल करने के प्रयास में, हम एक तरीका है कि सीबी व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) का इस्तेमाल एक adenoviral (Ad5f35pp65) वेक्टर immunodominant सीएमवी pp65 प्रतिजन युक्त साथ transduced की स्थापना की है, इसलिए टी सेल विशिष्टता ड्राइविंग सीएमवी और दीक्षा में adenovirus. 9 की ओर, हम इन मा का उपयोगखंडित रूप में के रूप में अच्छी तरह से DCs साइटोकिन्स 7-आईएल, आईएल 12, और आईएल 15 10 2 उत्तेजना हम EBV तब्दील बी कोशिकाओं का इस्तेमाल किया, या EBV LCL, जो दोनों व्यक्त की उपस्थिति में सीबी व्युत्पन्न टी कोशिकाओं अव्यक्त और lytic EBV प्रतिजनों. Ad5f35pp65 transduced EBV LCL 2 उत्तेजना में आईएल-15 की उपस्थिति में टी कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए किया जाता है. बाद के stimulations EBV LCL और IL-2 Ad5f35pp65 transduced का उपयोग करें.
50x10 6 सीबी mononuclear कोशिकाओं से हम 150 x 10 6 वायरस विशेष टी कोशिकाओं है कि प्रतिजनी उत्तेजना जवाब में प्रतिजन स्पंदित लक्ष्य और रिहाई साइटोकिन्स lyse के ऊपर उत्पन्न करने में सक्षम हैं 11 इन कोशिकाओं. जीएमपी-compliant तरीके में निर्मित का उपयोग कर रहे थे एक fractionated गर्भनाल रक्त इकाई का 20% अंश और नैदानिक इस्तेमाल के लिए अनुवाद किया गया है.
Protocol
1. Mononuclear सेल अलगाव (0 दिन)
- गर्भनाल रक्त इकाई के 20% के अंश के आउटलेट बंदरगाह में महिला luer एडाप्टर के कील डालें, सिरिंज देते हैं और रक्त को हटा दें. 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में गर्म RPMI के 20 एमएल रक्त thawed स्थानांतरण. RPMI के 5 एमएल के साथ गर्भनाल रक्त बैग कुल्ला और ही अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- X 400 छ में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate.
- गर्म RPMI के 20 एमएल में कोशिकाओं Resuspend. Lymphoprep के 15 एमएल पर 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में परत कोशिकाओं. 40 400 @ जी x मिनट अपकेंद्रित्र.
- Mononuclear कोशिकाओं से युक्त अंतरफलक फसल और RPMI की 20 एमएल में धो. 10 @ 450 x छ मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- तैरनेवाला Aspirate और RPMI की 20 एमएल में धो. कोशिकाओं की गणना और 5 @ 400 x छ मिनट के लिए स्पिन.
- 5 पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं Aspirate x 10 6 mononuclear कोशिकाओं / Cellgenix डीसी मीडिया (सीरम मुक्त) एमएल. EBV से LCL पीढ़ी के लिए 1 एमएल निकालें और 15 एमएल CE में डालट्यूब ntrifuge.
2. वृक्ष के समान सेल पीढ़ी (0 दिन पर शुरू)
- प्लेट कोशिकाओं के 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली में (5 x 10 6 कोशिकाओं / डीसी मीडिया के एमएल में पहले से ही कर रहे हैं). इन्क्यूबेटर में 1-2 घंटे के लिए छोड़ दें.
- 1-2 घंटे के बाद बंद गैर पक्षपाती कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3-4 बार धोने से धो लो. गैर पक्षपाती कोशिकाओं और फ्रीज ले लीजिए. / 2 की अच्छी तरह से एमएल डीसी 1000 आईएल-4 के यू / एमएल और 800 यू / एमएल जीएम-CSF वाले मीडिया जोड़ें.
- डीसी दीक्षा के बाद 3-4 दिन, 100 μL जोड़ने / अच्छी तरह से 1000U/mL आईएल-4 और 800 यू / एमएल जीएम-CSF की एक अंतिम एकाग्रता वाले मीडिया द्वारा आईएल-4 और जीएम-CSF की भरपाई होगी.
- 5-6 दिन, फसल एक हस्तांतरण विंदुक के साथ अच्छी तरह से scraping द्वारा डीसी को. 5 @ 400 छ x मिनट के लिए बड़ा कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र गिनो. Aspirate मीडिया और 2x10 6 कोशिकाओं / एमएल की डीसी मीडिया में resuspend डीसी. / एक 24-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से 0.5 एमएल जोड़ें.
- Transduce डीसी 10 संक्रामक इकाइयों के एक MOI प्रति सेल में Ad5f35pp65 वेक्टर का उपयोग. Vecto जोड़ेंएक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए आर. 1.5 घंटे के लिए कोशिकाओं सेते हैं. 1.5 घंटे के बाद, डीसी / मीडिया युक्त की अच्छी तरह से 1.5 एमएल जोड़ें: 1000 आईएल यू / एमएल-4, 800 यू / जीएम-CSF एमएल, 10 एनजी / एमएल TNF-अल्फा, 1 ग्राम / PGE-1, 100 एनजी / एमएल एमएल IL-6, और 10 एनजी / एमएल आईएल 1beta. इन साइटोकिन्स DCs परिपक्व.
3. EBV से LCL पीढ़ी (0 दिन पर शुरू)
- अपकेंद्रित्र ट्यूब 5 x 10 6 mononuclear कोशिकाओं से युक्त है. केंद्रित EBV तैरनेवाला B95.8 के 200 μL और पूरा मीडिया के 1.8 एमएल (RPMI + 10% FBS + 2mm एल glutamine) युक्त cyclosporine (1 ग्राम / एमएल) जोड़ें.
- अशेष भाजक एक 96 अच्छी तरह से थाली और 5 कुओं में 200 μL के 10 कुओं में 100 कोशिकाओं की μL. कोशिकाओं के केवल 100 μL युक्त कुओं पूरा मीडिया + cyclosporine के 100 μL जोड़ें. बाँझ पानी के साथ शेष कुओं भरें.
- LCL साप्ताहिक फ़ीड और विस्तार करने के लिए एक 96-अच्छी तरह से थाली से ~ 2 सप्ताह के बाद एक 24 अच्छी तरह से थाली. दूसरे सप्ताह के बाद, एक T25 फ्लास्क को हस्तांतरण और बाद में सप्ताह के हस्तांतरण मेंएक फ्लास्क T75. इस स्तर पर यह सिफारिश की है कि आप LCL की aliquots फ्रीज. यह आम तौर पर 1 महीने लगते LCL के लिए पर्याप्त संख्या उत्पन्न.
4. सीटीएल दीक्षा DCs की दीक्षा के बाद 7 दिनों -
- हार्वेस्ट 30 Gy DCs चमकना. 4 एक्स और गिनती धो लें. टी सेल मानव सीरम (45% RPMI, 45% क्लिक करें, 10% मानव सीरम, 2mm एल glutamine) @ 1 x 10/5 DCs एमएल. वाले मीडिया में Resuspend डीसी
- 2.2 कदम से गैर पक्षपाती कोशिकाओं पिघलना के. कोशिकाओं को धो, और गिनती. 2 10 x 6 गैर पक्षपाती कोशिकाओं / टी सेल मानव सीरम वाले मीडिया में एमएल Resuspend. जोड़ें 10 / एनजी एमएल IL-7 और IL-12, और 5 एनजी / एमएल आईएल-15. कोशिकाओं के 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली में जोड़ें. डीसी के 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से जोड़ें. बाँझ पानी के साथ 24 अच्छी तरह से थाली के खाली कुओं भरें.
- टी सेल दीक्षा के बाद 7 दिन, फ़ीड और / या टी सेल मानव सीरम वाले मीडिया के साथ कोशिकाओं विभाजित.
- टी सेल दीक्षा के बाद 9-12 दिनों, टी कोशिकाओं फ्रीज जब तक LCL लिए तैयार हैं.
- हेnce LCL विस्तार किया है और T75 बोतल में passaged, 5 @ 400 x छ मिनट के लिए centrifuging LCL transduce. सेल गोली एक सेल प्रति 100 संक्रामक इकाइयों के MOI में वेक्टर जोड़ें. 1.5 घंटे के लिए सेते हैं. 1.5 घंटा, 5 x 10 5 LCL / एमएल पर पूरा मीडिया में resuspend और 2 एमएल एक 24-अच्छी तरह से थाली में जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से 12 के बाद.
- 2 दिनों के बाद, 40 Gy LCL और चमकाना फसल. 4 एक्स और गिनती धो लें. टी सेल 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल मानव सीरम वाले मीडिया में LCL Resuspend. LCL के 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली के जोड़ें. इसके अलावा, एक Grex40 संस्कृति डिवाइस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 5 एनजी / एमएल आईएल 15 5 10 x 6 LCL 13.
- टी कोशिकाओं फसल. @ 400 XG में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला aspirate, और टी सेल 1 x 10 6 टी कोशिकाओं / एमएल में मानव सीरम वाले मीडिया में resuspend. 5 एनजी / एमएल IL-15 में और LCL कि 24-अच्छी तरह से थाली में पहले से ही कर रहे हैं के लिए 1 / एमएल टी कोशिकाओं (1 x 10 6 टी कोशिकाओं की कुल) जोड़ने. Grex40 में लाने के लिए,मीडिया के कुल 30 एमएल मात्रा.
- सुबह 3-4 के बाद उत्तेजना, अगर कोशिकाओं सहधारा हैं तो उन्हें अलग थाली में 1:01 और नए सिरे से 50 यू / IL-2 एमएल युक्त मीडिया जोड़ें. यदि वे सहधारा नहीं कर रहे हैं तो बस साढ़े मीडिया aspirate और 50 यू / IL-2 एमएल वाले मीडिया के साथ बदलें. में Grex40, 1/2 मीडिया aspirate, ताजा मीडिया के साथ की जगह, और 50 यू / IL-2 एमएल जोड़ें.
- 7 दिन, 4.6 चरण में दोहराने लेकिन उत्तेजना के दिन पर IL-2 उपयोग IL-15 नहीं,.
5. प्रतिनिधि परिणाम
जीएमपी-compliant विनिर्माण एफडीए को मंजूरी दी प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 में दर्शाया जाता है. इस प्रक्रिया के बारे में 50 दिन लगते हैं. तथापि, गर्भनाल रक्त वायरस अनुभवी टी कोशिकाओं का अभाव है और इसलिए हम प्रधानमंत्री भोले टी कोशिकाओं पूर्व vivo करने की जरूरत है, वायरस विशेष टी कोशिकाओं पूर्व मौजूदा स्मृति टी कोशिकाओं का विस्तार विशिष्ट तरीकों. ऐसा करने के लिए, हम आईएल-7 साइटोकिन्स वृक्ष के समान कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपयोग करते हैं, आईएल 12, और आईएल-15,वायरल विशिष्टता पैदा करने के लिए आवश्यक है.
3 stimulations के बाद, उपज 100x10 6 कोशिकाओं से अधिक होना चाहिए. यदि पर्याप्त कोशिकाओं उपलब्ध नहीं हैं, जब तक अतिरिक्त stimulations CTLs के अपेक्षित संख्या में उपलब्ध हैं किया जा सकता है. इन कोशिकाओं के बहुमत CD4 + और CD8 + टी कोशिकाओं का एक मिश्रण के साथ CD3 + होना चाहिए. वहाँ कम से कम 15% एन.के. कोशिकाओं (CD3-/CD56 +) और कम से कम 1% CD19 + बी कोशिकाओं (2 चित्रा) होना चाहिए.
विस्तार सीटीएल सीएमवी hexon, और Penton से adenovirus से pp65 प्रतिजन की पहचान करनी चाहिए साथ ही कई EBV प्रतिजनों कि EBV से LCL पर व्यक्त कर रहे हैं. IFN जब एक ELISpot परख में परीक्षण किया गया, सीटीएल स्रावित चाहिए अधिक? अप्रासंगिक प्रतिजनों (3 चित्रा) से इन प्रतिजनों के जवाब में.
सीटीएल भी वायरल पेप्टाइड स्पंदित लक्ष्य ऐसे पीएचए विस्फोटों lyse चाहिए. एक 51 करोड़ रिलीज परख में, सीटीएल LCL lyse, CMVpp65 स्पंदित और Adenovirus hexon और /या लक्ष्य Penton स्पंदित लेकिन नहीं अप्रासंगिक पेप्टाइड्स (चित्रा 4) के साथ स्पंदित लक्ष्य.
चित्रा 1 बहु वायरस विशेष सीटीएल के गर्भनाल रक्त से पीढ़ी. योजनाबद्ध गर्भनाल रक्त से सीटीएल निर्माण की पूरी प्रक्रिया दिखा. पहले गर्भनाल रक्त mononuclear कोशिकाओं fractionated गर्भनाल रक्त इकाई के 20% के अंश से अलग कर रहे हैं. 5x10 6 कोशिकाओं कि LCL पीढ़ी के लिए सहेज कर रहे हैं के अपवाद के साथ, सभी कोशिकाओं को फिर 1-2 घंटे के लिए वृक्ष के समान सेल मीडिया में चढ़ाया, जो बिंदु पर गैर पक्षपाती कोशिकाओं काटा और जमे हुए. डीसी तो डीसी मीडिया IL-4 और जीएम-CSF युक्त खिलाया जाता है. संस्कृति के 5 दिनों के बाद, डीसी परिपक्व और एक adenoviral immunodominant सीएमवी pp65 प्रतिजन युक्त वेक्टर के साथ transduced. दीक्षा, इन डीसी गैर पक्षपाती कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आईएल-7 साइटोकिन्स, IL-12 के साथ संयुक्त कर रहे हैं,और आईएल-15. बाद stimulations पर, एक ही adenoviral वेक्टर EBV LCL, जो प्रतिजन कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है. IL-15 2 उत्तेजना और IL-2 तत्पश्चात प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2 टी कोशिकाओं के परिणामस्वरूप phenotype. लिम्फोसाइट फाटक में शामिल रहते हैं कोशिकाओं के प्रतिशत दिखाई है. सीटीएल CD3 + और या CD8 +, लेकिन मोटे तौर पर CD3-/CD56- और CD4 CD19.
चित्रा 3 टी सेल की कार्यक्षमता. टी सेल विशिष्टता IFN-γELISPOT द्वारा परीक्षण किया गया था. टी कोशिकाओं अतिव्यापी पेप्टाइड्स hexon, Penton, pp65 पूरे प्रोटीन फैले के साथ स्पंदित थे, और अप्रासंगिक प्रतिजन IE-1. अकेले सीटीएल मीडिया अकेले इंगित करता है. ऑटोलॉगस LCL विकिरणित किया गया और 5 1x10 / अच्छी तरह से जोड़ा. मतलब जगह सेल ग बनाने दिखाई हैतीन प्रतियों कुओं की ount.
चित्रा 4 सीटीएल के Cytolytic गतिविधि. परिणामस्वरूप सीटीएल की क्षमता के लिए वायरल एंटीजन व्यक्त लक्ष्य lyse एक 51 करोड़ परख में परीक्षण किया गया था 51 करोड़ लेबल ऑटोलॉगस पीएचए विस्फोटों अतिव्यापी पेप्टाइड्स पूरे प्रतिजन या 51 सीआर लेबल है है के ऑटोलॉगस LCL सीटीएल के साथ cocultured रहे थे फैले के साथ स्पंदित थे. 4 घंटे के बाद, गामा रिलीज एक गामा काउंटर पर गिना गया था.
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Discussion
सीबीटी के बाद वायरल संक्रमण को नियंत्रित करने के उद्देश्य से वर्तमान रणनीतियों प्रभावी हो सकता है, कर सकते हैं लेकिन वे महत्वपूर्ण toxicities साथ जुड़े रहे हैं, महंगे हैं, और बाद में संक्रमण के खिलाफ लंबे समय तक सुरक्षा प्रदान नहीं है. वास्तव में, कुछ antiviral दवाओं के उपयोग वायरस विशेष टी कोशिकाओं है कि अन्यथा सुरक्षा होगा के विस्तार की सीमा 14 दूसरा विकल्प दाता व्युत्पन्न वायरस विशेष टी कोशिकाओं के अर्क है. सकता है. हम और दूसरों से पता चला है कि इस तरह की टी कोशिकाओं को सुरक्षित, प्रभावी, और लागत प्रभावी है. 15-17 यहाँ हैं, हम बताते हैं कि इस दृष्टिकोण भी गर्भनाल रक्त लिए बढ़ाया जा सकता है.
यह सड़न रोकनेवाला तकनीक जब संवर्धन मानव प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए जरूरी है. टी कोशिकाओं की भोले प्रकृति के कारण, यह भी महत्वपूर्ण है कि मानव सीरम सीरम की आवश्यकता होती है कि सभी मीडिया में प्रयोग किया जाता है. हमारे अनुभव में FBS युक्त उत्पादों टी FBS से प्राप्त प्रोटीन को निशाना कोशिकाओं का एक विशाल विस्तार में परिणाम देगा.
> ve_content "जब mononuclear Ficoll ढाल का उपयोग कोशिकाओं को अलग, यह अक्सर मुश्किल होता है लाल रक्त कोशिकाओं को बाहर क्योंकि कई nucleated कर रहे हैं और नहीं लाल सेल बफर द्वारा lysed. यदि लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या अत्यधिक है, उत्पाद फिर से किया जा सकता है - ficolled.जबकि यहाँ विधि वायरस विशेष टी कोशिकाओं अर्थात् सीएमवी, EBV, और adenovirus गर्भनाल रक्त से अन्य प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से की पीढ़ी के लिए लागू है. का विस्तार करने के लिए सीमित है वृक्ष के समान कोशिकाओं और उपर्युक्त cytokine कॉकटेल का उपयोग भोले टी कोशिकाओं की एक शक्तिशाली उत्तेजक औधधि है और प्रतिजन विशेष सीटीएल के विस्तार ड्राइव करना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम एक दान एल डंकन सहयोगात्मक अनुसंधान अनुदान (CMB और EJS), राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (US4HL081007), एक लेकिमिया और लिंफोमा सोसाइटी क्लीनिकल रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (CMB), और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया (CA06150816 RO1, EJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
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