Summary
在这里，我们描述的第一个好生产质量管理规范（GMP）标准的方法从脐带血幼稚T细胞的来源主要是病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。
Abstract
干细胞移植后的病毒感染是最常见的死亡原因，尤其是在脐带血（CB）移植（CBT），CB不包含相当数量的病毒有经验的T细胞可以保护收件人感染。1 -我们和其他人表明，病毒特异性CTL产生的血清学阳性的捐助者，并注入到收件人的安全和保护。5-8然而，直到最近，病毒特异性T细胞不能产生脐带血，可能是由于病毒特异性记忆T细胞的缺乏。
为了更好地模仿体内吸幼稚T细胞的条件，我们建立了一个方法，该方法使用CB来源的树突状细胞（DC）的腺病毒载体（Ad5f35pp65）含有的免疫CMV抗原病毒pp65转，因此驱动T细胞特异性对巨细胞病毒和腺病毒。在开始，我们利用这些马捕获区议会，以及CB来源的T细胞的细胞因子的存在下，IL-7，IL-12和IL-15。[10]在所述第二刺激我们使用EBV-转化的B细胞，或EBV-LCL，同时表达潜在的和裂解EB病毒抗原。 ad5f35pp65转导的EBV-LCL是用于刺激的T细胞中的IL-15的存在，在第二次刺激。后续的刺激使用Ad5f35pp65转导的EBV-LCL和IL-2。
从50×10 6 CB单核细胞中，我们能够产生向上的150×10 6病毒特异性T细胞，裂解抗原脉冲的目标和释放细胞因子响应于抗原刺激11将这些细胞在GMP兼容的方式制造，使用仅分馏脐带血单元分数的20％，并已被翻译供临床使用。
Protocol
1。单核细胞分离（0天）
- 插入秒杀到出口的20％部分的脐带血阴鲁尔适配器，连接注射器和清除血液中。解冻血液转移到20毫升温热在50ml离心管中的RPMI。用5毫升的RPMI冲洗脐血袋和转移到相同的离心管中。
- 离心细胞以400×g进行10分钟。吸出上清液。
- 在20毫升的温暖的RPMI重悬细胞。到在50ml离心管中的15毫升淋巴制剂层细胞。离心40分钟@ 400×克。
- 含有单核细胞的收获的接口，并在20毫升的RPMI清洗。离心10分钟@ 450×克。
- 吸液上清液，并在20毫升的RPMI清洗。计数细胞和旋转5分钟@ 400×克。
- 吸液上清液和重悬细胞，在5×10 6个细胞/ mL的Cellgenix：直流介质（无血清）。为EBV-LCL代的取出1毫升，放入15毫升CEntrifuge管。
2。树突状细胞生成（第0天）
- 板2毫升的细胞（已经在5×10 6细胞/ mL的直流媒体）成一个6孔板每孔。发表在1-2个小时的孵化器。
- 1-2小时后，洗掉非贴壁细胞，用PBS洗涤3-4次。收集非粘附细胞，并冷冻。加入2毫升/ DC含1000 U / mL的IL-4和GM-CSF 800 U / mL的。
- DC启动后3-4天，补充IL-4，加入100μL/孔含终浓度为1000U/mL IL-4和800 U / mL的GM-CSF和GM-CSF。
- 5-6天收获DC刮以及用移液管。计数的大细胞，离心5分钟@ 400×克。吸液媒体和重悬DC在2×10 6细胞/ mL的直流媒体。加入0.5 mL /孔24孔培养板。
- 转导DC使用Ad5f35pp65的MOI为每个单元10传染性单位矢量。添加vector到24孔板的各孔中。孵育细胞1.5小时。 1.5小时后，加入1.5毫升/ DC媒体含1000 U / mL的IL-4，800 U / mL的GM-CSF，10 ng / mL的TNF-α，1μg/ mL的PGE-1，100毫微克/毫升IL-6，和10 ng / mL的IL-1β。这些细胞因子成熟的区议会。
3。 EBV-LCL（从第0天开始）的生成
- 含有5×10 6单核细胞的离心管。添加200μL浓EBV B95.8上清液和完整的媒体的1.8毫升的（RPMI + 10％FBS + 2mM的L-谷氨酰胺）含环孢霉素（1微克/毫升）。
- 等分试样100μL的细胞分为10个孔的96孔板中，分为5口井和200μL。添加100μL完整的媒体+环孢素的孔中只有100μL的细胞。填写剩余的井用无菌水。
- 饲料LCL每周和扩大从96孔板，24孔板后1〜2周。一个星期后，转移到T25烧瓶，并在随后的一星期转移到一个T75烧瓶中。在这个阶段，我们建议您冻结等分LCL。它通常需要1个月，以产生足够数量的LCL。
4。 CTL启动 - 7天开始后的区议会
- 嘉实区议会和30 Gy的照射。洗4 x和计数。 ：重悬直流在T细胞的介质，含人血清（45％RPMI，45％CLICK，10％人血清，2mM L-谷氨酰胺）@ 1×10 5个区议会/毫升。
- 解冻从步骤2.2的非粘附细胞。洗涤细胞，并计数。重悬在2×10 6在含有人血清的T细胞介质的非贴壁细胞/ mL。加入10纳克/毫升的IL-7和IL-12，和5 ng / mL的IL-15。添加1毫升的细胞在24孔板上每孔。每孔加入1 mL的DC。填充空的24孔板的孔中，用无菌水。
- 后7天，饲料和/或T细胞起始分裂细胞与T细胞的介质，含有人血清。
- T细胞后9-12天开始，冻结的T细胞，直到LCL准备。
- ØNCE LCL已经扩大，在T75烧瓶中传代，转导LCL 5分钟@ 400×g下离心。加入到细胞沉淀的载体在100传染性单位每个细胞的MOI。孵育1.5小时。 1.5小时后，重新悬浮在完整的媒体在5×10 5 LCL /毫升，并在24孔板中，每孔加入2毫升12
- 术后第2天，收获LCL在40 Gy的照射。洗4 x和计数。重悬LCL在T细胞介质中含有2.5×10 5细胞/ mL的人血清。加入1 mL的LCL的24孔培养板每孔。此外，添加到的Grex40的培养装置，以及5 ng / mL的IL-15的5×10 6个 LCL 13
- 收获的T细胞。离心机@ 400×g离心5分钟，吸出上清液，并重新悬浮在含有1×10 6个 T细胞/ mL的人血清的T细胞介质。加入5 ng / mL的IL-15，并加入1毫升/孔的T细胞（总数为1×10 6个 T细胞），已经在24孔板上的LCL。在的Grex40，带来介质的总体积达30毫升。
- 每天3-4刺激后，如果细胞是汇合，然后将它们分割（板）1:1，并添加新鲜培养基中含50 U / mL的IL-2。如果他们不汇合，然后简单地吸½媒体和更换含50 U / mL的IL-2。在的Grex40，吸一半的媒体，更换新鲜的培养基，并添加50 U / mL的IL-2。
- 在第7天，重复在步骤4.6，但使用的IL-2的刺激的天，IL-15的。
5。代表性的成果
按照GMP标准FDA批准的制造协议的示意图， 如图1所示。这个过程需要50天左右。典型的产生病毒特异性T细胞扩大预先存在的记忆T细胞，然而，脐血缺乏病毒经验丰富的T细胞，因此，我们需要素幼稚T细胞的体外方法。要做到这一点，我们使用的树突状细胞，以及细胞因子IL-7，IL-12和IL-15，必要产生病毒特异性。
经过3刺激，收率 应该超过100×10 6个细胞。如果有足够的细胞是不可用时，可以进行额外的刺激，直到所需的号码的CTLs可用。这些细胞的大部分应该是CD3 +，CD4 +和CD8 + T细胞的混合物。应该有小于15％的NK细胞（CD3-/CD56 +）且小于1％CD19 + B细胞（ 图2）。
扩大的CTL识别的抗原病毒pp65从巨细胞病毒，六邻体和聚氯从腺病毒，以及众多的EBV抗原表达于EBV-LCL。测试时，酶联免疫斑点法，CTL分泌IFN-？响应于比不相干抗原（ 图3）的这些抗原。
，CTL还应该裂解抗原肽脉冲目标这样的PHA爆炸。在51 Cr释放试验，CTL裂解LCL，CMVpp65脉冲和腺病毒六邻体和/或聚氯脉冲的目标，但不是脉冲与目标不相关肽（ 图4）。
图1。生成多病毒特异性CTL从脐带血 。示意图显示CTL制造的全过程，从脐带血。首先，脐带血单核细胞分离出20％的馏分的分馏脐血单元。散货代保存中的5×10 6个细胞的异常，然后，所有的细胞铺板在树突状细胞的介质为1-2小时，在该点的非粘附细胞的收获和冻结。的DC，然后输入DC媒体中IL-4和GM-CSF。经过5天的文化，是成熟的DC和巨细胞病毒抗原的免疫细胞病毒pp65的腺病毒载体转导的。发起，这些DC的非贴壁细胞，以及细胞因子IL-7，IL-12的结合，和IL-15。在随后的刺激，使用相同的腺病毒载体转导EBV-LCL，被用作抗原呈递细胞。 IL-15是用于在第二次刺激和其后的IL-2。
图2。产生的T细胞表型 。所示出的是活细胞的百分比，在淋巴细胞门控。 CTL是CD3 +，CD4 +或CD8 +，但主要CD3-/CD56-和CD19-。
图3的T细胞的功能 。由IFN-γELISPOT的T细胞特异性进行了测试。脉冲跨越整个六邻体蛋白，聚氯，病毒pp65的重叠肽，T细胞和不相关的抗原IE-1。 CTL单独表示单独的媒体。自体LCL照射，并添加1×10 5 /孔。显示的是的平均斑点形成细胞C指望。2-15的三个孔。
图4的CTL的细胞溶解活性 。所得的CTL裂解表达病毒抗原的目标的能力进行了测试中的51 Cr的检测。，跨越整个抗原或51 Cr-标记的自体LCL与CTL共培养的重叠肽脉冲的51 Cr-标记的自体的PHA爆炸。 4小时后，γ释放γ计数器上计数。
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Discussion
目的是在控制病毒感染后，CBT目前的战略是有效的，但他们都与显著的毒性，价格昂贵，并且不授予长期保护，对以后的感染。事实上，一些抗病毒药物的使用可能会限制病毒特异性T细胞，否则将保护的膨胀。14另一种选择是来自供体的病毒特异性T细胞的输注。我们和其他人表明，这种T细胞是安全，有效和符合成本效益的。15日至17日在这里，我们表明，这种方法也可以扩展到脐带血。
这是必须使用无菌技术，培养人原代细胞。由于幼稚的T细胞的性质，这也是很重要的，使用人血清在所有的媒体需要血清。根据我们的经验，FBS的产品，将导致T细胞的蛋白质来自FBS的大规模扩张。
ve_content“>中分离的单核细胞，使用Ficoll梯度时，它往往是难以排除的红血细胞，因为许多晶核，而不是由红细胞裂解缓冲液裂解。如果的红血细胞的数目过多时，该产品可以被重新 - ficolled。虽然这里的方法是有限的膨胀病毒特异性T细胞，即巨细胞病毒，EB病毒，腺病毒，它是适用于其他抗原特异性的T细胞，以及从脐带血的生成。使用的树突状细胞与上述细胞因子鸡尾酒是一种强效刺激的幼稚T细胞，并应驱动的膨胀的抗原特异性CTL。
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Disclosures
作者有没有透露。
Acknowledgments
这项工作得到了一个丹·邓肯的合作研究资助（CMB和EJS），美国国家心脏，肺，和血液研究所（US4HL081007），白血病和淋巴瘤协会临床研究学者奖（CMB），美国国家癌症研究所（RO1 CA06150816 EJS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
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