Summary
Här beskriver vi den första god tillverkningssed (GMP)-kompatibel metod för framställning av virus-specifika cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) från navelsträngsblod, en källa till övervägande naiva T-celler.
Abstract
Virusinfektioner efter stamcellstransplantation är bland de vanligaste dödsorsakerna, särskilt efter navelsträngsblod (CB) transplantation (KBT) där CB inte innehåller väsentliga mängder virus-erfarna T-celler som kan skydda mottagaren från smitta 1. - 4 Vi och andra har visat att virus-specifika CTL genereras från seropositiva donatorer och infunderas till mottagaren är säkra och skyddande. 5-8 Men tills nyligen kunde virus-specifika T-celler inte genereras från navelsträngsblod, troligen på grund av den avsaknad av virus-specifika celler minnes-T.
I ett försök att bättre efterlikna in vivo priming förhållanden naiva T-celler har vi etablerat en metod som används CB-härledda dendritiska celler (DC) omvandlade med en adenovirusvektor (Ad5f35pp65) som innehåller den immunodominanta CMV-antigen pp65, därför driver T-cell specificitet mot CMV och adenovirus. 9 Vid initiering, använder vi dessa mastrukturerade DC liksom CB-härledda T-celler i närvaro av cytokinema IL-7, IL-12 och IL-15. 10 Vid den andra stimuleringsfas vi använt EBV-transformerade B-celler, eller EBV-LCL, som uttrycker både latenta och lytiska EBV-antigener. Ad5f35pp65-transducerade EBV-LCL användes för att stimulera T-cellerna i närvaro av IL-15 vid den andra stimuleringen. Efterföljande stimuleringar använder Ad5f35pp65-transducerade EBV-LCL och IL-2.
Från 50x10 6 CB mononukleära celler kan vi generera uppemot 150 x 10 6-virus-specifika T-celler som lyserar antigen-pulsade mål och cytokiner frisättning som svar på antigenstimulering. 11 Dessa celler tillverkades i en GMP-kompatibel sätt med användning endast den 20% fraktion av en fraktionerad navelsträngsblod enhet och har översatts för klinisk användning.
Protocol
1. Mononukleär cellisolering (dag 0)
- Sätt spetsen av Luer-adaptern i utloppsport 20% av de navelsträngsblod enheten bifoga spruta och tvätta bort blodet. Överför tinade blodet till 20 ml av uppvärmd RPMI i 50 ml centrifugrör. Skölj bag navelsträngsblod med 5 ml RPMI och överföra till samma centrifugrör.
- Centrifugera cellerna under 10 minuter vid 400 x g.. Aspirera supernatanten.
- Resuspendera celler i 20 ml varm RPMI. Layer celler på 15 ml Lymphoprep i 50 ml centrifugrör. Centrifugera 40 minuter @ 400 x g.
- Skörda gränssnittet innehåller de mononukleära cellerna och tvätta i 20 ml RPMI. Centrifugera i 10 minuter @ 450 x g.
- Aspirera supernatanten och tvätta i 20 ml RPMI. Räkna celler och snurra under 5 minuter @ 400 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera celler vid 5 x 10 6 mononukleära celler / ml i Cellgenix DC medium (serumfritt). Ta 1 ml för EBV-LCL generation och sätta i 15 ml centrifuge röret.
2. Dendritiska celler Generation (med start på dag 0)
- Platta 2 ml celler (redan vid 5 x 10 6 celler / ml av DC-medium) per brunn i en 6-brunnars platta. Låt i inkubator under 1-2 timmar.
- Efter 1-2 timmar, tvätta bort de icke-adherenta cellerna genom tvättning 3-4 gånger med PBS. Samla de icke-adherenta cellerna och frysa. Tillsätt 2 ml / brunn av DC-medium innehållande 1000 U / ml av IL-4 och 800 U / ml GM-CSF.
- 3-4 dagar efter DC-initiering, fylla på IL-4 och GM-CSF genom att tillsätta 100 | il / brunn av medium innehållande en slutkoncentration av 1000U/mL IL-4 och 800 U / ml GM-CSF.
- På dag 5-6, skörd DC genom att skrapa brunnen med en överföringspipett. Räkna de stora cellerna och centrifugera i 5 minuter @ 400 x g.. Sug media och återsuspendera DC vid 2x10 6 celler / ml av DC-medium. Tillsätt 0,5 ml / brunn av en 24-brunnars platta.
- Omvandla DC med Ad5f35pp65 vektorn vid en MOI per cell av 10 infektiösa enheter. Lägg Vector till varje brunn i en 24-brunnsplatta. Inkubera cellerna under 1,5 timmar. Efter 1,5 timmar tillsattes 1,5 ml / brunn av DC-medium innehållande: 1000 U / ml IL-4, 800 U / ml GM-CSF, 10 ng / ml TNF-alfa, 1 pg / ml PGE-1, 100 ng / ml IL-6, och 10 ng / ml IL-1 beta. Dessa cytokiner mogna DCS.
3. Generering av EBV-LCL (med start på dag 0)
- Centrifugera röret innehållande de 5 x 10 6 mononukleära celler. Tillsätt 200 pl koncentrerad EBV B95.8 supernatanten och 1,8 ml av komplett medium (RPMI + 10% FBS + 2 mM L-glutamin) innehållande cyklosporin (1 pg / ml).
- Alikvotera 100 pl celler i 10 brunnar i en 96-brunnsplatta och 200 il i 5 brunnar. Tillsätt 100 pl komplett medium + cyklosporin till brunnarna innehållande endast 100 | il celler. Fyll återstående brunnarna med sterilt vatten.
- Mata LCL vecka och expandera från en 96-brunns platta till en 24-brunnsplatta efter ~ 2 veckor. Efter en vecka, över till en T25 kolv och i den efterföljande veckan överföring tillen T75 kolv. I detta skede är det rekommenderat att du fryser portioner av LCL. Det tar vanligtvis 1 månad för att generera tillräckligt antal LCL.
4. CTL Initiering - 7 dagar efter påbörjad DC
- Harvest DCS och bestråla vid 30 Gy. Tvätta 4 x och räkna. Återsuspendera DC i T-cell-medium innehållande humant serum (45% RPMI, 45% Clicks, 10% humant serum, 2 mM L-glutamin) @ 1 x 10 5 DC / ml.
- Tina icke-adherenta celler från steg 2,2. Tvätta cellerna, och räkna. Återsuspendera vid 2 x 10 6 icke-adherenta celler / ml i T-cell-medium innehållande humant serum. Tillsätt 10 ng / ml IL-7 och IL-12, och 5 ng / ml IL-15. Tillsätt 1 ml av celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Tillsätt 1 ml av DC per brunn. Fylla tomma brunnar i 24-brunnsplatta med sterilt vatten.
- 7 dagar efter T-cell initiering, foder och / eller dela cellerna med T-cell media som innehåller humant serum.
- 9-12 dagar efter T-cell initiering, frysa T-cellerna tills LCL är redo.
- Once LCL har expanderat och körning på T75 kolvar, omvandla LCL genom centrifugering i 5 minuter @ 400 x g. Lägg vektorn till cellpelleten vid ett MOI av 100 infektiösa enheter per cell. Inkubera under 1,5 timmar. Efter 1,5 timmar, Återsuspendera i komplett medium vid 5 x 10 5 LCL / ml och tillsätt 2 ml per brunn i en 24-brunnars platta. 12
- Efter 2 dagar, skörda LCL och bestråla vid 40 Gy. Tvätta 4 x och räkna. Återsuspendera LCL i T-cell-medium innehållande humant serum vid 2,5 x 10 5 celler / ml. Tillsätt 1 ml av LCL per brunn i en 24-brunnsplatta. Lägg också till 5 x 10 6 LCL till en Grex40 kultur enheten samt 5 ng / ml IL-15. 13
- Skörda T-cellerna. Centrifugera i 5 minuter @ 400 xg, aspirera supernatanten och återsuspendera i T-cell-medium innehållande humant serum vid 1 x 10 6 T-celler / ml. Tillsätt 5 ng / ml IL-15 och tillsätt 1 ml / brunn av T-celler (totalt 1 x 10 6 T-celler) till LCL som redan finns i 24-brunnars platta. I Grex40, taden totala volymen av media upp till 30 ml.
- På dag 3-4 efter stimulering, om cellerna är sammanflytande sedan dela dem (i plattan) 1:1 och lägga till färska medier innehållande 50 U / ml IL-2. Om de inte är sammanflytande sedan helt enkelt suga ½ media och ersätt med media som innehåller 50 U / ml IL-2. I Grex40 Aspirera halv media, ersätt med färskt medium, och tillsätt 50 U / ml IL-2.
- På dag 7, upprepa såsom i steg 4,6 men använder IL-2 på dag stimuleringen, inte IL-15.
5. Representativa resultat
En schematisk bild av GMP-kompatibla FDA-godkända tillverkning protokoll avbildas i figur 1. Processen tar cirka 50 dagar. Typiska metoder för att generera virus-specifika T-celler expandera befintliga celler minnes-T, men saknar navelsträngsblod virus erfarna T-celler och därför måste vi prima naiva T-celler ex vivo. För att göra det använder vi dendritiska celler samt cytokiner IL-7, IL-12 och IL-15,nödvändig för att alstra virala specificitet.
Efter 3 stimuleringar ska avkastningen vara över 100x10 6 celler. Om tillräckligt många celler inte finns tillgängliga kan ytterligare stimuli utföras förrän önskat antal CTL finns tillgängliga. Majoriteten av dessa celler bör vara CD3 + med en blandning av CD4 + och CD8 + T-celler. Det bör vara mindre än 15% NK-celler (CD3-/CD56 +) och mindre än 1% CD19 + B-celler (figur 2).
Den utökade CTL bör erkänna antigenet pp65 från CMV, hexon och Penton från adenovirus, liksom många EBV-antigener som uttrycks på EBV-LCL. När de testades i en ELISPOT-analys, bör CTL utsöndrar mer IFN-y som svar på dessa antigener än irrelevanta antigener (Figur 3).
CTL bör också lyserar virala peptid-pulsade mål sådana PHA-blaster. I en 51 Cr frisättningsanalys bör CTL lyserar LCL, CMVpp65-pulsade och adenovirus hexon-och /eller Penton-pulsade mål, men inte mål pulsad med irrelevanta peptider (Figur 4).
Figur 1. Generering av flera virus-specifika CTL från navelsträngsblod. Schematisk bild som visar hela processen av CTL tillverkning från navelsträngsblod. Först navelsträngsblod mononukleära celler isoleras från 20% fraktionen av fraktionerade navelsträngsblodet enhet. Med undantag av 5x10 6 celler som sparas för LCL generering, är alla celler pläterades sedan i dendritiska celler media under 1-2 timmar, vid vilken tidpunkt de icke-adherenta cellerna skördas och fryses. DC matas sedan DC-medium innehållande IL-4 och GM-CSF. Efter 5 dagars odling, är DC mognat och transduceras med en adenovirusvektor innehållande den immunodominanta CMV pp65-antigen. Vid initiering är dessa DC kombineras med de icke-adherenta cellerna liksom cytokiner IL-7, IL-12,och IL-15. Vid efterföljande stimuleringar används samma adenovirala vektor som används för att transducera EBV-LCL, som används som antigenuppvisande celler. IL-15 används vid den andra stimulering och IL-2 därefter.
Figur 2. Fenotyp av resulterande T-celler. Visas är den procentuella andelen av levande celler som ingår i lymfocytinramningen. CTL är CD3 + och CD4 + eller CD8 + men i stort sett CD3-/CD56- och CD19-.
Figur 3. T-cell funktion. T-cell-specificitet testades genom IFN-γELISPOT. T-celler pulsades med överlappande peptider som spänner över hela proteinet av hexon, Penton, pp65, och irrelevant antigen IE-1. CTL enbart indikerar enbart medium. Autolog LCL bestrålades och läggas till 1x10 5 / brunn. Visas är medelvärdet platsen bildar cell count av triplikatbrunnar.
Figur 4. Cytolytisk aktivitet av CTL. Förmågan hos den resulterande CTL att lysera mål uttryckande virala antigener testades i en 51 Cr-analys. 51 Cr-märkta autologa PHA-blaster pulsades med överlappande peptider som spänner över hela antigenet eller 51 Cr-märkta autolog LCL samodlades med CTL. Efter 4 timmar tillsattes gamma frisättning räknades på en gammaräknare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nuvarande strategier som syftar till att kontrollera virusinfektioner efter KBT kan vara effektiva, men de är associerade med betydande toxicitet, är dyra och ger inte långsiktigt skydd mot senare infektion. I själva verket kan användningen av vissa antivirala läkemedel begränsa expansionen av virus-specifika T-celler som annars skulle vara skyddande. 14 Ett annat alternativ är infusion av donator-härledda virus-specifika T-celler. Vi och andra har visat att sådana T-celler är säkra, effektiva och kostnadseffektiva. 15-17 Här visar vi att detta tillvägagångssätt också kan utsträckas till navelsträngsblod.
Det är absolut nödvändigt att använda aseptisk teknik vid odling humana primära celler. På grund av den naiva karaktären av T-cellerna, är det också viktigt att humant serum används i alla medier som kräver serum. Enligt vår erfarenhet kommer FBS produkter som innehåller resultera i en massiv expansion av T-celler riktade proteiner från FBS.
ve_content "> När isolering av de mononukleära cellerna med användning av Ficoll-gradient, är det ofta svårt att utesluta röda blodkroppar, eftersom många kärnförsedda och inte lyserades av röda blodkroppar lysbuffert. Om antalet röda blodkroppar är överdriven, kan produkten re -ficolled.Medan metoden här är begränsad till utbyggnaden av virus-specifika T-celler-dvs CMV, EBV, och adenovirus-det är tillämpligt på genereringen av andra antigen-specifika T-celler från navelsträngsblod samt. Användningen av dendritiska celler och den ovan nämnda cytokin cocktail är en potent stimulator av naiva T-celler och bör driva expansionen av antigenspecifika CTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Dan L. Duncan samarbete forskningsanslag (CMB och EJS) National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), en leukemi och lymfom Society Clinical Research Scholar utmärkelse (CMB) och National Cancer Institute (RO1 CA06150816, EJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
- Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
- Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
- Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
- Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
- Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
- O'Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
- Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
- Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
- Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
- Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
- Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
- Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
- Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
- Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
- Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
- Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).
