Summary
여기가 첫 번째 좋은 생산 관행 (GMP)을 준수하는 탯줄 혈액, 주로 나이브 T 세포의 소스에서 바이러스 특정 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 생산 방법을 설명합니다.
Abstract
줄기 세포 이식 후 바이러스 감염, 특히 탯줄 혈액 후, 죽음의 가장 일반적인 원인 중 일부입니다 (CB) 이식 (CBT) 어디 CB가 감염에서 수신자를 보호 할 수 있습니다 바이러스 경험이 풍부한 T 세포 1 감지 숫자가 포함되어 있지 않습니다. - 우리와 다른 사람들이 바이러스에 특정한 CTL seropositive 기증자에서 생성하고받는 사람에게 주입하는 것으로 나타났습니다 4 안전하고 보호합니다. 5-8는하지만, 최근까지 바이러스 특정 T 세포가로 인해 가능성, 탯줄 혈액에서 생성 할 수 없습니다 바이러스 특정 메모리 T 세포의 부재.
더 나은 나이브 T 세포의 생체 프라이밍 조건에서을 모방하기 위해, 우리는 따라서 T 세포 특이성 운전, CB-파생 수지상 세포 (DC)은 immunodominant CMV의 항원 pp65을 포함하는 adenoviral 벡터 (Ad5f35pp65)과 transduced 사용 방법을 설립 시작시 CMV와 아데노 바이러스 9.을 향해, 우리는 이러한 mA를 사용tured 코디네이터뿐만 아니라 모두를 표현 IL-7, IL-12와 IL-15. 두 번째 우리가 EBV-변환 B 세포를 사용 자극, 또는 EBV-LCL, 10 크린 시토 킨의 존재에 CB-파생 T 세포 잠재 및 lytic EBV의 항원. Ad5f35pp65 - transduced EBV-LCL은 두 번째 자극의 IL-15의 존재에 T 세포를 자극하는 데 사용됩니다. 이후 stimulations는 EBV-LCL 및 IL-2 Ad5f35pp65 - transduced을 사용합니다.
50x10 6 CB mononuclear 세포부터 우리는 antigenic의 자극에 대한 응답으로 항원 펄스 목표 및 출시 크린 시토 킨을 lyse 150 X 10 6 바이러스 특정 T 세포의 이상을 생성 할 수 있습니다. 11이 세포를 사용하여 GMP 호환 방식으로 제조 된 단 20 % fractionated 탯줄 혈액 단위의 분율하며 임상 사용하기 위해 번역되었습니다.
Protocol
1. Mononuclear 세포 절연 (일 0)
- 탯줄 혈액 단위의 20 % 분수의 출구 포트에 여성 luer 어댑터의 스파이크를 삽입하고, 주사기를 연결하고 피를 제거합니다. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 따뜻하게 RPMI의 20 ML에 해동 혈액을 전송합니다. RPMI의 5 ML과 탯줄 혈액 가방을 헹굼과 동일한 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 400 X g에서 10 분 동안 세포를 원심 분리기. 표면에 뜨는을 대기음.
- 따뜻한 RPMI의 20 ML에 세포를 Resuspend. 50 ML의 원심 분리기 튜브의 Lymphoprep의 15 ML로 레이어 세포. 40분 @ 400 X g을 원심 분리기.
- mononuclear 세포를 포함하는 인터페이스를 수확하고 RPMI의 20 ML에 씻는다. 십분 @ 450는 x g 용 원심 분리기.
- 표면에 뜨는을 기음과 RPMI의 20 ML에 씻는다. 세포를 세어 5 분 @ 400 X g에 스핀.
- 5시 표면에 뜨는 및 resuspend 세포를 대기음 X 10 6 mononuclear 세포 / Cellgenix DC 미디어 (혈청 무료)의 ML. EBV-LCL 세대 1 ML를 제거하고 15 ML CE에 투입관을 ntrifuge.
2. 수지상 세포 생성 (일 0에 시작)
- 세포의 판 2 ML은 당 잘 6 잘 판에 (5 X 10 6 세포 / DC의 미디어 ML에 이미 있습니다.) 1-2시간에 대한 보육에 둡니다.
- 1-2시간 후, PBS로 3-4 회 세척하여 비 점착성의 세포를 씻어. 비 점착성의 세포와 동결을 수집합니다. 2 ML / 잘 1000 U / ML IL-4 및 800 U / ML GM-CSF를 포함하는 DC 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 3-4일 DC 개시 후, 100을 추가 μL / 우물 1000U/mL IL-4 및 800 U / ML GM-CSF의 최종 농도를 포함하는 미디어에 의해 IL-4 및 GM-CSF를 보충.
- 일 5-6, 수확 전송 피펫으로 잘를 스크랩하여 DC에. 오분 @ 400 X g의 큰 세포와 원심 분리기를 계산합니다. 2x10 6 셀 / DC의 미디어 ML의 기음 미디어 및 resuspend DC. / 잘 24 잘 접시의 0.5 ML를 추가합니다.
- 10 전염성 단위의 전부다 당 셀에 Ad5f35pp65 벡터를 사용하여 DC를 Transduce. vecto을 추가24 잘 플레이트의 각도에 연구. 1.5 시간에 세포를 배양. 1.5 시간 후, / 잘 DC 미디어 함유의 1.5 ML를 추가합니다 : 1000 U / ML IL-4, 800 U / ML GM-CSF, 10 NG / ML TNF-알파, 1 μg / ML PGE-1, 100 NG / ML IL-6, 10 NG / ML IL-1beta. 이러한 크린 시토 킨은 지구 코디네이터를 성숙.
3. EBV-LCL의 세대 (일 0에 시작)
- 5 X 10 6 mononuclear 세포를 포함하는 튜브를 원심 분리기. 농축 EBV B95.8 표면에 뜨는 200 μL하고 완벽한 미디어 1.8 ML (RPMI + 10% FBS + 2mM L-글루타민) 함유 시클로 스포린 (1 μg / ML)를 추가합니다.
- 96 - 웰 플레이트의 10 우물, 5 우물에 200 μL에 세포의 나누어지는 100 μL. 세포의 단 100 μL를 포함하는 우물에 전체 미디어 + 시클로 스포린의 100 μL를 추가합니다. 멸균 물에 남아있는 우물을 입력합니다.
- LCL 매주을 먹이고 ~ 2 주 후에는 24도 판에 96 - 웰 플레이트에서 확장합니다. 다른 주 후, T25 플라스크에 전송하고 다음 주 이전에에T75 플라스크입니다. 이 단계에서 귀하가 LCL의 aliquots를 고정하는 것이 좋습니다. 그것은 일반적으로 LCL의 충분한 숫자를 생성 할 수 1개월 소요됩니다.
4. CTL 개시 - 칠일 코디네이터의 개시 후
- 30 GY에서 수확 DCS 및 비추다. 4 x와 수를 씻으십시오. 인간의 혈청 (45 % RPMI, 45% CLICK의, 10 % 인간의 혈청, 2mM L-글루타민) @ 1 × 10 5 DCS / ML.를 포함하는 T 세포의 미디어에 Resuspend DC
- 단계 2.2의 비 점착성의 세포를 해동. 세포를 씻어하고 계산합니다. 2 X 10 6 비 점착성의 세포 / 인간의 혈청을 포함하는 T 세포의 미디어 ML에 Resuspend. 10 NG / ML IL-7, IL-12, 5 NG / ML IL-15을 추가합니다. 한 셀의 ML 당 잘 24 잘 판에 추가 할 수 있습니다. 당 잘 DC의 1 ML을 추가합니다. 멸균 물과 24 잘 접시의 빈 우물을 입력합니다.
- 칠일 T 세포의 개시 후, 피드 및 / 또는 인간 혈청을 포함하는 T 세포 미디어와 세포를 분리.
- LCL 준비가 될 때까지 9~12일 T 세포의 개시 후 T 세포를 동결.
- OLCL은 확장하고 T75 플라스크에 passaged 아르 nce 5 분 @ 400 X g 용 centrifuging하여 LCL을 transduce. 나 역시 셀 100 전염성 단위의에서 세포 펠렛에 벡터를 추가합니다. 1.5 시간 품다. 후 5 × 10 5 LCL / ML에서 전체 미디어에 resuspend과 24 잘 판에 당 잘이 ML을 추가 1 시간 30 분, 12.
- 이일 후, 40 GY에서 LCL과 비추다 수확. 4 x와 수를 씻으십시오. 2.5 × 10 5 세포 / ML에서 인간의 혈청을 포함하는 T 세포 미디어에서 LCL을 Resuspend. 한 LCL의 ML 당 잘 24 잘 플레이트를 추가합니다. 또한, Grex40 문화 장치에뿐만 아니라 5 NG / ML IL-15 5 X 10 6 LCL를 추가합니다. 13
- T 세포를 수확. @ 400 XG 5 분 원심 분리기는 표면에 뜨는을 대기음, 1 X 10 6 T 세포 / ML에서 인간의 혈청을 포함하는 T 세포의 미디어에 resuspend. 5 NG / ML IL-15을 추가하고 24 잘 판에 이미있는 LCL에 1 ML / 잘의 T 세포 (1 × 10 6 T 세포의 총)를 추가합니다. Grex40에서 가져30 ML에 미디어의 총 볼륨입니다.
- 세포가 합류하는 경우 일 3-4 후 자극에 다음 (판)을 1:1으로 분할 50 U / ML IL-2를 포함하는 새로운 미디어를 추가 할 수 있습니다. 그들은 합류하지 않은 경우 다음 단순히 ½ 미디어를 대기음 50 U / ML IL-2를 포함하는 미디어로 교체하십시오. Grex40에서, 절반 미디어를 대기음 신선한 미디어로 교체, 50 U / ML IL-2를 추가합니다.
- 일 7 단계 4.6에서와 같이 반복하되 IL-15, 자극의 일에 IL-2 사용하지 않을.
5. 대표 결과
GMP 준수 FDA 승인 제조 프로토콜의 개략도는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 과정은 약 50 일이 소요됩니다. 그러나, 코드 혈액은 바이러스 경험이 풍부한 T 세포 부족하고 따라서 우리는 주요 순진 T 세포의 예를 생체에 필요, 바이러스 특정 T 세포는 기존의 메모리 T 세포를 확대 생성의 전형적인 방법. 이렇게하려면 우리는 IL-12, 그리고 IL-15, 수지상 세포뿐만 아니라 크린 시토 킨 IL-7을 사용하여바이러스 특이성을 생성에 필요한.
3 stimulations 후, 수율은 100x10 6 셀 이상이어야합니다. 충분한 세포를 사용할 수없는 경우 CTLs의 원하는 번호를 사용할 수 있습니다 때까지 추가 stimulations을 수행 할 수 있습니다. 이 세포의 대부분은 CD4의 혼합물 +와 CD8 + T 세포와 3 번 CD +해야합니다. 이하 15 % 이상 NK 세포 (CD3-/CD56 +) 및 1 % 미만 CD19 + B 세포 (그림 2)이 있어야합니다.
확장 된 CTL은 아데노 바이러스에서 CMV, hexon 및 penton에서 항원 pp65을 인식뿐만 아니라, EBV-LCL에 표현 수많은 EBV의 항원해야합니다. ELISPOT 분석에서 테스트 할 때 CTL이 분비해야 더 IFN-? 관련이없는 항원 (그림 3)보다 이러한 항원에 대응 인치
CTL은 또한 바이러스 성 펩타이드 - 펄스 대상 한테 그런 PHA의 폭발을 lyse해야합니다. 51 크롬 자료 분석에서, CTL은 CMVpp65-펄스와 아데노 바이러스, LCL을 lyse해야 hexon 및 /또는 대상 penton - 펄스 수 있지만이 무관 한 펩티드 (그림 4)와 펄스 타겟팅 할 수 있습니다.
그림 1. 탯줄 혈액에서 여러 바이러스에 특정한 CTL의 세대. 탯줄 혈액에서 CTL 제조의 모든 과정을 보여주는 설계도. 먼저 탯줄 혈액 mononuclear 세포는 fractionated 탯줄 혈액 단위의 20 % 분율으로부터 격리되어 있습니다. LCL 생성에 저장됩니다 5x10 6 세포를 제외한 모든 세포는 다음 비 점착성의 세포 수확 및 냉동되는 시점에, 1-2 시간 동안 수지상 세포 미디어에 도금되어 있습니다. DC 그런 다음 DC 미디어 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 공급하고 있습니다. 문화 5 일 후, DC는 성숙되고 immunodominant CMV pp65 항원을 포함하는 adenoviral 벡터와 transduced. 시작시,이 DC는 비 점착성의 세포뿐만 아니라 크린 시토 킨 IL-7, IL-12와 결합되어와 IL-15. 다음 stimulations에서 같은 adenoviral 벡터는 항원 제시 세포로 사용되는 EBV-LCL을 transduce하는 데 사용됩니다. IL-15은 두 번째 자극과 IL-2 이후에 사용됩니다.
그림 2. T 세포를 결과의 표현형. 표시하면 림프구 문에 포함 된 라이브 세포의 비율입니다. CTL은 3 번 CD +와 CD4 + CD8 + 또는하지만 대부분 CD3-/CD56-이며 CD19 -.
그림 3. T 세포 기능. T 세포 특이성은 IFN-γELISPOT에 의해 테스트되었습니다. T 세포는 중복 펩티드는 hexon, penton, pp65의 전체 단백질을 걸친으로 펄스과 관련이없는 항원 IE-1되었다. 혼자 CTL 혼자 미디어를 나타냅니다. Autologous LCL은 방사선 및 1x10 5 / 잘에 추가되었습니다. 표시하는 셀 C를 형성 평균 곳입니다세중의 우물의 ount.
그림 4. CTL의 Cytolytic 활동. 바이러스 항원을 표현 대상을 lyse 할 수있는 결과 CTL의 능력은 51 크롬 분석에서 테스트되었습니다. 51 CR-라벨 Autologous PHA의 폭발이 중복되는 펩티드는 전체 항원 또는 51 LCL은 CTL과 cocultured 된 Autologous CR-라벨에 걸쳐와 펄스되었습니다. 4시간 후, 감마 자료는 감마 카운터에 계산되었습니다.
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Discussion
CBT 이후 바이러스 감염을 제어하기위한 현재의 전략은 효과적 일 수 있지만, 그들은 상당한 toxicities와 관련된, 비싸고, 나중에 감염에 대한 장기적인 보호를 부여하지 않습니다. 사실, 일부 바이러스 약물의 사용은 다른 보호 될 바이러스 특정 T 세포의 확장을 제한 할 수 있습니다. 14 또 다른 옵션은 기증자 파생 바이러스 특정 T 세포의 주입이다. 우리와 다른 사람들이 이러한 T 세포가 여기에 안전하고 효과 및 비용 효과. 15-17아르 것으로 나타났습니다, 우리는이 접근 방식도 탯줄 혈액으로 확장 할 수 보여줍니다.
그것은 무균 기술을 배양 인간의 기본 세포 사용하는 필수적입니다. 때문에 T 세포의 순진한 성격, 인간 혈청을 혈청 필요로하는 모든 미디어에서 사용하는 것 또한 중요합니다. 우리의 경험에서 FBS 함유 제품은 FBS에서 파생 단백질을 대상으로 T 세포의 대규모 확장 될 것입니다.
적혈구의 수가 과도 경우 ve_content는 "> Ficoll 기울기를 사용하여 mononuclear 세포를 분리 할 때, 많은 적혈구 용해 버퍼에 의해 nucleated 및 lysed하지 않기 때문에 적혈구를 제외하는 것이 어렵습니다., 제품을 다시 할 수 있습니다 - ficolled.여기 방법은 바이러스 특정 T 세포 - 즉 CMV, EBV, 그리고 아데노 바이러스 - 그뿐만 아니라 탯줄 혈액에서 다른 항원에 특정한 T 세포의 생성에 적용됩니다.의 확장으로 제한되어 있지만 수지상 세포와 위에서 언급 한 시토 킨 칵테일의 사용은 순진 T 세포의 강력한 stimulator이며, 항원 특정 CTL의 확장을 유도해야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 수 없어요.
Acknowledgments
이 작품은 단 L. 던컨 공동 연구 기금 (CMB와 EJS), 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (US4HL081007), 백혈병 및 림프종 학회 임상 연구 학술 상 (CMB) 및 국립 암 연구소에 의해 지원되었다 (RO1 CA06150816, EJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
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