Summary
我们证明由拓扑异构酶蛋白驱动的分子尺度器件的组装和应用。构造是一个标签由组织切片中的DNA断裂的两个主要类型，其两端连接两个不同的荧光团的生物分子传感器。
Abstract
自然发生的生物分子机器工作在每一个活细胞，并显示各种设计1-6。然而，人工分子机器设备上，即分子马达定向运动的能力，以及按比例缩小的机械部件（车轮，axels，吊坠等）7-9的中心发展。这模仿的宏观机，这些设备的基本的物理性质，化学性质，如惯性和动量守恒，即使不是在10纳米世界环境使用。替代设计，不按机械macromachines计划和使用生物分子的进化发展的机制，可以利用纳米世界的具体条件优势。此外，适应实际的生物分子纳米设计的目的，降低了纳米技术的产品可能会造成的潜在危险。在这里，我们展示了这样一个启用生物构造的组装和应用，EMI人工分子器件相结合的人工组件的一个自然发生的分子机器。从酶学点来看，我们的结构是一个设计师荧光酶 - 底物复合物放在一起执行特定的有用的功能。这个大会是由定义的分子机器，因为它包含一个 12 。然而，其一体化工程的一部分-荧光双发夹-重新定向到一个新的任务标签DNA损伤12。
我们的构造，组装出32 MER DNA和一种酶的牛痘拓扑异构酶I（VACC TOPO）。本机，然后使用自己的材料来制造两个荧光标记的检测器（图1）。单位之一（绿色荧光）进行VACC TOPO的共价连接到其3'end和另一个单位（红色荧光），是同一个终端3'OH发夹。的单位是短命的，并迅速重新组合成原来的构造，随后recleaves。在DNA的情况下，打破了这两个循环的方式不断独立和religate单位。在与DNA损伤，探测器单元的拓扑异构酶选择性重视5'OH（DNA酶II型断裂）11,12平末端的DNA断裂，荧光标签的组织切片。第二，酶寡核苷酸裂解后形成的发夹，将结扎一个5'PO 4钝端突破（DNA酶I型断裂）11,12，T4 DNA连接酶是在解决方案 13,14中。当T4 DNA连接酶将被添加到一个组织部分或溶液中的DNA与5'PO 4休息钝端，连接酶与5'PO 4 DNA末端反应，形成半稳定酶- DNA复合物。钝端发夹将与这些复合物释放的DNA连接酶和共价连接的发夹，从而标签5'PO 4平末端的DNA断裂。
这方面的发展充分体现了新的切实可行的办法，以日E的分子机器的设计，并提供有用的一个固定的细胞和组织的细胞凋亡和DNA损伤检测传感器。
Protocol
分子机器的检测部分，首先是因为他们的准备需要更多的时间比分子器件的装配，应准备。兴建工程，以及5 -6μm厚的部分切多聚甲醛固定，石蜡包埋组织块。使用幻灯片的品牌如ProbeOn另外收取和precleaned幻灯片“（Fisher Scientific这）或类似的保留部分，。我们建议在第一次使用与知名的DNA损伤的模式，其中包含两个DNA酶I -和DNase II型断裂，如地塞米松治疗的细胞凋亡大鼠胸腺13,14 ，一个组织。
1。节的制备
- 放置在幻灯片机架和二甲苯脱蜡15分钟的部分，转移到了一个额外的5分钟的新鲜二甲苯浴。
- 经过梯度乙醇浓度，补充水分：96％乙醇2x5min; 80％的乙醇 - 5分钟;水 - 2X5分钟。
- 精华部分与Proteinas发送光使用100μL，每节50μg/mL的解决方案。孵育15'在湿盒室温（23℃）。取决于组织类型，时间可能需要调整。硬组织可能需要更长的消化。 15-25分钟的时间通常使用。消化不足可能会导致信号较弱。另一方面过量信号消失和部分中断。
- 在蒸馏水冲洗2X10分钟。
- 应用100μL2％BSA preblocking每节。孵育15分钟在室温（23℃）。在这段时间内的分子机器组装。
2。分子机器装配
所有试剂比例为25μL总体积，这是足以在一个平均大小的组织切片（10x10mm）的单一检测。根据需要可以扩展该卷。
- 在一个小塑料管相结合的顺序如下：
|
- 轻轻吹打混合。几乎立刻自组装的分子构造在此解决方案，可用于立即在室温（23℃）。提高温度至37 ° C块的T4 DNA连接酶为基础的组件标签。
3。在组织切片双标签5'OH和5'PO4 DNA断裂的分子机器
- 吸preblocking解决方案，并申请25μL混合充分反应，含有70 pmoles寡核苷酸1，53 - 215 pmoles（1.76 - 7.1微克）VACCTOPO和10个单位的T4 DNA连接酶（500 U / mL）的66毫米的Tris盐酸，pH值7.5，2 5毫米氯化镁，0.1毫米dithioerythritol，1毫米的ATP和15％聚乙二醇8000解决方案。相同的序列寡携带一个单一的FITC标记的标签，寡核苷酸2，可以用来代替单一类型的DNA断裂的检测。在这种情况下，省略连接酶标记反应。 50MM的Tris - HCl，pH值7.4，解决方案，同时在这种情况下15％PEG - 8000可以用来代替T4 DNA连接酶缓冲。
- 在室温（23℃），在一个用塑料盖玻片的湿盒孵育1小时。防止光线照射。温度降低到16 ° C降低连接酶为基础的信号，温度升高至37 ° C完全消除了连接酶为基础的信号。部分抑制，有时会出现一个连接酶在反应混合物，可能是由于与拓扑异构酶制剂引入的污染物。因此，潜伏期较长（2-4小时），可能需要，尤其是当S连接酶标记符的ignificant号码都存在。连接酶信号连接酶和Topo信号虽然可以观察到在这个阶段，在许多情况下，可以重新申请反应组合进一步加强，没有VACC TOPO和双标记的寡核苷酸，但包含一个发夹形的寡核苷酸（核苷酸3） （35毫克/毫升）和T4 DNA连接酶（250 U /毫升）。为了提高信号进行第3步，见没有反应增强转到步骤5。
- 取出盖玻片，轻轻地沉浸在Coplin在室温下的水罐子的幻灯片垂直。吸干多余的水分。
- 加强连接酶信号申请没有VACC TOPO和寡核苷酸1 25μL反应混合物，但含有寡核苷酸3：66毫米三盐酸，pH值7.5，MgCl 2的 5毫米，0.1毫米dithioerythritol，1毫米ATP，15％的聚乙二醇8000，5个单位的T4 DNA连接酶，35毫克/毫升寡核苷酸3（钝结束发夹）。总体积的标签解决方案CAn是扩大规模，以适应更大的部分。在室温（23℃），在一个用塑料盖玻片的湿盒孵育18小时（过夜）。
- 取出盖玻片，轻轻地沉浸在Coplin在室温下的水罐子的幻灯片垂直。然后洗节3x10分钟蒸馏水。
- 与碳酸氢钠液冲洗。碱性溶液冲洗增强FITC荧光，这是pH敏感，并显著降低pH值低于7。
- 抗衰落的解决方案（用DAPI Vectashield），盖玻片覆盖的部分，并用荧光显微镜分析信号。与5'OH双链DNA断裂会发出荧光绿，5'PO 4游-会发出荧光红色（图2）。
4。代表性的成果
图1半人工分子机器检测两类。DNA损伤原位 。荧光机自组装时VACC TOPO的结合双发夹的32 - mer。机器开始分为两个检测器的操作通过分裂本身拓扑异构酶切识别序列3'端。这会导致一个循环过程，FITC标记的单位不断分离罗丹明标记的单位和religates。这种情况持续存在，直到遇到了可检测的DNA断裂。当这种替代受体（5'OH钝端DNA断裂）是在组织切片中，FITC标记的一部分，将结扎。其余诺丹明部分将到5'PO 4 DNA T4 DNA连接酶的帮助下钝断头的重视。因此，同时检测DNA断裂两种类型。
图2。分子机器两种类型的DNA断裂的双重标签在地塞米松治疗的胸腺组织部分。我和DNase II型平末端的DNA断裂的DNA酶在胸腺皮质区凋亡检测。细胞质绿色荧光（5'OH DNA断裂），标志着消化皮质巨噬细胞凋亡的胸腺细胞的核材料。这个信号是由VACC TOPO中，定位与DNA含有5'OH双链断裂11,12 phagolysosomes。红色荧光（5'PO 4休息时间）标 签不是由巨噬细胞吞噬的凋亡胸腺细胞的细胞核。胸腺细胞大规模同时进行伴随着一代5'PO 4双链断裂的细胞凋亡，通过连接酶为基础的标签的可视化。这些休息是位于核周边，形成环形图案。所有细胞的细胞核用DAPI（蓝色荧光）counterstaining可视化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这段视频中，我们将演示如何组装和使用双标签的DNA损伤传感器。传感器是一个由生物分子发动机，病毒编码的蛋白质VACC TOPO的人工组件联系在一起驱动的分子机器。所提出的发展充分体现了一个生物功能的做法，主张适应的无毒分子尺度器件12,15设计的生物结构，架构和实际零件和电池组件。这种方法可以解决两个问题的内在体内的纳米传感器的领域： 1。使用传统的纳米材料的真正统一和重复性的纳米结构的难度;和2。潜在的毒性，高的纳米探针，粒子和其他高度分散的纳米材料的生物反应。该传感器可与人工重新定向到一个新的DNA损伤的标签功能的组件的一个自然发生的分子机器。这种一体化的产品是SEMI -人造分子机器定位到一个新的任务。拓扑异构酶，聚合酶和其他酶机经常用于生化研究，他们没有整合成单个分子组装与工程部件。因此在日常的使用中，他们受聘为半人工设备 12 。
在这里，我们展示了如何使用在组织切片格式同时标签我和DNase II型断裂的DNA酶传感器。目前有没有其他方法可用来执行同步双检测。
DNA酶我和DNase II型断裂的细胞死亡进程的重要标志，具体标注自我的自主性和吞噬细胞凋亡阶段11,16。该传感器是一个有益的补充，以处理与细胞凋亡的检测和细致刻画的生物医学研究阿森纳。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究得到了授予R01NS062842国家神经紊乱和中风研究所，国立卫生研究院（VVD）和国立神经疾病和中风，国家卫生研究院通过复苏法案（VVD）和R21的R21 NS064403补助EB006301国家生物医学成像和生物工程研究所，国立卫生（VVD）研究院。
References
- Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
- Schuldt, A.
- Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
- Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
- McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
- Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
- Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
- Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
- Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
- Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
- Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
- Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
- Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
- Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).
