En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

Summary

Demostramos la asamblea y la aplicación de un dispositivo a escala molecular, alimentado por una proteína de la topoisomerasa. La construcción es un sensor bio-molecular que las etiquetas de dos grandes tipos de ADN se rompe en secciones de tejido uniendo dos fluoróforos diferentes a sus fines.

Abstract

De origen natural bio-molecular máquinas trabajan en todas las células vivas y mostrar una gran variedad de diseños ^1-6. Sin embargo, el desarrollo de máquinas moleculares artificiales centros de dispositivos con capacidad de movimiento direccional, es decir, los motores moleculares, y en su reducida partes mecánicas (ruedas, ejes, etc colgantes) ^7-9. Esto imita las máquinas macro-, a pesar de que las propiedades físicas esenciales para estos dispositivos, como la inercia y la conservación del momento, no se pueden usar en los entornos nanomundo ^10. Diseños alternativos, que no siguen los esquemas mecánicos macromachines y utilizar los mecanismos desarrollados en la evolución de las moléculas biológicas, pueden tomar ventaja de las condiciones específicas del nanomundo. Además, la adaptación real de las moléculas biológicas con fines de nano-diseño reduce los peligros potenciales de los productos la nanotecnología puede plantear. Aquí se demuestra el montaje y la aplicación de uno de estos bio-permitió construir, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina una máquina molecular de origen natural con componentes artificiales. Desde el punto de vista de la enzimología, nuestra construcción es un diseñador fluorescentes complejo enzima-sustrato juntos para realizar una función útil específica. Este conjunto es, por definición, una máquina molecular, ya que contiene un ^12. Sin embargo, su integración con la parte de ingeniería - horquilla de doble fluorescente - que re-dirige a una nueva tarea de etiquetado daño en el ADN ^12.

Nuestra construcción ensambla de un ADN de 32-mer y una enzima topoisomerasa I vaccinia (VACC TOPO). La máquina usa su propio material para la fabricación de dos unidades de la etiqueta fluorescente detector (Figura 1). Una de las unidades (fluorescencia verde) lleva VACC TOPO covalentemente a su extremo 3 'y la otra unidad (fluorescencia roja) es una horquilla libre con un 3'OH terminal. Las unidades son de corta duración y rápidamente montamos de nuevo en la construcción original, que posteriormente recleaves.En la ausencia de ADN se rompe estas dos unidades separadas y religate continuamente de una manera cíclica. En secciones de tejido con daño en el ADN, el detector de la topoisomerasa-llevar selectivamente se une a roturas en el ADN de extremos romos con 5'OH (DNasa II-tipo se rompe) ^11,12, con fluorescencia que el etiquetado. El segundo, sin enzimas horquilla formada después de la escisión de oligonucleótidos, se ligan a un 5'PO ₄ romos break (DNasa I-tipo se rompe) ^11,12, si la ADN ligasa de T4 está presente en la solución de ^13,14. Cuando la ADN ligasa de T4 se añade a una sección de tejido o una solución que contiene ADN con 5'PO _cuatro extremos romos se rompe, la ligasa reacciona con 5'PO _cuatro extremos de ADN, formando semi-estable enzima ADN complejos. Las horquillas romos va a interactuar con estos complejos de la liberación de ganchos para el cabello ligasa y la vinculación covalente al ADN, por lo que el etiquetado 5'PO ₄ romos roturas en el ADN.

Este desarrollo es un ejemplo de un nuevo enfoque práctico ªdiseño e de máquinas moleculares y ofrece un sensor de útiles para la detección de la apoptosis y el daño del ADN en las células y los tejidos fijos.

Protocol

Las secciones de la máquina molecular basado en la detección deben estar preparados, ya que su preparación requiere más tiempo que el montaje del dispositivo molecular. La construcción funciona bien con 5-6μm de espesor secciones cortadas de paraformaldehído-fijo, los bloques de tejido incluidos en parafina. Utilizar las marcas de diapositivas que conservan secciones, tales como ProbeOn Plus diapositivas cargado y precleaned (Fisher Scientific) o similar. Se recomienda en un primer momento con un tejido con un patrón bien conocido de los daños en el ADN que contiene DNasa I-II y se rompe DNasa tipo, como la dexametasona, tratados con la rata de apoptosis timo ^13,14.

1. Preparación de las secciones

1. Coloque las secciones en un rack de diapositivas y dewax en xileno durante 15 minutos, el traslado a un baño de xileno fresco durante 5 minutos.
2. Rehidratar al pasar por las concentraciones de etanol clasificado: 96% de etanol 2x5min, etanol al 80% - 5 minutos, el agua - 2x5 min.
3. Recopilación de la sección con Proteínase K. Use 100μL de una solución 50μg/mL por sección. Incubar 15 'a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda. El tiempo puede necesitar un ajuste en función del tipo de tejido. Tejidos duros puede requerir más tiempo de digestión. Tiempos de 15-25 minutos se suelen utilizar. Digestión insuficiente puede resultar en la señal más débil. Overdigestion en los resultados por otra parte en la desaparición de la señal y la interrupción sección.
4. Enjuague con agua destilada para min 2x10.
5. Aplicar 100 L por parte del 2% de BSA para preblocking. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente (23 ° C). Durante este tiempo, montar la máquina molecular.

2. Máquinas de ensamblaje molecular

Todos los reactivos se escalan para 25 l de volumen total, lo cual es suficiente para una detección simple en una sección de tamaño del tejido medio (10x10mm). El volumen puede ampliarse según sea necesario.

1. Combine en un pequeño tubo de plástico en este orden:

<tr>

Agua bidestilada; 15% de polietilenglicol-8000; Solución de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, (es decir, regulares amortiguación T4 ADN ligasa); 70 pmoles de oligonucleótido 1, 215 pmoles (1,76 a 7,1 mg) VACC TOPO 10 unidades de T4 ADN ligasa (500 U / mL)

2. Mezclar suavemente con la pipeta. La construcción molecular casi instantáneamente auto-ensambla en esta solución y se puede utilizar de inmediato a temperatura ambiente (23 ° C). El aumento de la temperatura a 37 ° C bloquea la T4 ADN ligasa componente basado en el etiquetado.

3. Uso de máquinas moleculares en secciones de tejido de 5'OH etiqueta de doble y 5'PO4 roturas en el ADN

1. Aspirar la solución preblocking y aplicar 25μL de la mezcla de reacción completa que contiene 70 pmoles de oligonucleótido 1, 53 a 215 pmoles (1,76 a 7,1 mg) VACCTOPO y 10 unidades de T4 ADN ligasa (500 U / ml) en solución de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl _2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, y el 15% de polietilenglicol-8000. La misma secuencia de oligonucleótidos llevar una sola etiqueta FITC, oligonucleótidos 2, se puede utilizar en lugar de para la detección de un solo tipo de roturas en el ADN. En tal caso, omitir ligasa de la reacción de marcaje. También en esta situación una solución de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 15% de PEG-8000 puede utilizarse en lugar de tampón T4 ADN ligasa.
2. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda con un cubreobjetos de plástico. Protegerlo de la luz. Descenso de la temperatura a 16 ° C reduce la señal de la ligasa basado, el aumento de la temperatura a 37 º C elimina por completo la señal de la ligasa basado. Una inhibición parcial de la ligasa a veces ocurre en la mezcla de reacción, posiblemente debido a los contaminantes introducidos en los preparativos topoisomerasa. Por lo tanto, ya la incubación (2-4 horas) puede ser necesario especialmente cuando snúmeros ignificant de la ligasa de la etiqueta se rompe están presentes. Aunque ambos ligasa y las señales de topo se puede observar en esta etapa, en muchos casos la señal de la ligasa puede ser reforzada por una nueva aplicación de la mezcla de reacción sin VACC TOPO y doble etiquetado de oligonucleótidos, pero que contiene un oligonucleótido en forma de horquilla (oligonucleótidos 3) (35 mg / ml) y T4 ADN ligasa (250 U / mL). Para mejorar la señal de siga con el paso 3, para ver la reacción sin aumento vaya al Paso 5.
3. Quitar los cubreobjetos con cuidado la inmersión del desliza verticalmente en un frasco de Coplin con agua a temperatura ambiente. Aspirar el exceso de agua.
4. Mejorar la señal de la ligasa mediante la aplicación de 25 l de mezcla de reacción sin VACC TOPO y oligonucleótidos 1, pero que contienen oligonucleótidos 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl _2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, y el 15% de glicol de polietileno 8000, 5 unidades de T4 ADN ligasa, 35 mg / mL de oligonucleótidos 3 (horquilla romos). El volumen total de la solución de etiquetado can ser ampliado para dar cabida a las secciones más grandes. Incubar durante 18 horas (overnight) a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda con un cubreobjetos de plástico.
5. Quitar los cubreobjetos con cuidado la inmersión del desliza verticalmente en un frasco Coplin con agua a temperatura ambiente. Lavar la sección de 3x10 minutos en agua destilada.
6. Enjuague con tampón de bicarbonato de sodio. Solución alcalina de enjuague mejora FITC fluorescencia, que es sensible al pH y se reduce significativamente por debajo de pH 7.
7. Cubierta de la sección con una solución antifading (Vectashield con DAPI), cubreobjetos y analizar la señal utilizando un microscopio de fluorescencia. De doble hebra de ADN se rompe con 5'OH presenta fluorescencia verde, 5'PO ₄ se rompe - se presentan fluorescencia roja (Figura 2).

4. Resultados representante

Figura 1. Semi-artificial de la máquina molecular detecta dos tipos deDaños en el ADN in situ. La máquina fluorescente cuando se auto-ensambla VACC TOPO se une a la horquilla de doble-32-mer. La máquina empieza a funcionar por sí mismo la división en dos unidades de detector a través de la topoisomerasa-se corta en el extremo 3 'de la secuencia de reconocimiento. Esto se traduce en un proceso cíclico en el cual la unidad marcada con FITC separa continuamente y religates de nuevo a la rodamina marcado con la unidad. Esto continúa hasta que una rotura del ADN detectable se encuentra. Cuando tal aceptor alternativo (5'OH ruptura contundente ADN final) está presente en la sección de tejido, la parte FITC ligará a él. La parte restante de rodamina se adhieren a 5 'PO ₄ rompe extremo romo de ADN con la ayuda de T4 ADN ligasa. En consecuencia, ambos tipos de roturas en el ADN son a la vez detectado.

Figura 2. Etiquetas moleculares de la máquina de doble dos tipos de roturas en el ADNen una sección de tejido de dexametasona tratados con el timo. Romos roturas en el ADN de DNasa I y II DNasa tipo se detectan en las áreas corticales del timo en la apoptosis. Fluorescencia verde frente al citoplasma (5'OH roturas en el ADN) marca macrófagos cortical digerir los materiales nucleares de los timocitos apoptóticos. Esta señal es producida por VACC TOPO, y se localiza en fagolisosomas con el ADN que contiene 5'OH doble filamento se rompe ^11,12. Fluorescencia roja (5'PO _cuatro descansos) los núcleos de las etiquetas de los timocitos apoptóticos no devorados por los macrófagos. Enorme número de timocitos al mismo tiempo la apoptosis acompañada por la generación de 5'PO ₄ de doble cadena se rompe, visualizado por la ligasa basado en el etiquetado. Estos descansos se encuentran en la periferia nuclear, la formación de patrones en forma de anillo. Todos los núcleos celulares son visualizados por la contratinción con DAPI (azul fluorescente).

Discussion

En este video, que muestra cómo montar y utilizar un doble marcaje de ADN sensor de daño. El sensor es una máquina molecular impulsado por bio-molecular del motor, un virus-proteína codificada TOPO VACC vinculados con componentes artificiales. El desarrollo presenta un ejemplo de un enfoque bio-permitió que aboga por la adaptación de las estructuras biológicas, arquitecturas y piezas reales y los componentes de las células en el diseño de productos no tóxicos dispositivos a escala molecular ^12,15. Este enfoque resuelve dos problemas inherentes al campo de nanosensores en vivo: 1. la dificultad de hacer verdaderamente uniforme y reproducible nano-estructuras mediante el uso de nanomateriales tradicionales, y 2. la toxicidad potencial y alta reactividad biológica de nanosondas, partículas y otros nanomateriales muy dispersa. El sensor se integra una máquina molecular de origen natural con componentes artificiales que volver a dirigir a una nueva función de etiquetado de dañar el ADN. El producto de esta integración es un sími-artificial de la máquina molecular dirigida a una nueva tarea. Mientras que las topoisomerasas, polimerasas y otras máquinas enzimáticas se utilizan con frecuencia en la investigación bioquímica, que no están integrados con componentes de ingeniería en las asambleas individuales molecular. En consecuencia, en su uso rutinario, no se utilizan como dispositivos semi-artificial ^12.

Aquí se muestra cómo utilizar el sensor en el formato de sección de tejido para el etiquetado simultáneo de DNasa I y II-DNasa tipo de roturas. En la actualidad no hay métodos disponibles para llevar a cabo tal detección dual simultánea.

DNasa I-II y se rompe DNasa tipo son importantes marcadores de progresión de la muerte de las células, específicamente el etiquetado de las fases de apoptosis auto-autónomas y fagocíticas ^11,16. El sensor es una adición útil al arsenal de la investigación biomédica se ocupan de la detección y caracterización detallada de la apoptosis.