Summary
Kök-ur nematodları ile ekran bitkiler için iki farklı yöntem tarif edilmiştir. Açıklanan yaklaşımlar ıslah programlarında bu bitkilerin kullanımı kolaylaştıran bir zarar vermeden nematodlar ile yüksek verimlilik ekranlar yer alıyor.
Abstract
Kök-ur nematodları (cinsi Meloidogyne) zorunlu bitki parazitlerdir. Bunlar son derece Polifag ve ekonomik açıdan en önemli bitki paraziti nematod biri kabul edilir. Yumurta bir kez tüy dökerler mikroskopik ikinci etap juvenil (J2), enfektif aşamasıdır. J2S, yumurtaları kırmayı bir su filmi içinde toprakta serbestçe hareket ve uygun bitki türlerinin kök uçları bulun. Bir yemleme sitesi kurmak ve onların stileleri kullanarak beslenmesi başlatırsak bitki kök nüfuz sonra, vasküler silindir doğru göç ederler. Çok hücreli besleme sitesi sitokinez olmadan karyokinesis (mitoz tekrarlanır) yapılan hücrelerden oluşur 'dev hücreler' olarak adlandırılan birkaç genişlemiş multinükleer hücreler oluşur. Komşu pericycle hücreleri bölmek ve büyüklüğü tipik bir safra veya kök düğüm, kök-ur nematod enfeksiyonunun karakteristik belirti yol vererek büyütmek. Sonra beslenme başlanır, J2S sedanter ve un halineyetişkin olmak için üç ek molts dergo. Yetişkin kadın kök yüzeyi üzerinde veya altında jelatinimsi bir matris içinde 150-250 yumurta bırakır. Yumurtadan yeni enfektif J2S yumurtadan çıkar ve yeni bir döngü başlayacak. Kök-ur nematodu ömrü 26-28 az 4-6 hafta içinde tamamlanır ° C
Burada kök-ur nematodları ve yüksek işlem deneyleri için iki yöntem ile saksıda yetiştirilen bitkiler, bulaştırmak için geleneksel protokolü sunarız. İkinci tür börülce ve fasulye gibi büyük tohum bitkilerinden için ise ilk yüksek verimli yöntem, domates gibi küçük tohumları ile bitkiler için kullanılır. Büyük tohum az besin takviyesi ile genişletilmiş fide büyümeyi desteklemektedir. İlk yüksek çıktı assay ikinci bir test bitkilerin toprağın yokluğunda torbalar içinde yetiştirilen ederken tepsilerde kum yetiştirilen fideler kullanmaktadır. Fide kılıf çekirdek veya fidelerinin yerleştirildiği bir 2-cm-derin çukur oluşturmak için üst kısmında katlandığında, bir 15.5 x 12.5cm kağıt fitil yapılmıştır.kağıt fitil şeffaf plastik poşet içinde bulunan. Bunlar büyüme poşetler şeffaf bir torba yüzeyinin altında, kök ve yumurta seri üretim incitici nematod enfeksiyonu semptomları, doğrudan gözlem sağlar. Her iki yöntem de üretim geçme ya tohumu, fenotipleme sonra, elenmiş bitkilerin kullanımına izin verir. Poşet rafları düzenlenen plastik asılı klasörlerde saklanır çünkü büyüme torbaların kullanımının bir avantajı küçük bir yer gereksinimi olduğunu.
Protocol
1. Tencere ve Kaset Domates Fide Gelişimi
- Için pot deneyleri, bu Sunshine karışımı olarak organik bir zengin toprak tek bir saksı içinde domates tohumu. 22-28 bir serada koruyun ° C Çimlenme sonra, Miracle-Gro ile haftada bir kez döller.
- Yaklaşık iki hafta çimlenme sonrası, iki gerçek yaprak aşamasında,% 90 kum ve% 10 organik karışımı içeren steril kumlu toprakla doldurulmuş kaplar (10 cm çapında ve derin 17 cm) içine tek tek fidan nakli. Yavaş salınımlı gübre Osmocote ve iki hafta boyunca 22-28 ° C'de bir serada muhafaza ekleyin. Miracle-Gro ile haftada bir kez bitki dölleme devam edin.
- Yüksek verimli ekranlar için, doğrudan kumlu topraklarda kasetlere bitki tohumları çimlenme kadar plastik örtü ile tepsisi kapağı ve yukarıda belirtildiği gibi korumak. Çimlenme sonra, yavaş salınımlı gübre Osmocote ve Miracle-Gro ile haftada bir kez gübrelemek ekleyin.
2. Fide Torbalar içinde Börülce Büyüme
- Seeds ya, bir Petri kabındaki çimlenmiş Kimwipe birçok kağıt tabakaları ile kaplı ve çantaları için tek başına transfer veya kese kağıdı oluk içine doğrudan yerleştirilen ve çimlenmiş edilir.
- Klasör başına bir plastik asılı dosya klasörü, iki poşet yerleştirin ve dik bir konumda rafa klasörleri düzenlemek. 25-28 bir sıcaklık ° C ve 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık döngüsü tutulan kontrollü bir-çevre odasındaki rafa yerleştirin. Racklar ayrıca bir serada korunur, fakat mantar açısından potansiyel azaltmak için, bir folyoya ya da bitki gövdesinin her iki tarafında raf üzerine yerleştirilir sert kağıt kapak ihtiyaç olabilir.
- Reverse osmosis su ile bir veya iki kez günlük su torbası. Ekim sonrası yaklaşık 10 ile 14 gün, üçüncül kök uçları ile yeterli bir kök sistemi meydana geldiğinde (Şekil 1), fide aşılama için hazırız.
3. Nematodu Yumurta çıkarımı
E çıkarımıEnfekte köklerinden ggs Hussey ve Barker (1973) tarafından geliştirilen bir protokol üzerinden değiştirilebilir.
- Üç dört gün nematod aşılamadan önce, enfekte domates köklerinden kök-ur nematod yumurtaları ayıklamak. Yumurta çıkarma başlamadan önce, kontaminasyonu önlemek için sıcak su ile iyice çalışma alanı yıkayın. Ayrıca sıcak suda yıkayın bir blender, iki kova, bir tel örgü desteği, lastik tokmak, 425 üç elekler, 90 ve 25 mikron diyafram, bir Mezür ve makas.
- 425, 90 ve 25 mikron diyafram: aşağıdaki sırayla yukarıdan aşağıya doğru elekler biriktirin. Yumurta altındaki 25 mikron elek üzerinde toplanır. Bir lavabo desteklenen bir hasır üzerinde elekler koyun. Çalışma ile çözüme toplamak için hasır altında bir kova koyun.
- Inokulum kaynağı olarak kullanılan hastalıklı bitki (ler) üstleri, kesin ve atın. Dikkatlice pottan bitki çıkarın. Su dolu bir kovaya daldırma kökleri yıkayın. Çalıştırmak altında başka kökleri durulayıntoprak parçacıkları köklerinden yıkanmasını kadar su ning.
- Küçük parçalar halinde makasla kökler kesilir. Kazık kök atın.
- Kapaklı bir büyük plastik kavanoza tek bir bitki kıyılmış kök koyun, kökleri kapağı ve kapağı kapatmak için yeterli% 10 çamaşır suyu ekleyin.
- 2 dakika kökleri içeren kavanozu çalkalayın.
- Jar açın ve üst elek üzerine kökleri dökün ve bir sisleme nozul takılı bir hortumla yıkayın. Tüm çamaşır suyu kokusu bitene kadar iyi yıkanmalıdır. Elek gözeneklerin tıkanmasını önlemek için elekler kenarlarına dokunun bir çekiç kullanın.
- Üst elek kaldırın ve ikinci elek üzerinde enkaz durulayın.
- İkinci elek çıkarın ve son elek yumurta içerir ince enkaz toplamak. Bir şişe su bir yumuşak akışı ile, elek bir yana enkaz taşıyın. Su minimum miktarda temiz bir behere enkaz ve yumurta toplayın.
- Elek bir kez daha su içinde toplanankaçmış olabilecek yumurta toplamak için 25 mikron elekten kova. Su ile iyice durulayın ve aynı behere koyunuz.
- Üst elek bitki artıkları atın ve basınçlı su ile iyice üç elekler yıkayın. Bu gözenek boyutu bozabilir olarak elekler örgü parçası dokunmayın.
4. Kuluçka Nematodu Yumurta
- Hat temiz bir metal Kimwipe kağıt bir kaç kat sepeti ve bir cam petri sığmaktadır. Sepeti ve tabağın tabanına arasında 1 cm mesafe bırakın.
- Tel sepet içinde kağıda çıkarılan nematod yumurtaları dökün. Tel sepet alt su yüzeyine çarpar ama suya batırılır değil ki yeterince sıvı ekleyin. Plastik bir kapak ile üst kapak.
- Her gün su buharlaşmasını kontrol ve sepet altında su temas böylece petri biraz su ekleyin. Bu kurumasını yumurta önleyecektir.
- Her gün, wa toplamakBir behere Petri gelen J2S içeren ter. Derhal kullanılmadığı takdirde, bir akvaryum pompası tarafından üretilen bir laboratuvar hava veya hava ile oda sıcaklığında toplanan inokulum havalandırır. 2 gün içinde gazlı inokulum kullanın. J2S 6-8 günlük bir süre boyunca ayarlamak kuluçka elde edilebilir.
5.. Tencere veya Tepsiler ve Enfeksiyon Değerlendirilmesinde Domates Kök Enfeksiyon
- Bir sayma slayt veya çanak J2S sayısını saymak için toplanan nematod üç alikotları kullanın, ortalamasını ve aşılama için istenen hacmi belirler. Genellikle 3000 J2S tencere ve fide tepsiler yetiştirilen bitkiler için 500 J2S bitki başına kullanılır.
- Düşük hızda bir manyetik karıştırma plaka üzerinde inokulum karıştırın.
- Eğer bitkiler aşılamak önce, toprağı nemli ama çok ıslak olmadığından emin olun. Pot aşılama için (Şekil 2, bir kalem yardımıyla her domates kök sistemi etrafında kum yaklaşık yarım kap derinliği üç delik açmak
- Tepsilerde yüksek verimlilik ekranlar için, toprağa J2S teslim etmek için bir pipetter boyunca 5 ml pipet ucu (Şekil 3) yapıştırılmış tarafta delikli bir modifiye kapalı uçlu iğne kullanın. Alternatif olarak, nematod adım 5.3 olarak teslim edilebilir.
- 24-27 bir sera bitkileri korumak ° C altı ila sekiz hafta boyunca. Miracle-Gro ile ayda iki kez gübrelemek için devam edin.
- Enfeksiyon değerlendirilmesi için, dikkatle tencere gelen bitkiler kaldırmak ve kökleri (as adım 3.3 'de açıklandığı gibi) yıkayın.
- 15 dakika boyunca, 1 mg / L erioglaucine içinde kökler daldırarak mavi yumurta kütleler leke.
- Su kökleri durulayın ve bireysel kök sistemine lekeli yumurta kitleler sayarak değerlendirmek. Bir ışıklı masa büyüteci yumurta kitlelere görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılabilir.
- Elenmiş bitkiler daha g için gerekli iseenetic çalışmaları, değerlendirme için kökleri yıkamadan önce üstleri kesmeyiniz. Yumurta kitleler boyama ve sayım sonrası, bir serada, organik toprak fide nakli terlemeyi azaltmak için yoğun üstleri budamak ve korumak.
6. Torbalar ve Enfeksiyon Değerlendirilmesinde Börülce Kök Enfeksiyon
- Nematod inokulum sayın ve daha önce açıklandığı gibi bir manyetik karıştırma plaka üzerinde karıştırın.
- Yatay bir yüzey üzerinde asılı klasörler ve yerden torbalar çıkarın. 5 ml 1500 J2S ile birlikte her bir kılıf inoküle. Torba plastik kapağını kaldırın ve köklerin yüzeyi üzerinde eşit biçimde nematodlar dağıtmak.
- Işık dışarıda karanlık kağıt kaplı aşılama, 24 saat sonra bir yatay konumda torbalar tutun, daha sonra büyüme odasında asılı klasörleri geri dönün.
- Tablo 1; yarım gücü Hoagland çözümü (Hoagland ve Arnon, 1950 ile bir kez ya da günde iki kez gerektiği gibi su bitkileri,
- Yaklaşık 30 gün (dağılım 28-35 gün) aşılama sonra, 75 mg / L erioglaucine 10-20 ml kadar her kese süzülür. Gecede yatay konumda boya ile sular altında torbalar tutun.
- Torbalar boşaltın ve ışıklı masa büyüteci altında yumurta kitleler sayarak kök sistemleri değerlendirmek.
- Ekranlı bitkiler ve genetik çalışmalar veya ıslah çalışmaları için gerekli ise, dikkatli bir serada saksıda organik toprak kağıt, nakil gelen kökleri çekin ve korumak.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Açıklanan iki sistemleri için nematodu aşılar için domates ve börülce bitkilerin uygun bir aşamada şekillerde gösterilmiştir1 ve 2. Buna ek olarak, domates ve börülce arasında iyi enfekte kökler örnekler Şekil 4 ve 5 de gösterilmiştir. Çoğu hastalık direnci ekranlarda olduğu gibi, enfeksiyon oranı ortalama hesaplamak için nematod aşılama için genotip için en az 6-10 bitkilerin kullanılması tavsiye edilir. Bitkiler arasındaki nematod enfeksiyonu farklılık, aynı genotip, üniforma tesis büyüklüğü ve doğru miktarda ve inokulum teslim kullanılarak azaltılabilir.
Tepsiler ve büyüme torbaların kullanımı küçük bir büyüme alanı bitkilerin binlerce yüz tarama sağlar. Büyüme torbalar da çamaşır kökleri (Şekil 4) gerek olmadan kök-ur nematod enfeksiyonlarının hızlı ve etkili tahribatsız değerlendirme sağlar.
Şekil 1. Iki haftalık börülce bitki kese yetişen ve kök-ur nema için hazıraşılama Tode.
Şekil kök-ur nematodu aşılama için 2. Üç haftalık domates bitkisi hazır.
Şekil 3. Nematodların yüksek verimlilik inokülasyon için kullanılan modifiye bir iğne ve pipet. Bir iğne alt imzalandı ve deliklerin üç set bir lazer ışını kullanarak iğne sondaj gerçekleştirmiştir. Daha sonra, değiştirilen bir iğnenin bir 5 ml pipet ucu yapıştırılmış edildi.
Şekil 4. Kök-ur nematodları ile enfekte bir domates kök sistemi.
Şekil 5. 30 gün sonrası aşılama büyüdü erioglaucine ile boyanmış yumurta kitlesi olan bir börülce kök sistemi28 ° C.
Discussion
Oldukça enfektif inokulum ve uygun gelişim aşamasında bitkileri kullanarak hazırlanması: Başarılı bir nematod ekran için iki önemli adım vardır. Kök-ur nematodu yumurta açılma oranı 5 arasında oldukça değişken ve aralıkları - 50%. Bu nedenle kapak ve yüksek infektif J2S optimum seviyeleri elde etmek için, yakın ilgi ve kuluçkalık yumurta çıkarma işlemlerine ödenmelidir. Yumurta en az bir süre için ağartıcı maruz edilmeli ve ağartıcı kök karışımından de yıkanır edilmelidir. Kuluçka sırasında yumurta, yumurta içeren bulamaç suya edilmemelidir. Buna ek olarak, yumurtadan yavru toplanır yatan Petri tabağı içine dökülüp yumurta önlemek. Kuluçka işlemi sırasında yumurta dökülmesini önlemek için bir yolu kağıt bozabilecek olarak Kimwipe doğrudan su eklemek değildir. Bunun yerine Petri kabı doğrudan su ekleyin.
En iyi sonuç için, taze yumurtadan J2S kullanın. Eğer hatch oranı düşüktür ve daha inokulum gerektirir, J2S uzun bir süre için 15 ° C'de saklanabilir. Aşılama öncesi nematodların canlandırmak için oda sıcaklığında saklanan inokulum ısıtın. Ancak, hatta 15 yaşında uzun süre J2S saklamiyoruz ° C hasret J2S verimli enfekte olmayacak gibi.
Genç fidanlar kök-ur nematodu aşılama için en iyi gelişim aşaması vardır. Ancak, bu J2S için giriş noktaları olarak kök uçları yeterli sayıda sağlayan yeterli bir kök sistemi oluşumu ile dengeli olmalıdır. Optimal bitki gelişimi durumu korunması da ekranlar için önemlidir. Özel poşetler içinde büyüyen bu aşırı sulanma bitkilerin kaçının. Torbalar Aşırı sulama, mantar gibi büyüme teşvik ve kök sağlık azaltabilir, kese dibinde su birikintileri ile gösterilir.
Testler daha nematod enfeksiyonunun değerlendirilmesi ve yumurta / kök sistemi ve yumurta sayısının hesaplanmasında her ikisi ile / gram freSH kök gerçekleştirilebilir. Domates testlerde, bireysel kökler tartılır ve çıkarılan yumurta gibi inokulum hazırlanması (bölüm 3) nitelendirdi. Bitki örneklerinin çok sayıda işlerken, bireysel kök sistemleri yumurta çıkarılması için bir blender kullanılarak yumuşatılır olabilir. Yumurta sayısı en azından üç alikots içinde sayılır ve taze kök sistemi yumurta / gram hesaplanan edilmelidir. Kese testlerde, kök sistemi, kağıt ekleme çıkardı tartılır ve yumurta elde edilir.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Kaloshian laboratuar Araştırma Gıda ve Tarım Birleşik Devletleri Ulusal Enstitüsü (2007-35607-17765) bir hibe ile finanse edilmektedir. Roberts laboratuarında Araştırma Uluslararası Kalkınma Birleşik Devletleri Ajansı hibe (GDG-G-00-02-00012-00 ve EDH-A-00-07-00005) ve Kaliforniya Kuru Fasulye Danışma Kurulu tarafından finanse edilmektedir.
References
- Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway. Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).
- Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea. Crop Sci. 40, 611-618 (2000).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).
- Hussey, R. S., Barker, K. R. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).
- Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. Plant J. 27, 417-425 (2001).
- Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).
- Omwega, C. O., Roberts, P. A. Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature. Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).
- Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita. Plant Dis. 72, 970-972 (1988).
- Perry, R. N. Root-Knot Nematodes. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).
- Starr, J. L., Cook, R. Resistance to Parasitic Nematodes. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
