Summary
La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró durante la gestación. Se define un
Abstract
El oído interno tiene 6 epitelios de mamíferos distintos sentidos: 3 crestas de las ampollas de los canales semicirculares, máculas en el utrículo y el sáculo y el órgano de Corti en la cóclea en espiral. El crestas y máculas contienen células ciliadas vestibulares que transduce estímulos mecánicos para servir al especial sentido del equilibrio, mientras que las células auditivas ciliadas en el órgano de Corti son los transductores primarios para escuchar 1. Especificación del destino celular en estos epitelios sensoriales y la morfogénesis de los canales semicirculares y la cóclea llevará a cabo durante la segunda semana de gestación en el ratón y son en gran parte completada antes del nacimiento de 2,3. Estudios sobre el desarrollo del oído interno del ratón se realizan rutinariamente por la recolección de embriones transgénicos en diferentes etapas embrionarias o postnatal para comprender mejor la base molecular de la telefonía celular y / o fenotipos morfológicos 4,5. Se postula que la transferencia de genes a la oreja de ratón en desarrollo interno en el útero </ Em> en el contexto de la ganancia y la pérdida de la función de los estudios representa un enfoque complementario a la transgénesis de ratón tradicional para el interrogatorio de los mecanismos genéticos que subyacen al desarrollo de mamíferos oído interno 6.
El paradigma experimental para llevar a cabo los estudios de genes misexpression en el oído interno del ratón en desarrollo ha demostrado aquí se resuelve en tres pasos generales: 1) laparotomía ventral, 2) la microinyección transuterine, y 3) electroporación in vivo. Laparotomía ventral es una técnica de supervivencia de los ratones quirúrgica que permite la exteriorización del útero para tener acceso experimental a los embriones implantados 7. Microinyección Transuterine es el uso de biselados micropipetas capilares de vidrio, para introducir el plásmido de expresión en el lumen de la vesícula ótica o otocyst. In vivo electroporación es la aplicación de onda cuadrada, impulsos de corriente directa para conducir la expresión del plásmido en las células progenitoras 8-10.
11. Ratón embriológicos técnicas experimentales pueden ser difíciles de aprender de la prosa y las imágenes fijas solamente. En el presente trabajo, demostramos los 3 pasos en el procedimiento de transferencia de genes. La mayoría de la crítica, hacemos uso de la microscopía de vídeo digital para mostrar con precisión cómo: 1) identificar la orientación del embrión en el útero, 2) reorientar los embriones para la orientación inyecciones a la otocyst, 3) microinyectar ADN se mezcla con solución de tinte trazador en el otocyst en los días de embriones 11.5 y 12.5, 4) electroporar la otocyst inyecta, y 5) los embriones de la etiqueta electroporadas para la selección después del parto en el nacimiento. Proporcionamos ejemplos representativos de éxito transfectadas oído interno: una guía ilustrada de las causas más comunes de la mala focalización otocyst, discutir cómo evitar los errores comunes de metodología y las directrices actuales para la redacción de una g en el úteroeno animales transferencia de la atención de protocolo.
Protocol
1. La laparotomía ventral
- Anestesie una presa cuyos embriones se encuentran en el día embrionario 11.5 (E11.5; mediodía del día se detecta un tapón vaginal es el día del desarrollo embrionario 0,5) por inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital sódico anestesia (7,5 l por cada gramo de peso corporal). Solución de trabajo anestésico: 180 l de 50 mg / ml de solución de pentobarbital sódico; 100 l de etanol absoluto; 320 l de 65 mg / ml de sulfato de magnesio acuoso (modula el tono uterino), y 400 l de propilenglicol (miscibles con vehículo acuoso y orgánico componentes).
- Evaluar la integridad de la anestesia mediante la realización de las pruebas de estímulos nocivos: apretar la pata, la respuesta y abrir y cerrar de tocar la mejilla y vibrisas; pizca cola. Aplique una pomada oftálmica estéril de las córneas.
- Afeitarse la piel abdominal de la zona suprapúbica de la caja torácica con tijeras y una hoja fina (Oster # 40 hojas). Desinfecte el abdomen con etanol al 70%, 10% de yodo povidona (Betadine), unnd 70% de etanol, de forma secuencial. Coloque el abdomen del ratón hacia abajo en un campo estéril, a continuación, establecer una almohadilla térmica o una placa caliente (37 ° C) durante 2-5 minutos.
- Incisión en la piel del abdomen en la línea media ventral, con la pelota de punta de las tijeras. Extienda la incisión de 10-14 mm. Identificar la línea alba, una banda de avascular, blanco tejido conectivo a lo largo de la línea media ventral de la pared abdominal. Incisión en la línea alba con la pelota con punta de tijera y extender la incisión 10-14 mm. Inmediatamente irrigar el abdomen con precalentado (37 ° C) solución de Ringer lactato.
- Externalizar los dos cuernos del útero con una pinza de anillo, sin ejercer demasiada presión sobre los lugares de implantación. Lavar los cuernos uterinos con externalizados precalentado, solución de Ringer lactato.
2. Microinyección Transuterine
- Se fabrica una pared gruesa, pipeta de vidrio de borosilicato capilar de microinyección con las siguientes características: 12-16 μm diámetro exterior y un bisel de 20 grados. En un extractor de Sutter P-97 pipeta con filamento de caja pequeña, utilice el siguiente programa: el calor = prueba de rampa más 3 unidades, la presión = 200; tire = 0; velocidad = 46; tiempo = 100). Con el Sutter BV-10 biselador, utilice el 104C (oro) disco abrasivo para pipetas de gran diámetro. Volver a suspender el plásmido en la expresión g 3-4 / l de fosfato de calcio libre amortiguada (pH 7.2 a 7.4). Añadir verde rápido cristalina del ADN concentrada vórtice, suavemente durante 30 segundos, y girar a 10.000 g durante 10 segundos. La cantidad mínima de verde rápido requerido para rastrear visualmente la eficacia de la inyección se determina empíricamente. Rellene la pipeta biselado con el ADN / solución verde rápido. Conecte la pipeta de microinyección cargado al titular de la pipeta de la presión de inyección (Picospritzer con> 99% de nitrógeno puro como gas de la fuente).
- Transiluminar el útero con baja intensidad, luz halógena para visualizar el embrión dentro de su lugar de implantación. Identificar la beating corazón, vesículas cerebrales, yemas de las extremidades, la naciente 4 º ventrículo del cerebro posterior, y los ojos. Riegue el útero cada 2 minutos con precalentado, la solución de Ringer lactato para mantener la hidratación. Aplique una leve presión sobre el útero para reorientar el embrión e identificar los puntos de referencia anatómicos se ha indicado anteriormente.
- Orientar el embrión para identificar la vena de la cabeza primaria cuya anterior y posterior del flanco sucursales en el territorio mesenquimales en la que el otocyst reside. El otocyst apropiada no puede ser vista por transiluminación del útero. El otocyst se encuentra a medio camino entre las ramas anterior y posterior de la cabeza de la vena principal que, junto con el tronco principal de la vena, constituyen la forma de los montantes o los postes, en un campo de fútbol americano. El otocyst está a medio camino entre los montantes.
- Inserte la pipeta de inyección a través del útero de una trayectoria en línea con la ubicación de la presunta otocyst. Pulso del microinyector una vez después de pasar por el utera visualizar el colorante trazador y la aproximación de la localización de la punta de la pipeta. Avanzar en la pipeta bajo control micrométrico y el pulso de nuevo para evaluar la profundidad. Además avanzar en la pipeta en el mesénquima de la cabeza lateral y el pulso en varias ocasiones. El éxito de la focalización otocyst revelará la forma cónica del conducto endolinfático dorsal y la concha de abanico en forma de concha del vestíbulo. Libere la presión sobre el útero, retire la pipeta del embrión / útero en un solo movimiento, e inmediatamente regar el útero con precalentado, solución de Ringer lactato.
3. Electroporación in vivo
- Riegue el útero con una solución de lactato de Ringer. Solución de Ringer lactato recién aplicado es necesario par eléctricamente los electrodos de estilo de paletas en el útero. Humedecer las superficies de los electrodos de tungsteno con el Ringer lactato. Centro de la otocyst inyecta en el camino de los electrodos. Suavemente comprimir el útero con la Autoridad Palestina electroporaciónddles. El cátodo está en contacto con la pared uterina lateral a la otocyst inyectado y el ánodo está en contacto con la pared uterina adyacente a la otocyst no inyectado. Dispare un tren de ondas de pulso cuadrado con el interruptor de pedal en el electroporador. Electroporación parámetros son los siguientes: 5, 50 ms pulsos a 43 voltios por impulso y una demora 950 milisegundos entre impulsos. Lavar inmediatamente el útero después del tren de pulsos se entrega. Anotar la corriente suministrada al tejido: 60-100 mAmps es suficiente para transfectar óticas progenitores epiteliales. Inyectar y electroporar 4-6, embriones E11.5 por la presa.
- Realizar una microinyección segundo, independiente de la transuterine acuosa de dextrano fluorescente (Alexa Fluor 488 si el plásmido de expresión codifica una proteína fluorescente de color rojo o Alex Fluor 594 si el plásmido de expresión codifica una proteína fluorescente verde) en el ventrículo del 4 de esos embriones cuyos oídos interno son precisión inyectado y por lo menos 60 mAmps de corriente por pulso era delivered durante electroporación. El dextrano fluorescentes serán detectables en el nacimiento en el cerebro posterior y permitir la selección de las crías cuyos oídos internos fueron manipulados durante la embriogénesis (ver 3.5).
- Lavar los cuernos uterinos con solución de Ringer lactato. Vuelva a insertar los cuernos uterinos en la cavidad abdominal. Enjuague la cavidad uterina con 2-4 ml de precalentado, solución de Ringer lactato y permitir que el desbordamiento de drenaje de la zona de la incisión en el campo estéril. Vuelva a colocar el drapeado con el material seco y estéril. Suturar la pared abdominal con una aguja no cortante y una sutura reabsorbible 6-0. Nosotros preferimos una puntada corriente, el bloqueo de cada puntada otro, tanto para la pared abdominal y la piel.
- Seque la piel de las presas y administrar un fármaco no esteroide anti-inflamatorio, como meloxicam por vía subcutánea. Regreso de la presa a la jaula de recuperación precalentado en un campo estéril. Controlar y registrar las respiraciones de las presas, la apertura del sitio de la incisión y la vagina de secreción sanguinolenta. El sangrado es ravolver, pero si está presente y sin cesar, la eutanasia a la presa, mientras que ella todavía está bajo anestesia. Tenga en cuenta el tiempo que recupera la conciencia y los intentos de caminar. Vuelva a colocar el dique de la colonia de ratones cuando muestra signos de comer y beber y ha empezado a construir nidos. Típicamente, esto se produce dentro de las 12 horas.
- Al momento de nacer (después del día 0), el flash de la región posterior del cerebro de cada cachorro de la camada para detectar la fluorescencia dextrano usando un microscopio de disección stereofluorescence con las buenas prácticas agrarias o Texas filtro rojo establecer, según corresponda. Volver a la presa de lactancia sólo los cachorros que muestran el etiquetado posterior del cerebro.
4. Los resultados representativos
Figura 1. La electroporación mediada por la transferencia de genes para el desarrollo de la cóclea. El otocyst E11.5 fue inyectado con un plásmido que codifica la expresión de una mayor proteína verde fluorescente (EGFP) y electroporated (pulso traen los parámetros de: cinco, 43 pulsos voltios a 50 ms / pulso y 950 ms de retardo entre impulsos). A) Un representante del oído interno de un día de vida 6 (P6), cuya cría otocyst se inyectó y electroporated en E11.5 demostrando EGFP expresión de la base a través de la vuelta media de la cóclea. La pared lateral de la cóclea fue retirado de la vuelta media y el ápice solamente. Progenitores E11.5 que dan lugar a la cúspide no fueron transfectadas. B) Todo el montaje inmunoticción de la cóclea (A) con el marcador de células de pelo, 7 bis, la miosina (Myo7a), indica que la expresión de EGFP sigue la trayectoria del órgano de Corti y es grande localizado en la célula de pelo de soporte de epitelio sensorial. C) Un representante del oído interno de un embrión E18.5 cuya otocyst se inyectó y electroporated en E11.5. La proyección de láser confocal demuestra la expresión de EGFP en Myo7a-positivas las células ciliadas sensoriales. D) láser confocal de proyección del epitelio sensorial coclear del órgano de Corti E18.5 indica EGFP expression en las células ciliadas internas (IHC), las células ciliadas externas (OHC), las células del interior de phalangial (IPC), las células de los pilares (pc), y las células de Deiters (DC). La barra de escala en (B) se aplica a (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La transferencia de genes en el oído interno del ratón en desarrollo: La oreja de ratón interno se desarrolla a partir de la placoda ótica durante la primera semana de desarrollo después de la implantación 12,13. Al día embrionario 9.5 (E9.5), la placoda se invagina y se transformó en una vesícula llena de líquido llamado otocyst 2. Otic precursores en la vesícula dar lugar a las células sensoriales y sensorial dentro del oído interno madura, así como las neuronas que inervan las células ciliadas mecánicamente sensibles en el epitelio sensorial vestibular y auditiva. En las últimas etapas embrionarias, el complejo, en 3 dimensiones la morfología del laberinto membranoso del oído interno se establece 3,12. Ganancia y pérdida de la función de las modalidades experimentales se realizan normalmente mediante transgénesis ratón para obtener una perspectiva de la regulación genética de los procesos de desarrollo tales como la especificación del destino celular y la formación de patrones. Manipulación genética dinámica de la oreja del ratón en desarrollo interno enel útero representa un enfoque complementario a la transgénesis de ratón que las parejas técnicas de transferencia génica experimental de ratón con la embriología 6,11.
Virus y mediadas por electroporación-técnicas de transferencia de genes se han desarrollado para manipular la expresión génica en el desarrollo del oído interno 6,11,14,15. Adenoasociados virales (AAV) vectores infectar progenitores óticas que dan lugar a tipos de células sensoriales y sensorial y se han utilizado para interrogar a la base molecular de calcio-dependiente exocitosis en células de pelo de ratón 16. Vectores AAV producir títulos elevados que permiten la expresión amplia en el oído interno y diferentes serotipos virales mostrar tropismo única que puede ser ventajoso para la expresión celular diferencial. Las desventajas incluyen una capacidad fija relleno que limita el tamaño del gen que se puede misexpressed y el requisito de conocimientos virológicos para hacer, purificar y titulación de los virus. La electroporación génica mediada por transfer se ha utilizado para evaluar el papel de un factor de transcripción básica hélice-lazo-hélice en la especificación de destino de las células pilosas sensoriales en vivo 6. Plásmidos de expresión adecuados para la tecnología de puerta de enlace subclonación permitir la construcción rápida y eficiente de los vectores con promotores únicas conducir la expresión de un gen de interés y un marcador fluorescente de proteína una secuencia IRES 17. Los genes de interés pueden ser expresados en precursores óticas plazo de 24 horas de la electroporación y la expresión puede persistir en el oído interno postnatal dependiendo del promotor utilizado. La construcción del plásmido, purificación, concentración, y la cuantificación sólo requieren habilidades estándar de biología molecular. Las desventajas incluyen la disminución de la eficacia de transfección in vivo a medida que aumenta de tamaño por encima de 8kb ~ plásmido y una mayor tasa de letalidad embrionaria en comparación con la mayoría de los vectores virales. Tanto la electroporación y mediado por el virus de técnicas de transferencia génica requieren el dominio de tecnología experimental de ratón embrionariotécnicas: cirugía de la supervivencia, en la manipulación de útero de los embriones, y la microinyección transuterine. El objetivo de este manuscrito es hacer frente a esta última cuestión, demostrando a cada paso crítico metodológico por microscopía de vídeo digital.
Notas metodológicas sobre el video: Nos eligió deliberadamente no para cubrir el sitio de la incisión con el campo estéril, durante el rodaje de lo que el espectador podía ver la posición de la línea media ventral en relación con la anatomía de la presa, es decir, la cabeza (deliberadamente borrosas en la mayoría marcos, pero reconocible), las extremidades y la cola. Colocación de los paños de la zona de la incisión bloquea eficazmente este punto de vista y puede confundir a los esfuerzos para apreciar las relaciones anatómicas espaciales relevantes durante la laparotomía ventral y una secuencia de inyección. Sin embargo, se recomienda drapeado del abdomen de la presa de manera que el resto exteriorizada cuernos uterino en un campo estéril para mantener la asepsia quirúrgica. Además, decidimos no tratar a los demoniostrar la sutura de las incisiones quirúrgicas en la pared abdominal y la piel debido a que estos métodos deben ser aprendidas por un asesoramiento experto de un veterinario o un técnico cualificado quirúrgica. El Dr. Marcel I. Perret-Gentil (Universidad de Texas en San Antonio), presenta una excelente discusión sobre este tema, con representaciones pictóricas, en su folleto "Principios de sutura Veterinaria" 18.
Recomendaciones de procedimiento: transferencia de genes en el oído interno del ratón en desarrollo es una técnica difícil. Hay una serie de mejores prácticas que eliminar una cantidad sustancial de la variabilidad y asegurar resultados exitosos. Hacemos recomendaciones que figuran a continuación para facilitar el aprendizaje este enfoque experimental.
Consulte con el personal veterinario para desarrollar la supervivencia de los ratones cirugía animal protocolo de atención: El protocolo de cuidado de los animales para la cirugía de la supervivencia de los mamíferos está exigiendo a producir yacuidado de la anestesia, analgesia y perioperatoria debe ser definido y coordinado. Una discusión detallada de la elaboración de protocolos de cuidado de animales, incluyendo el lenguaje que se puede formar el núcleo del protocolo de un aspirante, se ofrece como información complementaria (consulte la sección " Cuidado de Animales Protocolo para el Desarrollo "). Además, el cuidado de sus instituciones de origen de los animales y el empleo Comisión (IACUC) y del personal veterinario, sin duda, proporcionar orientación adicional sobre la formulación de un protocolo adecuado a petición.
Establecer una supervivencia específica del ratón en el área de la cirugía de transferencia génica in utero: laparotomía ventral es un anuncio como una cirugía mayor, ya que pone en peligro una cavidad del cuerpo. La mayoría de los IACUC no requerirá una estéril clase 100 el medio ambiente para una cirugía mayor supervivencia de los ratones. Más bien, un área específica que incluye la iluminación adecuada, ventilaciónción, calefacción adicional, y dura, no porosa, las superficies pueden desinfectar probable que sea necesario. Nosotros preferimos llevar a cabo la cirugía de nuestra supervivencia en una campana de flujo laminar horizontal que protege el ratón de la infección, reduce el estrés fisiológico, y por lo tanto la recuperación de las instalaciones de post-operatorio. Hemos definido una serie de modificaciones personalizadas en una oscilación amortiguada, campana de flujo laminar horizontal (630 Envirco LF), que incluyen dirección, lámpara halógena de bajo voltaje iluminación de la pista, un circuito ampliado eléctrica a los equipos de transferencia de potencia de genes, y puntos de venta de energía empotrados con recortes de sobremesa para el paso del cordón. Un esquema detallado de estas modificaciones se ofrece como información complementaria (ver " campana de flujo laminar en la transferencia génica in utero "). Consulte a su IACUC como a desarrollar su protocolo de cuidado de los animales para definir un lugar adecuado que se dedica exclusivamente al ratón Survival cirugía.
Pesar de la presa con una precisión de 0,1 gramos antes de administrar la anestesia de pentobarbital de sodio: El sodio pentobarbital es un anestésico eficaz y proporcionar por lo menos 105 minutos de tiempo de trabajo, cuando el régimen de dosificación recomendado es seguido. Determinar un peso corporal exacto para cada presa antes de calcular la dosis de la mezcla anestésica para inyectar. Nunca estimar el peso corporal de las hembras. Utilice la aguja de la jeringa para alérgicos bandeja y una jeringa de Becton Dikison: el bisel intradérmica humano es ideal para atraumáticas inyección intraperitoneal en ratones embarazadas. Por otra parte, esta jeringa tiene un volumen de espacio muerto muy bajo y está calibrado para el rango de volúmenes de anestésico suelen ser necesarios para las presas cuyos embriones se encuentran en E11.5 E12.5 o.
Implementación de la analgesia profiláctica para apoyar la supervivencia embrionaria: administrar un anestésico tópico en la línea de sutura, comoBupivicaína, y una visión sistémica, no-esteroides anti-inflamatorios de drogas, como meloxicam, antes de colocar el dique de la recuperación en la jaula para que los analgésicos se encuentran a bordo en el momento de la presa se recupere de la anestesia. La reducción de las molestias en la presa facilita la recuperación postoperatoria y el mantenimiento de un embarazo saludable.
Bisel de la microinyección pipetas y limitan fuertemente el diámetro exterior: La causa más común de letalidad embrionaria es un tejido y / o daño vascular de las pipetas de microinyección mal construidas. Microinyección Transuterine en el otocyst E11.5 ratón lleva limitaciones diferentes a las de inyección en grandes órganos en embriones adultos (es decir, las vesículas cerebrales, oculares, de las extremidades, etc.) Unbeveled, mal biselado, o pipetas de gran diámetro exterior inapropiada causará hemorragia de los vasos en el útero, lo visceral del saco vitelino vasculatura, y / o el embrión en E11.5, lo cual reducirá la supervivencia embrionaria. Es posibleal freno de mano pipetas duraderos de pequeño diámetro que llevan un bisel adecuado, pero es difícil hacerlo de forma rutinaria. El embrión de ratón E11.5, cuya minúscula otocyst es el objetivo, será implacable. Consulte con el P-1000 P-97 Libro de cocina con una pipeta de instrumentos de Sutter 2011 por un discurso lleno de pipeta de diseño y fabricación 19. Los parámetros para las pipetas utilizadas en este trabajo se ha indicado anteriormente y su fabricación ha sido plenamente discutido previamente 11. Las notas de procedimiento en el manual del propietario para el Sutter Instruments BV-10 biselador también son un excelente recurso.
Entender por qué la mala focalización otocyst por microinyección transuterine se produce: El video presenta el resultado ideal para la microinyección transuterine en el E11.5 y E12.5 otocyst. Mala focalización del otocyst suele ser resultado de la inyección demasiado superficial, demasiado profundo, o de forma inadecuada pipetas fabricadas. La figura 2 muestra estas condiciones. PanelUna muestra una vista lateral del lado izquierdo de un embrión E12.5 fotografiada por transiluminación después de microinyección éxito transuterine de solución verde rápido en la otocyst. El cerebro posterior (HB) aparece como una muesca dorsal en forma de cuña a la otocyst. El ojo (e) tiene un anillo de pigmento a lo largo de su periferia y la extremidad anterior izquierda es prominente. El tronco principal de la vena de la cabeza primaria (PV) es justo debajo de la otocyst. El otocyst está lleno de verde rápido, que aparece en negro: la dorsal, el conducto endolinfático (ED) y el vestíbulo de la otocyst (oc) se pueden distinguir. Selección adecuada de la E11.5-12.5 otocyst siempre presentará un conducto endolinfático claramente discernible y el vestíbulo. El panel A 'muestra la misma imagen que en A sin el etiquetado blanco para facilitar la revisión crítica de la otocyst inyectado.
Figura 2. Una guía ilustrada a la mala focalización del otocyst por transuterine microinjección. Todos los paneles muestran la vista lateral izquierda de un embrión E12.5 con mesencéfalo y el prosencéfalo izquierda, excepto Grupo H, que es una vista dorsal de la región rombencéfalo-cerebro medio. Los paneles de cada fila representan las imágenes del mismo embrión. Véase la discusión para una explicación detallada de las causas de la mala focalización otocyst. Abreviaturas: E, el ojo izquierdo, ed, endolinfático conducto; fg, verde rápido, HB, rombencéfalo, libra, del brote, oc, otocyst; OT, territorio ótica, p, pipeta, PHV, la vena de la cabeza primaria, pt, punta de la pipeta.
Inyección superficial es una causa común de mala focalización. Paneles SER demostrar una inyección superficial en las E12.5 embrión. El cerebro posterior (HB) de primera clase y el territorio ótica (OT, con un círculo) son evidentes en este punto de vista izquierdo, lateral. La pipeta de microinyección (p) está en primer plano. Rápido verde (FG) comienza a expulsar de la punta de la pipeta (B), y con impulsos subsiguientes de la presión del inyector (CD), se difunde tinte en una forma ovalada. La distribución de ªe colorante sugiere que se introdujo entre la pared uterina y la visceral del saco vitelino, una membrana que envuelve extraembrionario la cavidad exocoelomic. El experimentador no debe tratar de volver a dirigirse a la otocyst en este embrión, pero debe pasar a la próxima embrión. Las inyecciones múltiples se correlacionan con la disminución de la supervivencia embrionaria, un efecto que es más aguda en E11.5 E12.5 a.
Inyección en profundidad es una de las causas más comunes de la mala focalización. Paneles FH demuestren una trayectoria de inyección que pasa por el territorio ótica en el cerebro posterior. La vena de la cabeza primaria (PHV), el ojo izquierdo (e), y la pipeta (p) son evidentes en este punto de vista lateral de un embrión E12.5. La expulsión inicial de verde rápido (FG) se desplaza dorsalmente con respecto a la vena cabeza primaria / territorio ótico. Con pulsos sucesivos, el cerebro posterior en forma de cuña (HB) estaba completamente lleno de verde rápido (Grupo G). Una rotación de 90 grados del embrión inyectado permite la detección de verde rápido dentro de la hindbraen la cavidad de la vista dorsal (Grupo H). Tanto superficial y profunda inyecciones resultado de la incapacidad para percibir la profundidad de la pipeta de microinyección después de que haga contacto con el útero. Un enfoque práctico que funciona bien es avanzar en la pipeta a través del útero e inmediatamente pulsar una vez para buscar una bocanada de verde rápido: la ubicación de la nube indica la posición aproximada de la punta de la pipeta. Ajuste la profundidad sobre la base de este pulso de amplitud hallazgo.
Pipetas inadecuadamente fabricados son la causa más común de la mala focalización. El intento de inyección se muestra en paneles IK se llevó a cabo con una punta de pipeta que se había roto manualmente pero no biselados. La vista lateral del embrión E12.5 muestra el cerebro posterior (HB), el ojo izquierdo (e), y la pipeta de microinyección (p). Tenga en cuenta que la punta de la pipeta (PT) es fuertemente inclinada y no ha logrado penetrar en el útero (Panel I). Aplicación de una fuerza adicional tijeras la punta de la pipeta (Grupo J, flecha), dejando la pepitaette punta incrustada en el útero. Una pequeña cantidad de verde rápido (FG) fue expulsado de la pipeta fracturado y ha descubierto la superficie del útero. La punta de la pipeta integrado (Grupo K) deben ser removidos con unas pinzas finas, estéril y se desecha como residuos cortopunzantes. Si la punta de la pipeta no puede ser localizado o eliminado con éxito, la eutanasia de la presa, bajo anestesia.
Documentar las observaciones de procedimiento para la supervivencia de los ratones una cirugía de la hoja de datos: Un elemento crucial para el aprendizaje de estos métodos es el de documentar las observaciones y hacer ajustes sobre la base de esas observaciones. Producir una cirugía de supervivencia de los ratones la hoja de datos y tomar nota de la información preoperatoria, operatoria y post-operatorio. Datos preoperatorios incluyen el peso de la presa, la dosis de anestésico entregada, inyectado plásmido, etc Fallo de datos incluyen la inyección de embriones (es decir, R2 es el segundo embrión desde el ovario en la trompa uterina derecha), la calidad de la inyección (es decir, sin endolinfático conducto detectado, colorante en 4
Utilice corriente suministrada por impulso para optimizar la eficiencia de transfección: El tren de ondas pulso cuadrado consiste en 5, 43volt, los pulsos de 50 mseg con un inter 950msecretardo de pulso. El platino 5mm, los electrodos de paletas de estilo asegurar que el territorio ótico entero está contenido dentro del campo eléctrico. Eficiencias similares transfección se puede lograr con paletas 3mm, aunque son más difíciles de posicionar con precisión. El paradigma del pulso se ha optimizado mediante la evaluación de la actual transferido al embrión durante el pulso final, no mediante el barrido a través de tensiones y la evaluación de la eficacia de transfección. La razón es que la corriente suministrada por pulso varía en tensión constante en función de la permeabilidad de acoplamiento eléctrico entre el útero y los electrodos de platino. Suponiendo que el útero está recién regada con solución de Ringer lactato inmediatamente antes de colocar las paletas y el portador de carga está presente en exceso, la variable principal es la cantidad de "acoplamiento" la presión aplicada a la matriz con las paletas. Una suave presión en los resultados de 43volts en 60mAmps menores de transfección corriente suministrada y esporádico en el mejor de los casos. Una presión moderada a 43VOLTS resultados en 60-100mAmps entregado y la transfección más eficaz. Las fuertes presiones a los resultados de 43volts> 100mAmps entregado y se correlaciona con la frecuencia cardiaca persistentemente alterado y el aumento de la letalidad embrionaria. El exceso de presión rompe el saco vitelino visceral (un "pop" se puede sentir a través de las paletas) y causa letalidad embrionaria. Es probable que la presión variable aplicada altera la impedancia entre los electrodos que afecta a la corriente suministrada. La frecuencia del pulso de 1Hz (un 50 mseg pulso por segundo) se definió como el menos perjudicial para el ciclo cardíaco del embrión, que es una correlación positiva para la supervivencia embrionaria. Se concluye que el parámetro más importante para vigilar en el establecimiento de una eficiente en paradigma electroporación in vivo es la corriente suministrada por impulso. La modificación de cualquier paradigma del pulso debe incluir una cuidadosa monitorización de la corriente suministrada por impulso.
Adoptar un enfoque modular para el aprendizaje ºtécnica e: Módulo 1: Practique una operación simulada, con la exteriorización del útero, pero no se inyecte o electroporar. Presas tolerar laparotomía ventral muy bien y nunca se debe experimentar complicaciones posquirúrgicas relacionadas con la técnica quirúrgica. Habilidades de supervivencia del ratón quirúrgicos, sin duda, reside en la institución de origen para seguir una formación adecuada. Lograr el dominio de destrezas quirúrgicas antes de proceder. Módulo 2: Prácticas de microinyección transuterine en el otocyst en una presa de anestesia sin la expectativa de completar la cirugía de la supervivencia: la eutanasia de la presa, bajo anestesia, aislar los embriones inyectados, y evaluar la calidad de las inyecciones otocyst. Módulo 3: Target sólo 2 otocysts de 2 embriones diferentes, con verde rápido, no electroporar, lleve a cabo la cirugía, y validar la supervivencia embrionaria aguas abajo. Módulo 4: sólo se dirigen a dos embriones con el ADN / solución verde rápido electroporar, validar la supervivencia embrionaria aguas abajo, y determinar la transfección EFFICIENCY. Módulo 5: sólo se dirigen a dos embriones con ADN / solución verde rápido, electroporar, inyectar Alexa Fluor en el ventrículo 4 al etiquetar el embrión manipulado, seleccionar embriones etiquetados en P0, y la eficiencia determinar la transfección.
Curva de aprendizaje de Procedimiento: El dominio de las técnicas de cirugía de supervivencia de ratones, con la orientación adecuada del personal veterinario y quirúrgico de la institución de origen de uno, es bastante rápido y sólo se requieren 3-5 represas-el valor de la práctica para los principiantes para ganar experiencia. Transuterine microinyección y electroporación in vivo para generar útil transfectadas oído interno se requieren 10-50 presas-vale la pena el esfuerzo, asumiendo que hay 6 embriones viables por el embarazo y el enfoque modular se siguieron. Aquellos estudiantes que disfrutan de actividades que requieren habilidades motoras finas (por ejemplo, tocar un instrumento musical, la costura, el modelo de decisiones, o los deportes competitivos) tienen períodos más cortos de entrenamiento que Those que no lo hacen. Las correlaciones fundamentales para dominar con éxito de estos métodos son una atención escrupulosa al detalle (es decir, la microinyección pipeta de fabricación, la anatomía vascular, explícita toma de notas) y un comportamiento bastante tranquilo.
Flujo de trabajo: Una vez que se gana experiencia, se puede anticipar la inyección y electroporación 4-6 embriones por madre, y 3-5 embriones sobreviven a voluntad, y 2-4 embriones se han oído interno transfectadas útil para el análisis. El cerebro posterior Alexa Fluor técnica de etiquetado a los embriones de etiquetas para clasificar al nacer requiere de la inyección adicional de cerebro posterior en cada embrión electroporated, pero esto es bien tolerado y no afecta negativamente a la eficacia procesal. Así, la tasa de recuperación de utilidad transfectadas oído interno de electroporación in vivo se compara favorablemente con la tasa de recuperación de los ratones mutantes homocigotos de un paradigma de cría heterogygous. Con la experiencia, 2-3 presas por investigador por día es un trabajo razonablede flujo: 1,5 horas por la presa para la cirugía y un total de 1.5-2 horas para el seguimiento post-operatorio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Humana Press el permiso para publicar la pipeta de microinyección de fabricación de la figura que apareció originalmente en la página 130 de la referencia 11, Larry Dlugas y Wong Steven, OHSU Departamento de Comunicación Educativa, por videografía, Larry Dlugas para el diseño y edición de vídeo, Adam M. S Quinn, el diseñador senior, Trion / Envirco para el diseño de nuestra costumbre campana de flujo laminar horizontal, y el orfebre de Les para proporcionar el esquema técnico, Víctor Monterroso, MV, MS, PhD y Chatkupt Tom, DVM, OHSU Departamento de Medicina Comparada, de orientación con nuestro animales protocolo de atención, las técnicas quirúrgicas, y profilácticos régimen de analgesia; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, por compartir su folleto sobre técnicas de sutura veterinarios; Edward Porsov, MS, para el diseño de nuestra Adobe Premiere Pro microscopio de vídeo monitor y la computadora, y Blanca Lía y Jonas Hinckley de la LNS subtítulos (Portland, Oregón). Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de la Sordera y other Trastornos de la Comunicación: 008595 DC R01 y R01 DC 008595-04S2 (JB) y P30 DC005983 (Oregon Audiencia Centro de Investigación Core Grant, Peter Gillespie, investigador principal).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | BD Biosciences | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Micr–lectrode Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
- Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).
