Summary
En 3D kultur system for hematopoiesis beskrives ved hjelp av menneskelig navlestrengsblod og leukemic benmargceller. Metoden er basert på bruk av en porøs syntetisk polyuretan stillas belagt med ekstracellulære matrix proteiner. Dette stillaset er tilpasningsdyktige for å imøtekomme et bredt spekter av celler.
Abstract
Blodkreft stamceller krever et unikt mikromiljøet for å opprettholde blod celle formasjon 1; benmarg (BM) er en kompleks tredimensjonal (3D) vev der hematopoiesis er regulert av romlig organisert cellulære microenvironments kalt nisjer 2-4. Organiseringen av BM nisjer er kritisk for funksjon eller dysfunksjon av normal eller ondartet BM 5. Derfor en bedre forståelse av in vivo mikromiljøet med en ex vivo parodiering ville hjelpe oss belyse de molekylære, cellulære og microenvironmental determinanter for leukemogenesis 6.
Foreløpig er hematopoetiske celler dyrket in vitro i to-dimensjonale (2D) vevskulturstudier kolber / brønn-plater 7 krever enten co-kulturen med allogenic eller xenogenic stromale celler eller tillegg av eksogene cytokiner 8. Disse forholdene er kunstig og skiller seg fra in vivo 9,10.
Heri presenterer vi en ny 3D beinmarg kultur system som simulerer in vivo 3D vekst miljøet og støtter multilineage hematopoiesis i fravær av eksogene vekstfaktorer. Den svært porøse Stillaset brukes i dette systemet laget av polyuretan (PU), forenkler høy tetthet cellevekst over en høyere spesifikk overflate enn den konvensjonelle monolayer kulturen i 2D 11. Vårt arbeid har vist at denne modellen støttes veksten av menneskelig ledningen blod (CB) mononukleære celler (MNC) 12 og primære leukemic celler i fravær av eksogene cytokiner. Denne romanen 3D mimikk gir en levedyktig plattform for utvikling av en menneskelig eksperimentell modell for å studere hematopoiesis og å utforske nye behandlinger for leukemi.
Protocol
1. Stillas Produksjon og Bio-funksjonalisering av Stillaser
- For å dikte PU stillasene (porestørrelse 100-250 mm, porøsitet 90-95%) i form av petriskål disker, bruke termisk induserte faseseparasjon 13 prosessen med å utarbeide en polymer løsning (5wt% i Dioxan) etterfulgt av frost og påfølgende løsemiddel sublimering (figur 1A).
- Skjær stillaset disken i terninger på 0,5 x 0,5 x 0,5 mm før belegg med ECM proteiner (Figur 1B).
- Pre-våte stillasene ved å dyppe dem i etanol (70%) i 1 min og deretter overføre til fosfatbufret saltvann (PBS) for 20 min. Så sentrifuger for 10 minutter ved 3630 xg og tilsett protein løsning.
- Sentrifuger stillasene i protein løsningen på 1420 xg i 20 min.
- For å oppheve overflaten porene, og la cellene seeded å trenge dypere inn i stillaset, sentrifuger Stillasene en mer tid på 910 xg i 10 mini PBS.
- Sterilisere stillasene ved hjelp av en kombinasjon av 8 min eksponering på 230 V, 50 Hz, 0,14 A, UV lampe, med nedsenkning til to timer i etanol (70%). Etter det, vaske stillasene to ganger i PBS før du legger Iscove modifiserte Dulbecco Medium (IMDM) supplert med 30% fosterets storfe serum (FBS) og 1% Penicillin og Streptomycin (P / S). Plasser stillasene i en fuktet inkubator i 3 dager ved 37 ° C og 5% CO 2 før bruk. Sterile Stillasene er plassert i en 24 godt vevskulturstudier plater (en stillas per brønn).
2. Mononukleære celleisolasjon og Stillas Seeding
- Utdrag menneskelig MNC fra navlestrengsblod eller leukemic beinmargen prøvene, bruker Ficoll-Paque tettshetsgradient sentrifugering (35 min ved 1500 rpm) (figur 1C).
- Resuspender MNC i IMDM inneholder 30% FBS og 1% P / S.
- Seed 100μl av MNC suspensjon (2 × 10 6 celler / stillaset) på stillaser med en mikro-pipette.
- Inkuber seeded stillasene ved 37 ° C under 5% CO 2 i 10 minutter for cellene å bosette seg i stillasene.
- Fyll opp hver brønn opp med 1,5 ml IMDM inneholder 30% FBS og 1% P / S og sted vel plater i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO 2 for varigheten av forsøket.
- De seeded stillasene gjennomgå daglig bytte av alle medier.
3 I situ celleproliferasjon og morfologi:. MTS, SEM og Cytospins
- MTS analysen: Fjern fra kultur en un-seeded og to seeded stillasene og plasser i en ren ny 24 godt plate. Tilsett 1 ml av media og 200 mL av MTS løsningen og inkuber 3 t ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Ta 8 x 100 mL prøver fra supernatanten, legg i en 96-brønns plate og måler absorbansen ved 490 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
- Scanning elektronmikroskopi (SEM): På ulike tidspunkt av the kultur, fjerne stillas seeded med MNC fra media, og fest med 2,5% PBS-bufret glutaraldehyd løsning for 40 min ved 4 ° C, vask deretter to ganger med PBS.
- Dehydrert stillasene i en gradert serie med etanol (25, 50, 70, 80, 90, 95, og 100%), hver i 10 min og tørt i en aseptisk miljø for 4 timer.
- § prøver og deretter frese-coat dem med gull i en argon atmosfære for 2 min før SEM evaluering, bruk en akselerasjon spenning på 20 kV.
- Cytospins: Samle 2,0 x 10 4 celler / slide ved å aspirere cellene fra stillaset ved ulike tidspunkt i kulturen.
- Sentrifuger cellene på en glass-slide for 3 min ved 1500 rpm.
- Flekk lysbildene med Wright-Giemsa Stain Modifisert og observere ved hjelp av en optisk mikroskop. F-vis Soft Imaging System kan brukes til å ta bilder.
- Vask glir før mikroskop observasjon.
- M ultiphoton analyse: Fix stillasene på ulike tidspunkter med etanol damp (70%) over natten og deretter tørre og oppbevar ved -20 ° C til videre analyse. Før visualisering med multiphoton mikroskop delen stillaset til 30 mikrometer tykke lysbilder og våt med PBS.
- Blokker seeded stillasene i PBS med 10% fosterets bovint serum i 30 min ved romtemperatur.
- Inkuber stillasene natten ved 4 ° C i mørket med en 1:50 fortynning av primær monoklonalt antistoff: mus anti human CD71.
- Vask prøver tre ganger i PBS og beis med det sekundære antistoff: anti-mus Alexa Fluor 488 i 1 time ved romtemperatur i mørket.
- Vask prøver tre ganger med PBS og observere med en confocal mikroskop med en vann-utslipp X60 objektiv.
- Fluoroforen Alexa Fluor 488 er eksitert ved 488 nm ved pulsatile lasere. Volocity 5.3.2 programvare kan brukes for etterfølgende bildeanalyse.
- Før mobilnettet analyse i strømningscytometeret (FC), merke cellene av interesse med tilsvarende immunfluorescens antistoffer til påvisning. En rekke prøver er forberedt i henhold til de utvalgte antistoffer til påvisning. For MNC påvisning følgende kombinasjon av antistoffer er brukt: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- Sug cellene fra stillaset ved ulike tidspunkt og sentrifuger. Løs opp en celle pellet på rundt 1x10 6 celler i 100 mL FC buffer (PBS + 0,1% natriumazid) og tilsett 10 mL av hver antistoff fluorescens fargestoff. Inkuber cellene i 30 min ved 4 ° C, vask to ganger med PBS og endelig re-suspendere i FC buffer.
- Legg prøven i strømningscytometeret beiset med isotype kontrollen å stille inn "negativitet" av antistoff uttrykket og kalibrere deteksjon kanaler med strømningscytometeret kontroll.
- Les prøven farget w ed de tre forskjellige antistoffer og endelig representere dataene i bruk av WinList programvaren.
5. Representative Resultater
Et eksempel på blodkreft cellevekst kinetikk uten tillegg av eksogene vekstfaktorer er vist i figur 2. På grunn av den heterogene natur hematopoiesis, to forskjellige celler: normale og unormale blodkreft celler er illustrert. I figur 2A, er celleproliferasjonstest menneskelig CBMNC tydelig etter 28 dager i kultur. Figur 2B viser vekst kinetikken i parodiering ved hjelp av humane primære leukemic celler. Celleproliferasjonstest vurderes ved hjelp av MTS analysen som måler cellular metabolsk aktivitet i forhold til absorbans. I begge tilfeller cellene proliferated og etablert i modellen. Forskjeller i vekst kinetikk er observert; normale hematopoetiske celler etablerer kulturen raskere enn leukemic cellene.
_content "> morfologi av høstes cellene selv etter 28 dager med kultur i fravær av eksogene vekstfaktorer var typisk for normale hematopoetiske celler (figur 3A) og leukemic celler (Figur 3B). sentrale deler av stillasene ble analysert av SEM etter stillasene ble fjernet fra kulturen og viste spredning av seeded celler i hele stillaset, etablere seg i klynger og i "nisje-lignende" strukturer (Figur 3A '& B'). Figur C viser pore størrelse og fordeling i en unseeded stillaset brukes som en kontroll. multiphoton mikroskopi etter 28 dager ble brukt til å markere fordelingen av cellene i 3D stillaset på plass og det viste tilstedeværelse av erythroid øyer i sentrale deler av stillaset (figur 4) av uttrykket av markøren CD71 som er positivt i erytroblaster. Dette beviser viktigheten av modne og modning celler during erytropoese. Til slutt viser strømningscytometri grafer av cellene før såing forskjellen i fenotypen av hematopoetiske celler, hvor figur 5A representerer normale hematopoetiske celler: menneskelige CBMNCs og figur 5B illustrerer unormale hematopoetiske celler: primære leukemic celler. Nivåer av CD235a + og CD45 + tilsvarende erytrocytter og leukocytter henholdsvis er høyere i den normale prøven enn i leukemic synliggjøre hemoblastic natur leukemi.
Figur 1. Illustrasjon av prosessene som er involvert i PU stillas produksjon og bio-funksjonalisering. A) PU er oppløst i Dioxan (5wt%) og av termisk induserte fase separasjon prosess og påfølgende løsemiddel sublimering stillaset er produsert, som beskrevet av Safinia et al 13. B) Stillaset disken blir deretter kuttet into kuber på 0,5 x 0,5 x 0,5 mm, og deretter dekket ved sentrifugering med ekstra mobilnettet matrix (ECM) proteiner. C) MNC er hentet fra menneskelig umbilical CB eller fra BM aspirasjon bruke tettshetsgradient sentrifugering og seeded (2x10 6 celler / stillaset) i PU stillasene med en mikropipette.
. Figur 2 celleproliferasjonstest målt med MTS analysen: A) ved hjelp av menneskelig navlestrengsblod MNCs; B) ved hjelp av humane primære leukemic celler. Søylene viser vekst av celler over tid når seedet i PU stillaser uten tillegg av eksogene cytokiner.
Figur 3: Cell morfologi og fordeling rundt stillasene hjelp cytospins, scanning elektron mikrografer. (AB) Representative Wright-Giemsa beiset cytospins a) ledningen blod mononukleære celler hentet fra PU stillasene etter 28 dager med kultur, og B) bein aspireres leukemic celler hentet fra PU stillasene etter 14 dager med kultur. Begge forsøkene ble utført i cytokin fri tilstand. (A'-B ') Representative sentrale deler av PU stillaset SEM mikrografer av A') seeded navlestrengsblod MNCs og B ') leukemic celler etter å ha blitt dyrket i 28 dager, og C) kontroll stillas uten celler.
Figur 4. Multiphoton micrograph av en PU stillas seeded med ledningen blod MNCs etter 28 d i kultur og beiset med erythroid markør CD71.
Figur 5. Flowcytometri 3D Dot-tomter farget for CD45, CD71 og CD235a overflaten uttrykk markører. Den isotype kontrollen fremstilte også presentert for sammenligning av den relative fluorescensintensiteten. Panel A viser menneskelige ledningen blod mononukleære celler positive for de ovennevnte markører; Panel B viser humane primære leukemic celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ex vivo 3D kultur systemet presenteres her gjør oss i stand til å etablere en 3D biomimicry av hematopoiesis som sammenfatter den opprinnelige BM arkitektur og cellulær fenotype uavhengig av eksogene cytokiner. 3D-modellen gir struktur og mikromiljøet som gjør at normale og unormale blodkreft cellene til å spre seg i forhold som ligner dem som møtte in vivo.
Valget av polymere stillaset materialet representerte et avgjørende skritt i biomimicry design. Viktige fordeler i biomaterialer har ført til en økende interesse i polymerer som etterligner in vivo miljøet ved å gi den nødvendige arkitektur, strukturelle egenskaper og nødvendige biosignals. Polymerer må oppfylle minimumskrav avgjørende for deres anvendelse i biomedisin, fordi de alltid er i direkte kontakt med levende celler, som er følsomme for sitt nærmiljø. Generelt en jegavtale stillaset skal være biokompatibelt, svært porøs, med nok mekanisk styrke til å opprettholde en definert 3D-struktur, høy overflate per volum ratio og reproduserbar fabrikasjon. PU omfatter alle disse egenskapene sammen selv om høy porøsitet og mekanisk styrke kan tilpasses og endres avhengig slukke temperatur under TIPS prosessen. Som et resultat, kan dette biomimicry tilpasses andre typer celler ved å øke eller redusere porøsitet og pore størrelse etter behov.
Stillaset i dette eksperimentet er belagt med ECM proteinet kollagen type I, og dette proteinet, ble sammen med andre ECM proteiner testet tidligere med vår 3D-modell 11. Dette viste at kollagen type I akselerert celle adhesjon og ble valgt av den grunn. Belegget kan endres ved hjelp av ulike ECM proteiner avhengig av hvilken type celler som blir undersøkt. Fordelen å innlemme ECM proteiner til syntetisk stillasene is som ikke bare de gir cellen-bindende sekvens for celle adhesjon, men tilbyr også sekundære interaksjoner med andre ECM proteiner og interaksjoner med vekstfaktorer som stabiliserer binding av cellene og dermed forsterke celle adhesjon, noe som resulterer i bedre celle vekst og modning.
Tallrike studier har vært gjort på ex vivo hematopoiesis bruker både 2D og 3D-systemer, og alle av dem inkluderer tilføyelsen av unormalt høye konsentrasjoner av eksogene cytokiner. Disse studiene har bidratt til å belyse den molekylære determinanter av hematopoiesis, men de cellulære og microenvironmental elementer integrert i denne prosessen har vært vanskelig å tyde basert på begrensningene i de samme teknikkene.
Metoden som beskrives her, en biomimicry av BM laget av en svært porøs polymer stillas kombinert med ECM belegg er optimal for å opprettholde og stabilisere veksten av normale og unormale hematopoiesis utenbehovet for noen tillegg av cytokiner. Den parodiering støtter multi-Lineal hematopoiesis gjengi systemet velegnet for bruk som en plattform for medisiner og vitenskapelig studie i mekanismene for normal og unormal hematopoiesis ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Richard Thomas Leukemi Fund, Lady Tata Memorial Trust, den Northwick Park Hospital Leukemi Research Trust Fund og National Institute of Health Research (NIHR), Storbritannia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N. Methods in Cell Biology. Prescott, D. 14, Academic Press Inc. New York. 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
