Summary
Un roman à haut débit méthode est décrite qui permet la détection et la quantification relative de petit ARN et d'expression d'ARNm à partir des cellules bactériennes simples en utilisant des sondes d'acides nucléiques verrouillés et cytométrie en flux par fluorescence-
Abstract
L'hybridation fluorescente in situ (FISH) est une technique puissante qui est utilisée pour détecter et localiser des séquences spécifiques d'acide nucléique dans l'environnement cellulaire. Afin d'augmenter le débit, le poisson peut être combinée avec la cytométrie de flux (flow-FISH) pour permettre la détection de séquences d'acide nucléique cible dans des milliers de cellules individuelles. En conséquence, le débit-FISH propose un net avantage sur lysat / ensemble basée sur des méthodes de détection des acides nucléiques, car chaque cellule est traitée comme une observation indépendante, permettant ainsi des analyses statistiques plus fort et la variance. Ces attributs ont incité l'utilisation de méthodes de FISH et de débit-FISH dans un certain nombre de différentes applications et l'utilité de ces méthodes a été démontrée avec succès dans la détermination de la longueur des télomères 1,2, l'identification cellulaire et l'expression du gène 3,4, suivi de la multiplication virale 5 cellules infectées, et l'analyse des communautés bactériennes et le dénombrement6.
Traditionnellement, la spécificité des méthodes de FISH et écoulement du poisson a été communiquée par les sondes d'oligonucléotides d'ADN. Récemment toutefois, le remplacement des sondes oligonucléotidiques d'ADN avec des analogues d'acides nucléiques comme sondes FISH et flux de poissons a augmenté à la fois la sensibilité et la spécificité de chaque technique en raison de la température de fusion élevée (T m) de ces analogues pour les acides nucléiques naturels 7,8 . D'acides nucléiques verrouillés (LNA) sondes sont un type de analogiques acide nucléique qui contiennent les nucléotides LNA pointes à travers une séquence d'ADN ou d'ARN 9,10. Couplé avec un débit-FISH, sondes LNA ont été précédemment montré à surperformer les sondes d'ADN conventionnelles 7,11 et ont été utilisés avec succès pour détecter l'ARNm eucaryotes 12 et l'ARN viral dans les cellules de mammifères 5.
Ici nous étendre cette capacité et décrire un LNA flux POISSONS méthode qui permet la détection spécifique de l'ARN dans la cellule bactériennes (figure 1). Plus précisément, nous nous intéressons à la détection de petits non-codant l'ARN de régulation (SRNA) qui ont remporté un intérêt considérable dans les dernières années car ils ont été trouvés pour servir les principaux éléments de la réglementation dans de nombreux processus cellulaires critiques 13. Cependant, il existe des outils limités pour étudier les défis et les petits ARN de détecter petit ARN dans les cellules bactériennes est due en partie à la taille relativement faible (typiquement 50 à 300 nucléotides de long) et la faible abondance de molécules d'ARNs ainsi que la difficulté générale à travailler avec de plus petites cellules biologiques avec plus ou moins les membranes cellulaires. Dans cette méthode, nous décrivons les conditions de fixation et permeabilzation qui préservent la structure des cellules bactériennes et permettre la pénétration des sondes LNA ainsi que les étapes d'amplification du signal qui permettent la détection spécifique de faible abondance Srna (figure 2).
Protocol
1. Sondes LNA & design expérimental
- Conception des sondes LNA qui sont le complément inverse de votre petit ARN transcrits / ARNm ou les ont conçus sur mesure au www.exiqon.com . Si vous utilisez l'option design personnalisé, vous connaîtrez la séquence, mais pas le modèle de dopage LNA. L'ajout de chaque résidu de LNA dans un ADN ou d'ARN oligonucléotides résultats par une augmentation de T m comprise entre deux et 10 ° C pour l'hybridation d'un duplex ARN LNA-14. Idéalement, les sondes LNA conçu devrait être entre 20-25 nucléotides de long (plus de sondes sont plus difficiles à synthétiser) et ont un Tm comprise entre 85-90 ° C pour l'ARN hybridation.
- Après la conception de la séquence, l'utilisation de BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou comparer la séquence de sonde à votre base de données locale pour assurer la sonde est spécifique à votre petit ARN / ARNm d'intérêt.
- Lors de la commande de la sonde LNA, ajouter une modification à la biotine TEG à l'extrémité 5 'de l'oligonucléotide LNA. La biotinylation est nécessaire pour la post-hybridation coloration avec un conjugué streptavidine-colorant. Il est possible d'ajouter cette modification de l'extrémité 3 'si nécessaire, mais l'addition à l'extrémité 5' est moins cher et devrait se traduire par des rendements plus élevés.
- Trois contrôles négatifs doivent être inclus dans la méthode: (i) un contrôle "non LNA» dans lequel une sonde LNA n'est pas ajouté au cours de l'étape d'hybridation, (ii) un «sans colorant» de contrôle dans lequel la sonde LNA est hybride à la cibles petit ARN, mais l'événement d'hybridation n'est pas détectée en raison de l'absence du colorant fluorescent, et de contrôle (iii) 'ARNm non exprimé petit ARN /' une qui utilise une sonde LNA qui cible un petit ARN inexistantes ou non exprimées dans l'ordre de surveiller une hybridation non spécifique.
- La sonde spécifique LNA ici est complémentaire à l'CsrB SRNA et a la séquence 5'-biotine-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(monomères LNA dansmajuscules).
- Après réception du lyophilisé LNA, resuspendre avec une eau sans nucléase à 50 pg / mL et de stocker en 10-20 aliquotes à -20 ° C.
Solutions
- 8% (PFA) paraformaldehye, 10% d'acide acétique dans du PBS: Mélanger 1 ml 32% PFA, 400 ul d'acide acétique, 400 ul PBS 10X, pH = 7,4, et 2,2 ml d'eau sans nucléase. Pour aliquotes congelés, en aliquots à usage unique à -20 ° C sans acide acétique.
- 60% solution de sulfate de dextrane: ajouter 6,0 g de sulfate de dextrane à un tube conique de 50 ml et ajouter l'eau pour un volume final de 10 ml. Chauffer ce mélange à 65 ° C dans un bain d'eau jusqu'à ce que le sulfate de dextran est dissoute (peut prendre 1-2 heures). D'eau supplémentaire peut être nécessaire d'ajouter tout au long du procédé de solubilisation de maintenir un volume de 10 mL. Aliquoter la solution 60% de sulfate de dextran et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Fixation
- Récolte 1x10 8 cellules de bioluminescents
- Pellet, les cellules bactériennes par centrifugation à 2300 xg pendant cinq minutes. Jeter le surnageant par pipetage et remettre en suspension les cellules dans 400 ul de PBS 1X.
- A ce mélange, ajouter 400 ul d'une paraformaldehye 8% (PFA) et 10% d'acide acétique dans une solution saline tamponnée de phosphate 1X (1X PBS), bien mélanger, et laisser incuber pendant 10 minutes à 25 ° C le mélange une fois après cinq minutes. Toutes les incubations, sauf indication contraire, sont effectuées dans un porte-tube chauffé. La solution PFA doivent être préparés frais ou d'occasion à partir aliquotes congelées après l'addition d'acide acétique. Paraformaldéhyde est un fixateur de réticulation que hPEL afin de préserver la morphologie cellulaire et de conserver l'ARN intracellulaire.
- Pellet les cellules de ce mélange par centrifugation à 4500 xg pendant deux minutes et retirer le surnageant par pipetage. Toutes les étapes à venir qui nécessitent une centrifugation devrait utiliser les mêmes paramètres (7K, 2 min). Il est important de noter que les surnageants après centrifugation doit être retiré par pipetage et pas de décantation.
- Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X et resuspendre le culot cellulaire final dans 400 ul de PBS 1X. Les cellules sont désormais fixes et peuvent être conservés à 4 ° C dans 400 ul de PBS 1X pour un maximum de sept jours.
3. Traitement de pyrocarbonate de diéthyle
- Préparer 400 ul d'une solution à 0,1% du diéthyl pyrocarbonate (DEPC) dans du PBS 1X (400 pl de cette solution est nécessaire pour chaque échantillon à tester afin d'échelle en conséquence). La solution DEPC doit être préparé à partir d'un stock de DEPC. Le traitement DEPC inactive RNases par carbethoxylation et diminue lasignal de fond.
- Ajouter 400 ul de la solution de 0,1% DEPC à chaque échantillon de cellules bactériennes fixées et bien mélanger par pipetage. Incuber ce mélange à 25 ° C pendant 12 minutes. Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant.
4. Perméabilisation
- Ajouter 1,0 mg de lysozyme à 1 mL de tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) pour un 1,0 mg / ml solution. Cette solution doit être préparé. Ajouter 800 ul de 1 mg / ml solution de lysozyme dans les cellules, bien mélanger par pipetage et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Le lysozyme agit comme un réactif de perméabilisation en hydrolysant le présent peptidoglycane dans les parois des cellules bactériennes.
- Préparer un 3,0 mg / ml solution de protéinase K dans du tampon TE. Cette solution doit être préparé à partir d'un stock de 20 mg / ml de protéinase K qui est stocké à -20 ° C.Protéinase K est une sérine protéase qui digère une variété de protéines et contribue à l'accessibilité des sondes et des réactifs à l'ARN.
- Ajouter 800 uL de la g 3.0 / ml protéinase K solution au culot cellulaire et bien mélanger par pipetage. Incuber à 25 ° C pendant 15 minutes avec vortex à mi-parcours de l'incubation.
- Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver les cellules une fois avec 400 ul de PBS 1X. Après avoir retiré le surnageant du lavage, remettre les cellules dans 400 ul de PBS 1X et ajouter 100 ml de la remise en suspension dans quatre nouveaux microtubes 1,5 ml. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant.
5. Hybridation
- Préparer 100 uL de tampon d'hybridation (HB) pour chaque échantillon. Le HB est constituée de formamide à 50% en volume, 10% de sulfate de dextrane en masse (ajouter 16,7 ul de la solution de sulfate de dextran 60% pour chaque uL 100), solution 1X Denhardt, 50 phosphate de sodium pH 7,0,Citrate de sodium 2X (SSC), 20 pg d'ADN de sperme de saumon cisaillé (SSSD) et 20 mg ARNt de levure.
- Chacune des composantes de l'HB a un but différent. Le formamide abaisse la température de fusion du duplex d'acides nucléiques permettant ainsi aux dénaturation de l'ARN et en minimisant les dommages cellulaires. Sulfate de dextran est utilisé comme un volume hors de polymère pour concentrer la sonde et d'augmenter le taux d'hybridation. Solution Denhardts, la levure et les ARNt SSSD servir des agents bloquants pour réduire la liaison non spécifique.
- Dans chacune des cellules remise en suspension contenant 1,5 ml microtubes, ajouter 95 uL HB et uL 5.0 du petit ARN / ARNm spécifiques de LNA [20 pmol de LNA concentration spécifique finale] ou de l'eau (pour le contrôle LNA pas de négatif). Par exemple:
- Tube de 1 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN / ARNm sonde spécifique
- Tube de 2 à 95 uL HB 5,0 + uL petit ARN / ARNm sonde spécifique (contrôle négatif "sans colorant")
- Tube de 3 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN/ ARNm de la sonde («non-exprimé petit ARN / ARNm« témoin négatif)
- Tube de 4 à 95 uL HB + 5,0 uL d'eau (contrôle négatif "non LNA»)
- Incuber tous les quatre échantillons à 60 ° C pendant 60 minutes. La température d'hybridation dépend de la sonde LNA m (s) T et devrait être fixé à environ 30 ° C en dessous de la Tm prédit pour le recuit ARN. Tant la température d'hybridation élevée et le formamide dans les HB assure la dénaturation de la structure secondaire de la SRNA ou ARNm d'intérêt.
6. Post-hybridation lave
- Après l'hybridation, ajoutez 1,0 ml à 0,1 X SSC avec 0,1% de Tween-20 (SSCT) pour le mélange d'hybridation. Cela est nécessaire pour permettre aux cellules d'être retiré de la solution d'hybridation visqueux. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant.
- Ajouter 200 ul de 50% de formamide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 à l'culots cellulaires, mélanger soigneusement et Incubmangé pendant 30 minutes à 65 ° C dans un bloc de chauffage.
- Ajouter 1 mL 0,1 X SSCT au mélange, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant.
- Ajouter 500 uL SSCT 0,1 X pour remettre les cellules et incuber pendant 40 minutes à 65 ° C dans un bloc thermique. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant.
7. Blocage et coloration
- Préparer le tampon de blocage (BB) et la solution de coloration streptavidine-colorant. Préparer une solution 1X BB à partir d'un stock de 5X (disponible dans le commerce, voir réactifs). Pour chaque ensemble de quatre tubes, préparer 1,2 ml 1X BB.
- Ajouter 200 ul 1X BB au culots cellulaires, resuspendre et incuber pendant 30 minutes à 25 ° C.
- Un colorant streptavidine conjuguée est utilisé pour détecter les sondes LNA biotinylé. Alors que le blocage, préparer une solution de 2 pg / ml DyLight 488 streptavidine ou votre désirée colorant streptavidine conjugué 1X BB pendant 30 min (pour trois échantillons, faire 300 uL).
- Après Incubtion avec 1X BB, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Ajouter 50 uL de la solution de streptavidine-teinture pour les culots cellulaires, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. Pour le reste du protocole, de protéger les tubes de lumière en utilisant du papier d'aluminium.
- Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 ul de PBS 1X avec 0,1% de Tween-20 (PBST). Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant.
- Après les premières conjugué streptavidine-coloration, le signal est amplifié par l'introduction d'un anti-streptavidine biotinylé anticorps au conjugué streptavidine-dye et coloration une seconde fois avec la streptavidine-dye augmentant ainsi le signal de sortie par hybridation de sonde LNA (figure 2) .
- Ajouter 100 ul de 1 pg / mL biotinylé anti-streptavidine anticorps dans du PBS 1X, resuspend les cellules et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver deux fois avec 400 uL PBST 1X.
- Ajouter 50 uL de la 2 mg / ml de streptavidine-dye solution pour les cellules, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement.
- Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 uL PBST 1X.
- Resuspendre les cellules dans 200 uL PBST 1X et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de l'analyse par cytométrie de flux. Pour les plus petites cellules bactériennes régler le débit de ralentir pour diminuer la taille du cœur. En outre, pour les cytomètres de flux avec l'attaquant seuils seuil de dispersion, la coupure doit être aussi basse que possible pour assurer les petites cellules bactériennes sont détectées.
- Pour DyLight 488 de détection, le cytomètre de flux doit être équipé d'un laser à 488 nm et d'émission standardfiltres pour FITC. Au moins 2x10 4 événements devraient être collectées. Pour la compatibilité avec cytomètres équipés de lasers différents, d'autres streptavidine conjuguée à des fluorophores peut être utilisé pour ce protocole.
8. Les résultats représentatifs
Un exemple de cellules qui sont fixées et perméabilisées efficace est indiqué dans le dot plot de cytométrie en flux sur la figure 3A. Lorsque les conditions décrites ci-dessus pour la perméabilisation, la population cellulaire est petite et homogène indiquant agrégats de cellules rares. Lorsque supérieur (5 mg / ml) des concentrations de lysozyme sont utilisés, les cellules sont plus susceptibles d'agréger et de présenter des valeurs de dispersion accrue de l'avant, indicatifs de particules plus grosses (figure 3B). Un exemple de données de cytométrie en flux à partir d'un flux de succès LNA-FISH expérience est montré dans la figure 4. L'histogramme montre la détection spécifique d'un petit ARN cible avec trois contrôles négatifs.Le «sans colorant» contrôle négatif produit le moins de fluorescence, suivie par le «non LNA» et «non-exprimé petit ARN 'contrôles négatifs. Enfin, l'échantillon avec la sonde petit ARN spécifiques de LNA qui produit le plus de fluorescence. Une fois la méthode et les sondes LNA sont validés de cette manière, des expériences complémentaires peuvent être conçus pour surveiller les changements dans le signal petit ARN au cours du temps, en réponse à des mutations ou des conditions de culture variées, etc
Figure 1. Représentation du schéma d'ensemble d'un flux de LNA-FISH expérimentation pour la détection de la SRNA bactérienne.
Figure 2. Coloration et l'amplification des flux de LNA-FISH signal. a) L'hybridation de la sonde biotinylée LNA. b) Coloration avec les fluorescents DyLight 488 conjugué streptavidine. c) La liaison de l'biotinylé anti-sd'anticorps à l'treptavidin DyLight 488 streptavidine. L'anticorps peut se lier streptavidine grâce à son site de liaison antigénique ou peut être lié par la streptavidine à travers ses résidus de biotine. d) L'amplification du signal par une coloration plus loin avec l'fluorescentes DyLight 488 conjugué streptavidine.
Figure 3. Parcelles de cytométrie en flux de point montrant l'avant par rapport aux résultats d'une diffusion latérale) 1 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation et b) 5 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation.
Figure 4. Analyse de l'histogramme de l'écoulement LNA POISSONS résultats. Le signal fluorescent généré à partir de chaque échantillon est représenté par les quatre traces: noir - petit ARN spécifiques LNA sonde; rouge - contrôle négatif "non-exprimée petit ARN; bleu - contrôle négatif" non LNA; violet -Contrôle négatif "sans colorant".
Discussion
Le flux de LNA-FISH méthode présentée ici a été utilisé pour détecter l'expression d'un petit ARN de la Gram-négatif bactérie marine Vibrio campbellii dont l'expression a déjà été confirmée par le profil d'expression basé sur un microréseau et inverser la réaction en chaîne par polymérase après transcription 16. À ce jour, nous avons utilisé cette méthode pour contrôler l'expression d'une variété d'ARN (par exemple trans-encodé Srna, petit ARN qui modulent l'activité des protéines, riboswitches et ARNm). En tant que tel, nous sommes convaincus que la méthode est adaptable et peut être utilisé pour détecter une cible petit ARN ou ARNm et peut être modifié pour être utilisé dans toutes les espèces bactériennes ou type de cellule. Si la modification de ce protocole est nécessaire pour d'autres types cellulaires, la variable la plus importante à considérer la manipulation est l'étape de perméabilisation. Par exemple, lors de la modification des conditions de perméabilisation décrit ici, les changements dans les concentrations de lysozyme et la protéinase K doit être testé. Nous avons constaté que doubler outripler la quantité de lysozyme et la protéinase K ont entraîné des changements majeurs dans les flux de LNA-FISH résultats. Par ailleurs, lors du test des conditions de perméabilisation supplémentaires, les cellules doivent être analysés pour l'agglutination, la perte de cellules, et le meilleur signal obtenu au ratio de fond de fluorescence. L'étendue de l'agglutination de cellules peuvent être testés pour la microscopie et / ou la cytométrie de flux. Par cytométrie en flux, amas cellulaires sont présents que dans une queue avant vs dot plot côté de dispersion et la méthode de perméabilisation correct de minimiser cet effet de résidus. Cette méthode est également prête à la détection de petit ARN multiplex, sans modifications majeures au protocole décrit comme complémentaires des sondes LNA étiquetés avec des haptènes tels que la digoxigénine pourrait être ajouté lors de l'étape d'hybridation puis détecté avec un anticorps anti-digoxigénine et secondaires d'anticorps fluorophore conjugué. Actuellement, la seule limitation que nous avons rencontrés avec cette méthode est son incapacité à générer un signal suffisamment de faiblement exespèces petit ARN pressées et des efforts sont en cours pour déterminer le seuil de détection (en nombre de copies par cellule absolue).
Globalement, les flux de LNA-FISH méthode fournit l'occasion de mesurer petit ARN bactérien ou l'expression des ARNm au niveau des cellules simples de façon à haut débit pour fournir des indications sur la présence et l'abondance relative d'une espèce SRNA et la mesure dans laquelle son expression varie dans une population.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Office of Naval Research des États-Unis via des fonds de recherche navale coeur de laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems | AM9625 | |
| Nuclease-free water | Applied Biosystems | AM9932 | (not DEPC treated) |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
| Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L2879 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems | AM2546 | |
| Formamide | Applied Biosystems | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
| Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma-Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
| Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
| Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems | AM9770 | |
| Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems | AM9680 | Aliquot and freeze |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies | 15401-011 | Aliquot and freeze |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
| DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
| Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |
References
- Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).
- Lansdorp, P. M. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).
- Pernthaler, A., Amann, R. Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).
- Jen, C. J. Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).
- Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH. RNA. 16, 1679-1685 (2010).
- Friedrich, U., Lenke, J. Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11, 1745-1748 (2005).
- Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers. Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).
- Obika, S. Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering. Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).
- Koshkin, A. A. LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).
- Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).
- Robertson, K. L., Thach, D. C. LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes. Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).
- Waters, L., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136, 615-628 (2009).
- Petersen, M., Wengel, J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).
- Corput, M. P. C. vd, Grosveld, F. G. Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells. Methods. 25, 111-118 (2001).
- Silveira, A. C. G. Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios. Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).
