Summary
Роман высокой пропускной описан метод, который позволяет обнаружение и относительной количественного малых РНК и экспрессию мРНК из одного бактериальных клеток с использованием заблокирован нуклеиновых кислот зондов и проточной цитометрии флуоресценции
Protocol
1. МШУ зондов и опытно-конструкторских
- Дизайн МШУ зондов, которые обратном дополнением вашей транскрипции р-РНК / РНК или их специально созданных на www.exiqon.com . Если вы используете нестандартный дизайн, вы будете знать, последовательности, но не образец МШУ пики. Добавление каждого остатка МШУ в ДНК или РНК олигонуклеотид приводит к увеличению Т м от двух до 10 ° С для МШУ-РНК гибридизации дуплекс 14. В идеале, предназначен зондов МШУ должна быть в пределах 20-25 нуклеотидов в длину (более длинные зонды являются более трудными для синтеза) и Т м между 85-90 ° C для РНК-гибридизации.
- После разработки последовательности, используйте BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi или сравнивать последовательности зонда к локальной базе данных для обеспечения зонд, характерные только для вашего р-РНК / мРНК интересов.
- При заказе зонд МШУ, добавляют биотин-TEG модификации до конца 5 'олигонуклеотидных МШУ. Биотинилирование необходимо для пост-гибридизация окрашивания стрептавидин-конъюгированных с красителем. Можно добавить эту модификацию 3 'конец, если необходимо, но дополнение к 5' концу дешевле и должно привести к повышению урожайности.
- Три отрицательного контроля должны быть включены в метод: (я) контроль »не МШУ", в котором зонд МШУ не добавляется во время гибридизации шаг, (II) управление "нет красителей", в котором зонд МШУ гибридизации с целевой р-РНК, но гибридизации событие не обнаружены из-за отсутствия флуоресцентные пятна, и контроль (III) "не выразил р-РНК / мРНК ', которая использует датчик МШУ, что цели не существуют, либо не-р-РНК выражены в порядке для контроля неспецифической гибридизации.
- Конкретные зонд МШУ здесь является дополнением к рРНК CsrB и последовательность 5'-биотин-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA мономеров взаглавные буквы).
- После получения лиофилизированного МШУ, ресуспендируют с нуклеазы без воды до 50 мкг / мл и хранят в 10-20 мкл аликвоты при -20 ° C.
Решения
- 8% paraformaldehye (PFA), 10% уксусной кислоты в PBS: Смешайте 1 мл 32% PFA, 400 мкл уксусной кислоты, 400 мкл 10X PBS, рН = 7,4 и 2,2 мл нуклеазы без воды. Для замороженные порции, заморозить в одной порции использовать при температуре -20 ° С без уксусной кислоты.
- 60% декстран сульфата решение: добавить 6,0 г декстрана сульфата 50 мл коническую пробирку и добавляют воду до конечного объема 10 мл. Тепло этой смеси до 65 ° С на водяной бане до сульфата декстрана растворяется (может занять 1-2 ч). Дополнительная вода может нужно добавить всей солюбилизации процесса для поддержания объема 10 мл. Алиготе 60% раствора сульфата декстрана и храните при температуре от -20 ° C до использования.
2. Фиксация
- Урожай 1x10 8 ячеек биолюминесцентных
- Гранул бактериальных клеток путем центрифугирования при 2300 мкг в течение пяти минут. Удалите супернатант с помощью пипетки и ресуспендирования клеток в 400 мкл 1X PBS.
- К этой смеси добавить 400 мкл 8% paraformaldehye (PFA) и 10% уксусной кислоты в 1X фосфатным буферным раствором (1X PBS), решение, хорошо перемешать и инкубировать 10 минут при 25 ° C смешивания один раз через пять минут. Все инкубации, если не указано иное, выполняются в отапливаемом держателя трубки. Решение PFA должны быть готовы использовать свежие или замороженные из аликвот после добавления уксусной кислоты. Параформальдегид является сшивание фиксатором, что чelps сохранить морфологии клетки и сохраняют внутриклеточных РНК.
- Гранул клетки из этой смеси путем центрифугирования при 4500 мкг в течение двух минут и удалить супернатант с помощью пипетки. Все последующие шаги, которые требуют центрифугирования следует использовать те же настройки (7К, 2 мин). Важно отметить, что после центрифугирования надосадочную жидкость должна быть удалена с помощью пипетки, а не переливание.
- Вымойте клетки в два раза с 400 мкл 1X PBS и ресуспендируют окончательный осадок клеток в 400 мкл 1X PBS. Клетки исправлено и может храниться при температуре 4 ° С в 400 мкл 1X PBS на срок до семи дней.
3. Диэтиловый pyrocarbonate лечения
- Подготовка 400 мкл 0,1% раствора диэтилового pyrocarbonate (DEPC) в 1X PBS (400 мкл этого раствора необходимо для каждого образца для тестирования столь масштабного соответственно). DEPC решения должны быть подготовлены только что из DEPC акций. DEPC лечения инактивирует РНКаз по carbethoxylation и уменьшаетсяфонового сигнала.
- Добавить 400 мкл 0,1% DEPC решение каждого фиксированного бактериальные образцы клеток и хорошо перемешать с помощью пипетки. Выдержите эту смесь при температуре 25 ° С в течение 12 минут. Вымойте клетки в два раза с 400 мкл 1X PBS, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант.
4. Пермеабилизации
- Добавить 1,0 мг лизоцима в 1 мл Трис-ЭДТА буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) на 1,0 мг / мл раствора. Это решение должно быть подготовлено свежим. Добавить 800 мкл 1 мг / мл лизоцима решение клетки, тщательно перемешать с помощью пипетки и инкубировать при температуре 25 ° С в течение 30 минут при периодическом перемешивании. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Лизоцим действует как пермеабилизации реагента путем гидролиза пептидогликана присутствуют в клеточной стенки бактерий.
- Подготовка 3,0 мкг / мл раствора протеиназы К в буфере TE. Это решение должно быть подготовлено только что из 20 мг / мл протеиназы К акции, которая хранится при температуре -20 ° C.Протеиназы К сериновых протеаз, который переваривает различные белки и помогает доступности зондов и реагентов для РНК.
- Добавить 800 мкл 3,0 мкг / мл протеиназы К решению осадок клеток и тщательно перемешать с помощью пипетки. Инкубировать при температуре 25 ° С в течение 15 минут с вортексе в середине инкубации.
- Гранул клеток (7К, 2 мин), удалите супернатант и промыть клетки сразу с 400 мкл 1X PBS. После удаления надосадочной мыть, ресуспендирования клеток в 400 мкл 1X PBS и добавьте 100 мкл ресуспендирования на четыре новые пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант.
5. Гибридизация
- Подготовка по 100 мкл буфера гибридизации (HB) для каждого образца. HB состоит из 50% формамида по объему, 10% декстран сульфата по массе (добавьте 16,7 мкл 60% раствора сульфата декстрана на каждые 100 мкл), решение 1X Денхардта, 50 мМ фосфата натрия рН 7,0,2X цитрата натрия (SSC), 20 мкг стриженой ДНК спермы лосося (SSSD) и 20 мкг тРНК дрожжей.
- Каждый из компонентов HB имеет свое назначение. Формамид понижает температуру плавления нуклеиновых кислот дуплексы тем самым помогая с денатурации РНК и сведение к минимуму повреждения клеток. Декстран сульфат используется в качестве объема исключая полимер сосредоточиться зонда и увеличения скорости гибридизации. Denhardts решение, дрожжевой тРНК и SSSD служить блокаторы для снижения неспецифического связывания.
- В каждой из ячейки ресуспендирования содержащие пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных, добавить 95 мкл HB и 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных LNA [20 пмоль конкретных МШУ конечной концентрации] или воды (не МШУ отрицательный контроль). Например:
- Труба 1 - 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных зонд
- Tube 2 - 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных зонд (отрицательный контроль "нет красителей)
- Труба 3 - 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК/ МРНК зонда («не выразил р-РНК / мРНК" отрицательный контроль)
- Труба 4 - 95 мкл HB + 5,0 мкл воды (отрицательный контроль "нет LNA)
- Инкубируйте всех четырех образцов при 60 ° С в течение 60 минут. Гибридизации температура зависит от LNA зонд (ы) Т м и должен быть установлен приблизительно на 30 ° С ниже предсказанных Т м для РНК отжига. Оба повышенной температуре гибридизации и формамида в НВ обеспечивает денатурации вторичная структура р-РНК, или мРНК интересов.
6. После гибридизации моет
- После гибридизации, добавить 1,0 мл 0.1X SSC с 0,1% Твин-20 (SSCT) для гибридизации смеси. Это необходимо, чтобы клетки должны быть удалены из вязкого раствора гибридизации. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант.
- Добавить 200 мкл 50% формамида, 2X SSC, 0,1% Твин-20 в камеру гранулы, тщательно перемешать и incubел в течение 30 минут при температуре 65 ° С в нагревательном блоке.
- Добавьте 1 мл 0.1X SSCT к смеси, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалить супернатант.
- Добавить 500 мкл 0.1X SSCT для ресуспендирования клеток и инкубировать 40 минут при 65 ° С в тепло блоку. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант.
7. Блокировка и окрашивание
- Подготовка блокирующего буфера (BB) и стрептавидин-красителя окрашивание раствора. Подготовка 1X решение BB от 5X акции (имеется в продаже, см. реагенты). Для каждого набора из четырех труб, подготовить 1,2 мл 1X BB.
- Добавить 200 мкл 1X BB к клетке гранулы, ресуспендирования и инкубировать 30 минут при 25 ° C.
- Стрептавидин-сопряженных красителя используется для обнаружения биотинилированного зондов МШУ. Хотя блокирование, приготовить раствор из 2 мкг / мл DyLight 488 стрептавидин или желаемый красителя стрептавидин сопряжены в 1X BB в течение 30 мин (для трех образцов, составит 300 мкл).
- После incubation с 1X BB, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Добавить 50 мкл стрептавидином раствор красителя к клетке гранулы, тщательно перемешать и выдержать в течение 12 минут при 25 ° С при постоянном перемешивании на вихрь или в thermomixer. Для контроля «нет красителей, добавить 50 мкл 1X блокирующего буфера только. Для остальной части протокола, защита труб от света использованием алюминиевой фольги.
- Вымойте клетки сразу с 500 мкл буфера 0.1X SSCT и один раз с 400 мкл 1X PBS с 0,1% Твин-20 (PBST). Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант.
- После первоначального стрептавидин-сопряженных окрашивания, сигнал усиливается путем введения биотинилированного анти-стрептавидин антитела к стрептавидин-конъюгированных с красителем, а затем окрашивание второй раз с стрептавидином красителя таким образом увеличивая выходной сигнал в гибридизированных МШУ зонда (рис. 2) .
- Добавить 100 мкл 1 мкг / мл биотинилированного анти-стрептавидин антител в 1X PBS, resuspenг клеток, и инкубировать при температуре 25 ° С в течение 30 минут с редкими смешивания. Гранул клеток (7К, 2 мин), удалите супернатант и мыть два раза с 400 мкл 1X PBST.
- Добавить 50 мкл 2 мкг / мл стрептавидином раствор красителя в клетки, тщательно перемешать и выдержать в течение 12 минут при 25 ° С при постоянном перемешивании на вихрь или в thermomixer. Для контроля «нет красителей, добавить 50 мкл 1X блокирующего буфера только.
- Вымойте клетки сразу с 500 мкл буфера 0.1X SSCT и один раз с 400 мкл 1X PBST.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл 1X PBST и храните при температуре 4 ° С до готовности для анализа потока цитометрии. Для небольших бактериальных клеток набор скорости потока, чтобы замедлить снижение основных размеров. Кроме того, для потока цитометров с порога вперед отключений разброс, отсечка должен быть установлен как можно ниже, чтобы обеспечить небольшой бактериальной клетки обнаружены.
- Для DyLight 488 обнаружения, Проточный цитометр должен быть оснащен 488 нм лазером и стандарт излученияфильтры для FITC. По крайней мере, 2x10 4 мероприятия должны быть собраны. Для совместимости с потоком цитометров оснащены различными лазерами, другие стрептавидин-сопряженных флуорофоров могут быть использованы для этого протокола.
8. Представитель результаты
Например клеток, которые являются фиксированными и проницаемыми эффективно представлена на точку проточной цитометрии участок на рисунке 3А. При использовании описанных выше условиях для пермеабилизации, клеточной популяции небольшой и однородной указывает несколько агрегатов клеток. Когда выше (5 мг / мл) концентрации лизоцима используются, клетки более склонны к агрегации и показывают увеличение разброса значений вперед, что свидетельствует о более крупных частиц (рис. 3В). Пример проточной цитометрии данные из успешных МШУ поток-FISH эксперимента приведена на рисунке 4. Гистограмма показывает, специфической детекции целевых р-РНК вместе с тремя отрицательными элементами управления."Нет красителя" отрицательного контроля производит мере флуоресценции, а затем «нет МШУ» и «не-р-РНК выразил« отрицательного контроля. Наконец, образец с р-РНК конкретных МШУ зонд производит наибольшее флуоресценции. Как только метод и LNA зондов проверяются таким образом, дополнительные эксперименты могут быть разработаны для отслеживания изменений в сигнале р-РНК с течением времени, в ответ на мутации или разнообразных условиях культуры и т.д.
Рисунок 1. Изображение общая схема потока МШУ-FISH эксперимент для выявления бактериальных Срна.
Рисунок 2. Окрашивание и усиления МШУ поток-FISH сигнала. а) Гибридизация биотинилированного зонд МШУ. б) Окрашивание с люминесцентными DyLight 488 сопряженное стрептавидином. в) Связывание биотинилированного анти-х годовtreptavidin антитела к DyLight 488 стрептавидин. Антитела могут связываться стрептавидин через свои антиген-связывающий участок или могут быть связаны стрептавидин через биотин остатков. г) Усиление сигнала дальнейшего окрашивания флуоресцентным DyLight 488 сопряженное стрептавидином.
Рисунок 3. Проточная цитометрия точка делянок вперед по сравнению с боковой разброс результатов) 1 мг / мл лизоцима, 3 мкг / мл протеиназы К пермеабилизации и б) 5 мг / мл лизоцима, 3 мкг / мл протеиназы К пермеабилизации.
Рисунок 4. Гистограмма анализ потока МШУ-FISH результаты. Флуоресцентный сигнал, генерируемый из каждого образца показывает четыре следы: черный - р-РНК конкретных МШУ зонд; красный - отрицательный контроль "не выразил р-РНК; синий - отрицательный контроль" нет МШУ; фиолетовый -Отрицательное "нет красителя« контроль.
Discussion
МШУ поток-FISH метод, представленный здесь был использован для обнаружения выражение р-РНК из грамотрицательные бактерии Vibrio морских campbellii экспрессии которых ранее было подтверждено с помощью микрочипов основе профилирования экспрессии и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции 16. На сегодняшний день мы использовали этот метод для контроля экспрессии различных РНК (например, транс-закодированных Срна, р-РНК, которые модулируют активность белка, riboswitches, и мРНК). Таким образом, мы уверены, что метод является гибкой и может быть использован для обнаружения любых р-РНК, или мРНК цели и могут быть модифицированы для использования в любых видов бактерий или типа клеток. Если модификации этого протокола необходимо для других типов клеток, наиболее важной переменной для рассмотрения манипулирования является пермеабилизации шаг. Например, при изменении пермеабилизации условиях, описанных здесь, изменения в концентрации лизоцима и протеиназы К должны быть проверены. Мы обнаружили, что удвоение илиутроить количество лизоцима и протеиназы К привело к существенным изменениям в потоке МШУ-FISH результаты. Кроме того, при проверке дополнительных условий пермеабилизации, клетки должны быть проанализированы на слипания, потерю клеток, а также получить лучший сигнал фоновой флуоресценции отношение. Степени клеточной слипания могут быть проверены на микроскопией и / или проточной цитометрии. По проточной цитометрии, сотовые сгустки присутствуют в виде хвостов вперед по сравнению стороне диаграммы разброса точек и правильного метода пермеабилизации позволит свести к минимуму это воздействие хвостохранилища. Этот метод также поддается мультиплекс р-РНК обнаружения без существенных изменений в протоколе описаны как дополнительные зонды МШУ помечены других гаптенов, таких как дигоксигенин могут быть добавлены в процессе гибридизации шаг, а затем обнаружить анти-дигоксигенин антитела и вторичные антитела флуорофора сопряжены. В настоящее время единственным ограничением, что мы столкнулись с помощью этого метода является его неспособность генерировать достаточный сигнал от слабо бывшихнажата р-РНК видов и предпринимаются усилия, чтобы определить порог обнаружения (в абсолютных числа копий на клетку).
В целом, МШУ поток-FISH метод дает возможность измерять бактериальной или р-РНК экспрессию мРНК на одном уровне ячейки в высокой пропускной образом, чтобы дать представление о присутствии и относительное обилие видов Срна и степень, в которой ее выражения меняется в популяции.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Управлением военно-морских исследований ВМС США с помощью средств научно-исследовательской лаборатории ядра.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems | AM9625 | |
| Nuclease-free water | Applied Biosystems | AM9932 | (not DEPC treated) |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
| Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L2879 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems | AM2546 | |
| Formamide | Applied Biosystems | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
| Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma-Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
| Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
| Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems | AM9770 | |
| Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems | AM9680 | Aliquot and freeze |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies | 15401-011 | Aliquot and freeze |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
| DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
| Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |
References
- Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).
- Lansdorp, P. M. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).
- Pernthaler, A., Amann, R. Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).
- Jen, C. J. Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).
- Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH. RNA. 16, 1679-1685 (2010).
- Friedrich, U., Lenke, J. Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11, 1745-1748 (2005).
- Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers. Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).
- Obika, S. Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering. Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).
- Koshkin, A. A. LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).
- Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).
- Robertson, K. L., Thach, D. C. LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes. Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).
- Waters, L., Storz, G.
- Petersen, M., Wengel, J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).
- Corput, M. P. C. vd, Grosveld, F. G. Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells. Methods. 25, 111-118 (2001).
- Silveira, A. C. G. Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios. Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).
