Den metabolomic profil<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Bestäms efter tillväxt i buljongkulturer. Förhållanden kan varieras för att testa effekterna av näringstillskott, oxidanter, och anti-tuberkulos medel på den metaboliska profilen för denna mikroorganism. Förfarande för extrakt förberedelse gäller både 1D<sup> 1</sup> H och 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C NMR-analyser.
Mycobacterium tuberculosis är en viktig orsak till dödsfall hos människor på en global skala. Framväxten av både multi-(MDR) och i stor utsträckning-(XDR) läkemedelsresistenta stammar hotar att spåra ur nuvarande insatser för sjukdomsbekämpning. Således finns det ett akut behov av att utveckla läkemedel och vacciner som är mer effektiva än de som för närvarande finns tillgängliga. Genomet av M. tuberkulos har varit känt i mer än 10 år, men det finns stora luckor i vår kunskap om geners funktion och essentiala. Många studier har sedan använt analys genuttryck på både transcriptomic och proteomik nivåer för att bestämma effekterna av droger, oxidanter och villkor tillväxt på den globala mönster av genuttryck. Ytterst är det slutliga svaret hos dessa förändringar avspeglas i den metaboliska sammansättningen av bakterien inklusive några tusen små molekylvikt kemikalier. Jämföra de metaboliska profilerna för vildtyp och mutanta stammar, antingen obehandlade eller treated med ett särskilt läkemedel, kan effektivt tillåta mål identifiering och kan leda till utveckling av nya inhibitorer med anti-tuberkulos aktivitet. Likaså, kan effekterna av två eller flera förhållanden på Metabolome också bedömas. Kärnmagnetisk resonans (NMR) är en kraftfull teknik som används för att identifiera och kvantifiera metaboliska intermediärer. I detta protokoll förfaranden för framställning av M. tuberkulos cellextrakt för NMR metabolomic analys beskrivs. Cellkulturer odlas under lämpliga förhållanden och som krävs biosäkerhetsnivå 3 inneslutning, skördade 1, och utsattes för mekanisk lys samtidigt kyla för att maximera bevarandet av metaboliter. Cellysaten återvinns, filtreras steriliserades och lagrades vid extremt låga temperaturer. Alikvoter från dessa cellextrakt stryks ut på Middlebrook 7H9 agar för kolonibildande enheter för att kontrollera frånvaron av viabla celler. Vid två månaders inkubation vid 37 ° C, om inget VIsom kan kolonier observeras, prover ur inneslutningen anläggning för efterföljande bearbetning. Extrakten lyofiliseras, återsuspenderas i deutererad buffert och injicerades i NMR-instrument, fånga spektroskopiska data som sedan utsätts för statistisk analys. De beskrivna förfarandena kan tillämpas för både endimensionella (1D) 1 H-NMR och tvådimensionella (2D) 1 H-13 C-NMR-analyser. Denna metod ger mer tillförlitlig liten molekylvikt metabolit identifiering och mer tillförlitliga och känsliga kvantitativa analyser av metabola cellextrakt kompositioner än kromatografiska metoder. Variationer av den procedur som beskrivits efter cellys steget kan också anpassas för parallell proteomic analys.
Ett stort antal studier har analyserat transcriptomic och proteomik profiler M. tuberkulos under ett flertal in vitro-och in vivo-betingelser. 11-16 Slutligen, förändringar i genuttryck och enzymaktivitet leda till variationer i koncentrationerna av lågmolekylära molekyler. Den fullständiga beskrivningen av dessa föreningar utgör Metabolome. Således kan effekten av droger och varierande förhållanden tillväxt på metaboliska vägar att följas av metabolomic analys. 17,18</sup…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla medlemmar i laboratorier Dr Barletta och Dr Powers för värdefulla kommentarer och samtidigt utveckla protokollet. Vi tackar Wendy Austin för hjälp diskussioner och korrekturläsning av manuskriptet. Det arbete som beskrivs i detta manuskript har finansierats av bidrag utsäde pilotprojekt till varje utredare ovan från University of Nebraska-Lincoln Redox biologi Center (förälder bidrag # NCRR 2P20RR 017.675, D. Becker, PI). Dessutom tackar vi Dr Ofelia Chacon för att ge pengar från hennes R21 bidrag (1R21AI087561-01A1) för forskning leveranser och Mr Halouska partiella lön stöd för att standardisera NMR-tekniker som ingår i denna publikation.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |