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Summary
mechanosensory毛细胞是内耳的受体细胞。最好的特点
Abstract
听力损失和平衡紊乱往往造成mechanosensory毛细胞是内耳的受体细胞死亡。由于没有细胞行圆满代表了哺乳动物的毛细胞，毛细胞的研究依赖于基层机关文化。最好具有成熟的哺乳动物毛细胞在体外模型系统，利用从成年鼠（ 图1）1-6椭圆囊器官培养。囊是前庭器官，以及椭圆囊毛细胞的听觉器官，Corti器毛细胞结构和功能相似。成年小鼠的囊准备成熟的感觉上皮细胞的生存，动态平衡，这些细胞死亡的分子信号调节的研究。
哺乳动物耳蜗毛细胞的终末分化，当他们失去了，不能再生。在非-MAM其次是强大的再生，恢复听力和平衡功能7，8，马里脊椎动物，听觉或前庭毛细胞死亡。再生毛细胞介导的胶质状的支持细胞，毛细胞的基底表面的接触中感觉上皮9，10。支持细胞是重要的调停毛细胞生存和死亡的11。我们最近开发出一种技术，支持在使用培养椭圆囊腺病毒的细胞感染。利用腺病毒5型（dE1/E3）提供含有CMV启动子控制下的绿色荧光蛋白的转基因，我们发现，腺病毒特别有效地支持细胞的感染。支持细胞的感染效率约为25-50％，并没有感染毛细胞（ 图2）。重要的是，我们发现，不支持细胞的腺病毒感染导致毛细胞或支持细胞的毒性，因为在AD-GFP INF细胞计数ected椭圆囊相当于在非疫区的椭圆囊（ 图3）。因此，在支持细胞培养椭圆囊腺病毒介导的基因表达提供了一个功能强大的工具，研究支持细胞作为调解人毛细胞生存，死亡和再生的作用。
Protocol
1。囊解剖和文化
- 安乐死的成年人（4周龄以上）鼠标使用批准的协议和斩首。
- 剪掉头部两侧外耳道，并向前拉往鼻子的皮肤。开张头从后到前，消除双方的大脑揭示骨迷路。
- 远离骨耳蜗和修剪颅骨骨迷路（包括泡）转移到组织文化引擎盖配备在解剖显微镜（注：腺病毒的工作应在II级生物安全柜中进行）。
- 在引擎盖，每个耳蜗转移到一个35mm的组织培养皿含无菌夹层动脉瘤媒体（M199，GIBCO / Invitrogen公司＃12350）（ 图1A）。
- 如果听泡仍然完好无损（这是可能的总清扫过程中消除的大疱，大疱和的顶点之间插入缩略图耳蜗），用两个镊子（一＃3和一个＃5）打破泡（ 图1B）。
- 确定了骨耳蜗准备的标志：顶点，基地，听小骨，椭圆形和圆形的窗户，VIIIth神经根，半规管（ 图1中的C，D）。
- 内侧的一面朝上，这样，椭圆形和圆形的窗户和APEX的菜和VIIIth的神经根底部朝上放置在盘子的内耳。 ＃3钳使用中的半规管（ 图1D）地区举行的筹备。
- 使用手术刀配备＃11刀片，切断耳蜗的顶点正好顶到神经根（ 图1D）。
- 关闭的准备，使切割部分朝上。作为手柄使用的前半规管，以稳定的准备（ 图1E）。
- 使用＃5镊子，取出耳蜗的蜗轴下来该基地。在耳蜗钩地区变为向下的地步，使用细探针（一半断了＃55钳）解除骨骨螺旋叶片（ 图1F）最后货架，揭示了球囊。下方的球囊是镫骨足板，这是一个重要的里程碑。囊是紧邻的镫骨足板（ 图1G），它是由骨包围。使用探针芯片骨远足以显示，约1/3的囊。小心取出囊使用＃55钳（ 图1H）。此过程通常会导致去除色素屋顶上皮的囊骨的准备拉。但是，如果囊被拆除屋顶上皮完整，屋顶可以使用＃55钳去除。
- 椭圆囊腺病毒感染（或实时成像实验）必须有夹层（感染前）拆除期间的耳石。在这种情况下，用鲁尔锁注射器，充满了解剖媒体和装有一个小口径的针（通常是26-28计）。持有，使用＃55钳（ 图1I）的边缘囊。使针尖接近囊针斜面朝下。用解剖媒体吹掉耳石（ 图1J）的流。另外，耳石可以去除刷牙他们使用睫毛工具（特德·佩拉，公司＃113）。椭圆囊，都不会接受腺病毒感染通常是在24孔组织培养板中培养的自由浮动的耳石完整（修复后耳石去除，这是比较容易见下文）。
- 一旦所有的椭圆囊解剖，解剖媒体无菌培养基：DMEM培养基F12（Gibco公司＃11320）补充5％FBS和50 U / ml的青霉素G（Sigma公司）。
- 在37°C和5％CO 2培养椭圆囊。如果文化是mainta独立非执行董事为超过48小时，一半的培养基应改为隔日。文化可以维持一个星期或更长的时间。
2。支持细胞的腺病毒感染
重要的是：工作与腺病毒需要生物安全等级2（BSL2）的程序和认证。与你的机构的生物安全主任检查的BSL2程序上的指导和培训。
- 解剖椭圆囊如上在夹层媒体（无血清）。如上取出耳石。
- 当准备感染，1囊（毛细胞）转移到每个井1 NUNC迷你托盘（费舍尔＃12-565-68）含有15μL 无血清培养液F12（这是很重要的，因为血清灭活病毒） 。这种转移是容易与1.5毫米microcurette的（＃10082-15从精细的科学工具）。
- 我们的AD-GFP是5型与删除病毒E1和E3基因和人类CMV启动子驱动transg烯（GFP）。这种病毒取自，矢量BioLabs公司（费城，PA的vectorbiolabs.com ）。股票病毒滴度在1.0-4.0×10 10 PFU / ml的。新增0.5-2股价病毒液，每口井含有囊（ 图1L）。实际使用的金额不等，取决于病毒和股票滴度。我们通常感染1.0-4.0×10 7 PFU每个囊。
- 文化中的椭圆囊病毒的媒体在37°C / 5％CO 2小时2。 2小时后，转移的椭圆囊含血清培养基的24孔培养板。文化的椭圆囊在37°C / 5％CO 2过夜。
- 可第二天椭圆囊实时成像实验，他们可以为毛细胞的免疫组织化学固定（见下文）。病毒基因表达增加，随着时间的推移，因此，如果转基因表达低，在感染后24小时有利于培养细胞在含血清媒体一个额外的24小时。如果你看到毛细胞毒性，减少使用量的病毒。
3。囊固定，耳石去除，免疫组织化学
- 在培养周期结束，固定在4％多聚甲醛的椭圆囊（在摇椅平台）是3小时室温或4℃过夜洗椭圆囊（3次，每次15 min）0.1米（1X）索伦森的磷酸盐缓冲液pH值7.4。 24孔培养板中执行这些步骤。
- 耳石清除： 注：耳石腺病毒感染前必须拆除（见上面的步骤1.11）。然而，是不是被感染的椭圆囊，可以培养和固定与耳石仍完好无损。在这种情况下，使用这里描述的步骤去除固定后的耳石。检查任何剩余的色素屋顶上皮椭圆囊。小心取出任何剩余的屋顶上皮使用两个＃55 Forceps。要删除的耳石，取代索伦森的磷酸盐缓冲750-1000微升的Cal-，前decalcifier（费舍尔＃CS510-1D）。离开椭圆囊加州防爆为1分40秒（不超过2分钟）。取代0.1米索伦森的磷酸盐缓冲液洗（5次，每次5 min）CAL-EX。
- 孵育10分钟的椭圆囊在硼氢化钠（西格玛＃452882，去离子水的1％）。在0.1米索伦森的磷酸盐缓冲液（5次，每次5 min）洗椭圆囊。
- 椭圆囊封锁的解决方案的地方（PBS + 2％牛血清白蛋白+ 0.8％正常山羊血清+ 0.4％的Triton X-100）在室温下为3小时摇椅平台上。
- 新增主要抗体孵育过夜4°C。抗肌球蛋白7A（要么变形虫Biosciences公司25-6790＃或＃MYO7A发展研究杂交瘤细胞银行138-1）1:100封闭液标签所有的毛细胞。分别标注striolar和非striolar的毛细胞，我们已经使用双标签protocol与单克隆抗钙调素（西格玛＃C 3545; 1:150）和抗钙结合蛋白（Chemicon公司＃AB1778，特曼库拉，美国加利福尼亚州; 1:200）。 （通常的Alexa Fluor从Invitrogen公司，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州的共轭抗体）二级抗体封闭液1:500稀释，并在室温摇椅平台上4个小时在黑暗中培养。
- 山椭圆囊上使用Fluoromount-G的（南方生物技术，伯明翰，AL，美国）的玻璃幻灯片。
4。代表结果
使用这种方法保留完整的椭圆囊培养补充的毛细胞和支持细胞（ 图2）。健康文化的毛细胞，四周薄，肌球蛋白7A阳性细胞质地区的全面核型材（ 图2，顶部面板）。支持细胞（反SOX2标记）是较小的和较稠密的毛细胞（ 图 2，下部面板）的包装。阿德novirus感染囊支持细胞的25-50％，无毛细胞被感染（ 图2，AD-GFP板）。应当指出，每个腺病毒滴度的最佳工作必须凭经验确定，因为毛细胞死亡是可能的，如果病毒滴度过高。此外，机械损伤（期间造成的夹层）的地区，将占用大量的病毒。这些地区的机械损伤的细胞GFP的表达和缺失的毛细胞非常高的水平不断线很容易区分。相反，这是一个完好的文化支持细胞（ 图2）分散的绿色荧光蛋白表达。
图1。囊解剖。答：听泡。（AB）乙：使用两个坚固的镊子，泡坏了：骨耳蜗（RW =圆窗，下=镫骨动脉，耳蜗，ST =镫骨）D：手术刀刀片（SB），用来切断的VIIIth颅神经（8 日 N）的升序=前半规管 é耳蜗的顶端的顶点。用一把叉子插入前半规管（ASC）和最外层骨（箭头）＃3钳牢牢准备。使用镊子去除膜迷路楼：删除膜迷路，骨螺旋叶片的基础又是附近的钩地区可见。罚款探针插入下面这骨货架解除货架和删除（箭头）G：拆除后的球囊，椭圆囊（U）是立即可见相邻的镫骨足板（SF）的H：椭圆囊（美）被删除＃55钳（箭头）SF =镫踏板 我：。椭圆囊耳石（O）的部分删除记者：耳石（海外），D感觉上皮（SE）可见下从囊的使用装用26号针头注射器提供的流媒体。针（）的影子是在图像的底部可见K：椭圆囊耳石删除和感觉上皮（SE）可见L：腺病毒感染与每个囊（U）是放置在一个小型的个人托盘。支持细胞吹打成井（P值吸取尖）病毒与腺病毒感染。
图2。推动绿色荧光蛋白表达的腺病毒（AD-GFP）感染腺病毒介导的支持细胞的感染。椭圆囊。所示的毛细胞层和支持细胞层在同一地区的一个囊的共聚焦图像。毛细胞标记抗体对肌球蛋白7A（洋红色）。支持细胞标记抗体对SOX2（红色）。示意图显示囊感觉上皮细胞和毛细胞的位置（HC）和支持细胞（SC）的结构。聚焦（光）在上（U）和较低的显示部分的位置（L），板在原理图中虚线表示。上面板：在水平头发细胞核采取的共聚焦图像，AD-GFP信号出现在毛细胞之间的空隙，不重叠的毛细胞标记肌球蛋白7A。较低的面板：聚焦部分在支持细胞核的水平，AD-GFP信号与支持细胞标记SOX-2共定位。 AD-GFP感染的结果，在GFP的表达仅在支持细胞，无毛细胞被感染。
图3。腺病毒感染不会导致 UT 毛细胞或支持细胞的死亡。在4×10 8 PFU / ml的AD-GFP感染ricles。椭圆囊标记与抗肌球蛋白7A（毛细胞标记）和Sox2（支持细胞标记）抗体。控制椭圆囊和AD-GFP感染的椭圆囊毛细胞和支持细胞计数平等。
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Discussion
感觉毛细胞受到的各种压力，包括老龄化，噪声外伤，和接触，包括氨基糖甙类抗生素和抗癌药顺铂的耳毒性药物引起的死亡。在哺乳动物毛细胞，导致永久性听力丧失和/或平衡紊乱导致死亡。 在体外模型系统研究旨在确定的细胞和分子机制的毛细胞死亡，以及那些旨在防止或扭转毛细胞死亡的关键工具。不同于成年哺乳动物耳蜗毛细胞，毛细胞的囊良好的生存文化。囊毛细胞是敏感的死亡从接触到同样的治疗药物是有毒的耳蜗毛细胞，和潜在的耳毒性的毛细胞死亡和生存12-18椭圆囊和耳蜗毛细胞相似的细胞机制。此外，当囊模型系统中获得的数据是TE囊准备STED 在体内，已被证明是成熟的耳蜗12，18日至21日在毛细胞的生存和死亡的一个可靠的预测。鼠标囊准备，也让我们研究利用转基因和基因敲除动物的椭圆囊的特定蛋白质的影响。
调解压力下的感觉毛细胞的生存和死亡的信号却知之甚少。然而，新的证据表明，在内耳的其他类型的细胞可能扮演重要的角色，在决定是否在压力下的毛细胞最终是死是活11，22，23。囊模型系统可用于研究这些关键在一个成熟的哺乳动物的感觉上皮细胞与细胞的相互作用。腺病毒感染提供了一个支持细胞中的基因表达改变的方法，从而有利于支持毛细胞的生存，死亡，吞噬，再生细胞的作用（S）的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家耳聋与其他交流障碍研究所院内研究司。 NIDCD的5R01 DC007613提供了额外的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 12350 | |
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11320 | |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc mini-tray | Fisher Scientific | 12-565-68 | |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* | |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher Scientific | CS510-1D | |
| sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 | |
| Anti-Calmodulin | Sigma-Aldrich | C 3545 | |
| Anti-Calbindin | Chemicon International | AB1778 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection | |||
| * Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml. | |||
References
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神经科学杂志，61期，毛细胞，耳，听力丧失，器官培养Erratum
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 04/17/2012.
Citeable Link.
A correction was made to Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. The incorrect version of figure 2 was published, the middle initials of the authors were omitted, and the acknowledgements were updated.
Figure 2. Adenovirus-mediated infection of supporting cells was corrected to include a schematic showing the structure of the utricle sensory epithelium. The incorrect figure was inadvertently published. This error does not change the scientific conclusions of the article in any way. The editors apologize for this error.
The acknowledgements were updated to:
The authors are grateful to Dr. Shimon P. Francis for generating the confocal micrographs.
This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.
From:
This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.
The authors were updated to:
Carlene S. Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey A. May, Lisa L. Cunningham
From:
Carlene Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey May, Lisa Cunningham
