Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å visualisere dannelsen av en HIV-1 konvolutt-indusert virologisk synapse på glass støttes planar bilayers av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Metoden kan også kombineres med immunfluorescens farging for å påvise aktivering og omfordeling av signalmolekyler som oppstår under HIV-1 konvolutt-indusert virologiske synapse formasjon.
Abstract
Humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) infeksjon skjer mest effektivt via celle til celle overføring 2,10,11. Dette celle til celle overføring mellom CD4 + T celler innebærer dannelsen av en virologiske synapse (VS), som er en F-aktin-avhengig celle-celle krysset dannet på engasjement av HIV-1 konvolutt gp120 på den infiserte cellen med CD4 og den chemokine reseptor (CKR) CCR5 eller CXCR4 på målcellen 8. I tillegg til gp120 og dets reseptorer, andre membran proteiner, særlig adhesjonsmolekylet LFA-1 og dens ligander, den ICAM familien, spille en viktig rolle i VS formasjon og virus overføring som de er til stede på overflaten av virusinfiserte donor cellene og målceller, samt på konvolutten av HIV-1 virioner 1,4,5,6,7,13. VS formasjonen er også ledsaget av intracellulære signalmolekyler hendelser som transduced som et resultat av gp120-engasjement av sine reseptorer. Faktisk har vi nylig viste at CD4 <sup> + T celle interaksjon med gp120 induserer rekruttering og fosforylering av signalmolekyler forbundet med TCR signalosome inkludert LCK, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, og PLCγ 15.
I denne artikkelen presenterer vi en metode for å visualisere supramolecular arrangement og membran-proksimale Signalanlegg hendelser som finner sted i løpet av VS formasjon. Vi tar nytte av glass-støttet planar bi-lags system som en reduksjonistisk modell for å representere overflaten av HIV-infiserte celler som bærer viruskapselen gp120 og cellenivå adhesjonsmolekyl ICAM-1. Protokollen beskriver generelle prosedyrer for overvåking HIV-1 gp120-indusert VS montering og signal aktivering hendelser som inkluderer jeg) bi-lag forberedelse og sammenstilling i en flyt celle, ii) injeksjon av celler og immunfluorescens farging for å påvise intracellulære signalmolekyler på celler i samspill med HIV-1 gp120 og ICAM-1 på bi-lag, iii) image oppkjøpet av TIRF mikroskopi, ennd iv) data analyse. Dette systemet genererer høyoppløselige bilder av VS grensesnitt utover det som oppnås med konvensjonell celle-celle system som gjør det mulig påvisning av forskjellige klynger av individuelle molekylære komponenter av VS sammen med bestemte signalmolekyler rekrutteres til disse sub-domener.
Protocol
1. Merking gp120
Fluorescerende fargestoffer som brukes i denne protokollen er effektive for å binde seg til proteiner, er tilstrekkelig foto-stabil for mikroskopi bildebehandling, og matche eksitasjonsbølgelengdene av lasere tilgjengelige med mikroskop vår. Disse tre kriteriene må være oppfylt ved valg av fluorescerende molekyler for tagging proteiner.
- Utveksling Hans 6-tagget gp120 DH12 (en gave fra Dr. Michael Cho, Iowa State University) protein buffer til sterilt PBS med en sentrifugal filter enhet (30 kDa MWCO). Pass gp120 konsentrasjonen er ikke mer enn 1 mg / ml. Note: Hans 6-tagget gp120 proteiner fra andre X4 eller R5 tropiske stammer har også blitt testet og er nå tilgjengelig kommersielt fra Immune Technologies.
- Legg natriumbikarbonat pH 9,0 til protein løsning å få 50mm endelig konsentrasjon av natrium bikarbonat med ~ pH 8,5.
- Legg amin reaktiv Alexa Fluor 488 (AF488) fluorescerende fargestoff, som er dissolved i vann ved en 10-fold molar overflødig. Inkuber denne blandingen i 1-2 timer ved romtemperatur i mørket.
- For å fjerne overflødig fargestoff, bruke sentrifugalfilter enhet som før og legge frisk sterilt PBS til kolonnen. Gjenta dette trinnet til alle gratis fargestoff er fjernet (3-4 vasker med 4 ml PBS). Spinn ned til gp120 er konsentrert til ca 1 mg / ml. Merk: Fjerning av gratis fargestoff ved dialyse eller sentrifugalfilter enhet fungerer bare hvis fargestoffet er vannløselige, ellers gel filtrering kan brukes.
- For å måle fluorescensintensiteten per molekyl av protein (F / P) av merket protein, bestemme konsentrasjonene (i mm) av fluorescerende fargestoff på riktig bølgelengde (for eksempel ved 488 nm for AlexaFluor 488) og protein (vi bruker en NanoDrop spektrofotometer ved å bruke 'proteiner og etikettene innstilling) og deretter dele disse to tallene som gir deg F / P forholdet. Samme fremgangsmåte brukes til andre proteiner og fargestoffer som ICAM-1 og Cy5. NB: Andre typer spectrophotometers kan brukes til å hente protein konsentrasjon og fluorescerende fargestoff konsentrasjon for å oppnå F / P forholdet dersom en NanoDrop er ikke tilgjengelig.
2. Flow Cell Montering og bilayer Forberedelse
Den generelle prosedyren for flowcelle og bilayer Preparatet er beskrevet i detalj tidligere 14. Her skisserer vi spesielt protokollen til å forberede bilayers inneholder hans 6-tagget gp120 DH12 på en Bioptech strømningscellen. For studier med smittsomme virus eller infiserte celler og når små volumer er nødvendig på grunn av begrensede reagenser, en engangs Ibidi flyt kammeret (klebrig Slide jeg 0,2 Luer) kan brukes og følges med samme bi-lag forberedelse prosedyre i Steps 2.4-2.9. Informasjon for Ibidi flyt kamre kan fås fra selskapets hjemmeside, http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf
- Forbered Pirhana løsning (45 ml svovelsyre (Trace Metal Grade 98%) og 15 ml 30% hydrogen peroxide) 14. Med plast klemmer, glipper fordype dekselet i Pirhana løsningen i 15 minutter.
- Overføring dekker slips til et beger fylt med pica-renset vann og vaske hver under rennende vann i 2 min (ett minutt på hver side). Plasser på stativ til tørk.
- Monter Bioptechs FCSII kamre som tidligere beskrevet 14.
- En liposome blanding som inneholder 12,5% Ni 2 + chelaterande lipider brukes for å fange og presentere hans 6-gp120 på bilayer overflaten 16. Tilsett 1 mL dråper liposome blandingen over microaqueduct lysbilde uten å berøre tuppen på glasset. For å forberede maksimalt 5 bilayers per strømningscellen, gjenta opptil 4 ganger slik at det er fem 1μl prikker som vist tidligere 14.
- Plasser dekkglass på toppen av lipider. Dekk den hvite låseringen med en rustfritt stål clamp baseenheten, snu hele apparatet over og forsegle. Merk plasseringen av bilayers med en markør. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Fest slangen med to-veis stoppekran til venstre perfusjon rør, som vist i videoen. Generere en positiv menisken i slutten av slangen med 3-veis stoppekran på det (tubing tidligere har vært fylt med HEPES-saltløsning (HBS) inneholder humant serum albumin (HSA) (HBS / HSA: 50 ml 10x HBS [10x HEPES saltløsning: 200 mm HEPES, 7,2 pH, 1,37 M NaCl, 50 mM KCl, 7 mm Na 2 HPO 4, 60 mm D-glukose] 20 ml 25x HSA, 500 mL 1M CaCl 2, 1 ml 1 M MgCl 2 og dH 2 0 å bringe et totalt volum til 500ml og filter med 0.22μm filter) og er blottet for bobler. Koble slangen til høyre perfusjon rør og skyv buffer gjennom strømningscellen.
- Blokker bilayer med ~ 300 mL av kasein inneholder 100 mM NiCl 2 ved å fylle 1 ml sprøyte og feste til den åpne delen av 3-veis stoppekran. Gently presse buffer gjennom og lukke begge stoppekraner før frakopling av sprøyten. Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
- Legg Hans 6-merket AF488-merket gp120 (konsentrasjonen bestemmes som beskrevet tidligere i 16). Vi bruker ~~~HEAD=NNS 250 molekyler av gp120/μm 2 for å etterligne den lokale tettheten av konv klynger funnet på HIV-1 virion overflate 17. Tilsvarende bruker vi ~~~HEAD=NNS 250 molekyler / mikrometer 2 av ICAM-1 på bilayer som tidligere rapportert 14. Legge inn strømningscellen som gjøres med kasein. Inkuber i 30 min i mørket (dekk med folie) ved romtemperatur. Samme fremgangsmåte brukes til å innlemme andre proteiner som hans 12-merket Cy5-merket ICAM-1 på bilayer.
- Vask bilayers med 5 ml buffer.
3. Kvalitetskontroll av bilayers via FRAP
Proteiner i bilayers må være sideveis diffusible. Før du legger celler på bilayers, er det viktig å sikremobilitet av proteiner i den preparerte bilayer. Her beskriver vi en fluoriserende Recovery Etter photobleaching (FRAP) metoden tre som kan utføres manuelt på de fleste objektiv opplyst TIRF, bredt felt epifluorescence, eller laser skanning confocal mikroskoper. Målet er å avbilde fullt ensartede felt av fluorescens i lipid bilayer, blekemiddel et sted, og for å overvåke avkastningen av unquenched molekyler til bleket området. En gjenvinning av 50% i 2 minutter kan være akseptabelt. Alle de store produsentene mikroskop (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) selge saklig opplyste TIRF systemer som fungerer godt for denne applikasjonen. Mens hver Selskapet tilbyr varianter av TIRF belysning og andre operasjonelle funksjoner, er bildekvaliteten i hovedsak de samme.
- Bruk en lav eksitasjon intensitet for å minimere bleking. Bruk en høy numerisk apertur objektiv som en NA 1,3 til 1,45 40x, 60x eller 100x. Når du bruker en standard lysstoffrør eller TIRF mikroskop, for å redusere lyset intensligheten, satte nøytral tetthet filter i eksitasjon lys banen. De fleste laser systemer kan være satt for lavt belysning ved å sette en acusto optisk tunbare filter (AOTF) eller acusto optisk stråle splitter (AOBS) med lav spenning.
- Spill inn en "pre-blekemiddel" image. Hvis du bruker et avkjølt CCD kamera, for å kompensere for dårlige lysforhold Binning kan settes til 2x2 eller 4x4, kan gevinsten settes høye, eller lang eksponering (for eksempel i størrelsesorden sekunder) kan benyttes. Hvis du bruker en confocal kan pinhole blenderåpningen bli åpnet; gevinsten satt høyt, og langsom skanning eller gjennomsnitt brukt.
- Bleach en flekk. Hvis du bruker en standard fluorescens eller TIRF mikroskop, fjerne alle ND filter for å tillate maksimal intensitet belysning, lukke feltet mellomgulvet, og utsetter prøven for noen få sekunder. Hvis du bruker en laser skanning confocal, sette laseren makt maksimale og zoom i ca 4x til 8x å bleke en plass. En advarsel for confocal bruk: ikke zoome inn for høyt fordi bilayer kan bli skadet av altfortasten etter hverandre konsentrert fotoner.
- På ti til femten sekunders intervaller, ta bilder med samme belysning og opptaksinnstillinger som i 3.1 og 3.2. Innen to til tre minutter stedet bør gjenopprette intensitet som nærmer seg den "pre-blekemiddel" image. Rask bedring er tegn på en vellykket mobil bilayer. Dersom flekken fortsatt mørkt, og spesielt hvis den kanten beholder høy kontrast, de fluoriserende proteiner er immobile i bilayer og bør ikke brukes til eksperimentet.
Merk: I vår nåværende mikroskop, kan vi levere 0,9 MW 641 nm lys til en sirkulær plass med et areal på 240 mikrometer 2 som bleker fluorescerende ICAM ved typiske konsentrasjoner i mindre enn 4 sekunder. Leserne bør finne at kritiske innretting av en Hg eller Xe lampe med bleking ganger mindre enn 30 sekunder er mer enn tilstrekkelig til å utføre denne analysen på en repeterbar måte. Vi vil også henvise deg å referere 3 for ytterligere Details.
4. Injeksjon av celler og Immunfluorescens fargeløsninger
- Varm opp strømningscellen til 37 ° C (dette kan gjøres i en 37 ° C inkubator uten CO 2 for ca 30 min).
- Legg aktiverte humane CD4 + T celler (2-5x10 6 / strømningscellen) i HBS / HSA ~ 400 mL av 1 ml sprøyte. La celler feste til bilayer for ~ 45 min i 37 ° C inkubator. Hvis Ibidi kamrene er brukt, gi tilleggsopplysninger buffer hvert 15-20 min.
- Fest cellene ved å injisere 2% paraformaldehyde og inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask 3x med 1ml romtemperatur PBS-buffer. Permeabilize celler ved å injisere 0,1% Triton X-100 for 5 min ved romtemperatur.
- Vask 3x med 1ml av romtemperatur PBS-buffer (når sondering for fosforylert proteiner, kan du legge til natrium vanadate på 1mm endelig konsentrasjon eller annen fosfatase hemmer i PBS for å hindre fosfat fjerning under behandling). Blokker bruker kasein med 5% geit serum for25 minutter ved romtemperatur. Den type dyr serum avhenger sekundære antistoffet.
- Vask 3x med 1 ml av romtemperatur PBS-buffer. Legg primære antistoff i ~ 300 mL buffer / strømningscellen for 30 min - 1 time i romtemperatur. For å oppdage den innledende membran-proksimal aktivering signal, bruker vi antistoffer spesifikke for fosforylert LCK (pLck), total LCK eller Fyn.
- Vask 3x med 1 ml av romtemperatur PBS-buffer. Legg hensiktsmessig fluorescensmerkede sekundært antistoff i buffer som gjøres med primær antistoff. For våre eksperimenter, bruker vi Alexa Fluor 568-merket geit anti-kanin sekundære. Inkuber i 20 min ved romtemperatur. Vask 3x med 1 ml PBS buffer.
- Merk: Det er viktig å ha en kontroll bilayer som er behandlet med bare sekundært antistoff (ingen primær antistoff). Følg trinn 4.1-4.5 og hopper 4,6, fortsett deretter med trinn 4.7. Dette vil bestemme nivået av ikke-spesifikk binding av sekundært antistoff. Alternativt kan man bruke direkte etiketted primære antistoffer.
5. Bilde erverv av TIRF mikroskopi
TIRF mikroskopi gir eksitasjon av fluorescerende signaler begrenset til en 250 nm eller tynnere flyet på glasset underlaget og celle-grensesnitt. Dette garanterer bilde oppkjøpet av kun signaler fra lipid bilayer og fra umiddelbart apposed cellemembraner. Derfor er det bare molekyler ved synapse avbildes. Fordi TIRF bare bilder membranen-proksimale område på bunnen av cellen, vil proteiner som er internaliserte eller videreformidles til dorsal membranen ikke blir oppdaget. Det kan da være viktig å i tillegg få bilder av standard widefield eller konfokalmikroskopi å bestemme opphopning eller distribusjon av proteiner på den synaptiske området i forhold til de andre bindene i cellen.
Alle de store produsentene mikroskop (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) selge saklig opplyste TIRF systemer som fungerer godt for denne application. Mens hver Selskapet tilbyr varianter av TIRF belysning og andre operasjonelle funksjoner, er bildekvaliteten i hovedsak de samme. Hver TIRF mikroskop har sine egne detaljer for operasjon, men følgende generelle regler gjelder for å oppnå høy oppløsning.
- Illumination bør være lav for å unngå bleking.
- Kameraet bør ha en lineær respons.
- Kameraet skal være i stand til bildebehandling et bredt dynamisk område uten metning.
- Alle innstillinger bør settes konstant for kvantitative analyser.
6. Data Analysis
For å studere intracellulære signaler aktivert som en følge av CD4 + T-celle interaksjon med gp120 på VS, er kvantitative analyser av TIRF bilder gjøres for å fastslå hvorvidt intracellulære signalmolekyler som LCK og Fyn blir aktivert og rekruttert til synapse 15. Her beskriver vi en enkel metode som gjelder for de fleste bildeanalyseprogrampakker som ImageJ og Metamorph. Vi har brukt ImageJ, som kjører på Windows, Macintosh og Linux, for vår metode her 12.
I Analyser> Set Målinger kategorien, sjekk boksene for Areal og Mean grå verdi. Når du gjør en region av interesse på bildet som er en polygon eller en frihånd spores lukket form og trenger Analyze> Mål, vil programvaren plassere dataene fra denne målingen i en tabell resultater. Området vil være i antall piksler eller i mikrometer to. Gjennomsnittet er gjennomsnittlig intensitet i vilkårlige enheter. Det må ha bakgrunn intensitet trekkes fra det. Multiplisere gjennomsnittlig minus bakgrunnen etter område returnerer integrerte intensiteten av proteinet i vilkårlige enheter.
- Still målingene til Mean og området.
- Åpne bilder for en eksperimentell betingelse.
- For hver celle, spore og måle regionen av interesse (gjennomsnitt) og spore og måle en region utenfor regionen av interesse (bakgrunn).
- Når du er ferdig med en eksperimentell betingelse, enten kopiere målinger og lim inn i Excel eller andre regneark program eller lagre målingene.
- Tilbake til trinn 6.2 for hver eksperimentell betingelse.
- Når målingene er ferdig, beregne resultatene. Formlene er:
Gjennomsnittlig intensitet = bety - bakgrunn
Integrert intensitet = Gjennomsnittlig intensitet * område
7. Representative Resultater
For å måle aktivisering og rekruttering av de innledende membran-proksimale signalmolekyler LCK og Fyn som et resultat av interaksjon med gp120 på VS, ble primære humane CD4 + T celler introdusert på bilayers bærer gp120 og ICAM-1 15. Celler introdusert til bilayers med bare ICAM-1 fungerte som en kontroll for å definere de basale nivåer av signalering. Spekrete fluorescensintensiteten ble målt innenfor gp120 kontaktområdet for celler på gp120 og ICAM-1 inneholder bilayers og innenfor hele kontaktflaten for celler i samspill med ICAM-1 bilayer. En økning av gjennomsnittlig fluorescensintensitet er et tegn på augmented rekruttering og aktivering av signalsystem molekyl til VS. Dette vil bli ytterligere demonstrert ved en tilsvarende økning i den integrerte fluorescensintensiteten. Hvis derimot, er det ingen endring i den integrerte fluorescensintensiteten, indikerer dette en omfordeling av signalsystem molekyl.
Etter at cellene samhandlet med bilayers inneholder gp120 og ICAM-1, total LCK og pLck (Y394) ble rekruttert til VS grensesnittet og colocalized med gp120 (Fig. 1 og 2). Den gjennomsnittlige intensiteten av total LCK (Fig. 1) var høyere på bilayer inneholder både gp120 og ICAM-1 enn med ICAM-1 alene, men de integrerte intensitetsnivåer (Fig. 1) var lik, noe som tyder på at LCK fordeles tilen sentral klynge ved CD4 + T celle binding til gp120. Imidlertid viste kvantifisering av pLck (Y394) (fig 2) at den gjennomsnittlige intensitet på gp120 og ICAM-1 inneholder bilayers var høyere enn på ICAM-1 alene bilayers, og den integrerte intensiteten var høyere på bilayers med både gp120 og ICAM -1 enn på ICAM-1 alene bilayers. Dette indikerer at mens nivåene av total LCK på grensesnittet ligner på cellene fester seg på gp120 og ICAM-1 og ICAM-1 alene bilayers, gp120 forpliktende økt fosforylering av rester Y394 på LCK aktivering loop. I kontrast, ble Fyn ikke rekruttert til VS (Fig. 3), som mer Fyn var til stede i kontaktområdet av celler på ICAM-1 alene bilayers enn på bilayers inneholder både gp120 og ICAM-1. Derfor konkluderer vi med at LCK, ikke Fyn, er den aktive kinase i HIV-1 gp120-indusert VS.
Tall: Membran-proksimal signalering ved HIV-1 gp120-indusert VS. Bilder fra representative celler pågp120 + ICAM-1 bilayer (toppaneler) og ICAM-1 bilayer (bunn paneler) er vist. Fluorescens intensiteter av de enkelte cellene ble kvantifisert innen manuelt spore områder av cellen fotspor som illustrert ved regionen som er merket med gule linjen i figur 1. Kvantifisering av gjennomsnittlig og integrerte intensiteter oppdages av TIRF mikroskopi presenteres i venstre og høyre grafer, henholdsvis. Totalt 30 til 350 celler ble kvantifisert for hver tilstand. Barer = 5 mikrometer. Data fra en av tre gjentatte forsøk er vist.
Figur 1. CD4 + T celler ble introdusert på bilayers inneholder gp120 og ICAM-1 eller ICAM-1 alene for 45 min og deretter fast og farget for total LCK.
Figur 2. CD4 + T celler ble introdusert på bilayers inneholder gp120 og ICAM-1 eller ICAM-1 alene for 45 min og deretter fast og farget for pLck (Y394).
Figur 3. CD4 + T celler ble introdusert på bilayers inneholder gp120 og ICAM-1 eller ICAM-1 alene for 45 min og deretter fast og farget for total Fyn.
Discussion
Tidligere studier har visualisert VS i celle-celle konjugat-system, men disse studiene ikke gir bilder av høy nok oppløsning til å visualisere supramolecular strukturer på synapse. I vårt laboratorium, benyttet vi den glass-støttet planar bilayer system for å representere overflaten av infiserte celler uttrykker viruset konvolutten gp120 og cellenivå adhesjonsmolekyl ICAM-1. I forbindelse med TIRF mikroskopi, som oppdager fluorescens signaler innenfor 100-200 nm fra bilayer overflaten med en høy signal-til-støy-forhold, kunne vi oppdage supramolecular segregering av gp120 fra ICAM-1 i VS. Dessuten kan standard farging metoden brukes på bilayer systemet og ble brukt her for å oppdage og kvantifisere spesifikke rekruttering av aktive LCK, men ikke Fyn, til gp120-kontaktområdet på VS 15. Derfor tilbyr Planar bilayer en eksperimentelt system for høyoppløselig avbildning av synapse grensesnitt i en 2D plan ved TIRF microscopy, samt bredt felt eller confocal belysning metoder. Imidlertid har systemet også begrensninger som justerer ligand mobilitet, ut-av-fly bøying, og svingninger i biologiske membraner er ikke gjengitt av planar bilayers. Videre er dette en in-vitro system og derfor har andre begrensninger, for eksempel mangel på andre membran molekyler som ville være til stede på en infisert celle og cytoskjelettet maskiner som regulerer molekylær mobilitet og cellular motilitet. Dessuten kan dynamikken og distribusjon av molekyler, som for eksempel trimers versus monomerer av gp120, ikke være representert fysiologisk på bilayer. Likevel, selv med disse begrensningene, er dette systemet fortsatt svært verdifull for å studere virus-celle eller celle-celle interaksjoner, og disse metodene kan tjene som en nyttig guide til forskere som søker bilder med høy oppløsning for å oppdage supramolecular organisasjon som ikke er merkbar i den konvensjonelle celle-celle konjugat-system.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd AI071815 (CEH) og Roadmap Nanomedisin Utviklingssenter award PN2EY016586 (MLD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| His tagged HIV gp120 | Gift from Dr. Cho | DH12 | |
| His tagged HIV gp120 | Immune Technology | Various X4 or R5 tropic | |
| HSA | Williams Medical Company | 521302 | Human Serum Albumin 25% |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC803024 | Ultracel-30K |
| Lck Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 2787 | |
| p-Lck Rabbit pAb | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-101728 | Tyr 394 |
| Fyn Rabbit mAb | EMD Millipore | 04-353 | |
| Alexa Fluor 568 2° Ab | Molecular Probes, Life Technologies | A11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A-20000 | carboxylic acid succinimidyl ester |
| FCS2 Chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| 30mm Round w/holes | Bioptechs | 1907-08-750 | 0.75mm thick |
| Rectangle Gasket | Bioptechs | 1907-1422-250 | 14x24 0.25mm thick |
| Tygon Tubing | Bioptechs | 20202275 | 1/16" (25ft) |
| Three-way Stopcock | Bio-Rad | 7328103 | |
| Two-way Stopcock | Bio-Rad | 7328102 | |
| Sticky Slide I 0.2 Luer | Ibidi | 80168 | |
| Cover glasses | Ibidi | 10812 | |
| 1ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| DOGS-NTA | Avanti Polar Lipid, Inc | 790404C | |
| DOPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375C | |
| Glass coverslip | Bioptechs | 40-1313-0319 | 40mm |
| TIRF microscope | Nikon Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions. J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).
- Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics. J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).
- Dustin, M. L. Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58. J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).
- Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
- Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1. Aids. 10, 1611-1620 (1996).
- Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).
- Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission. J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).
- Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).
- McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus. J. Virol. , 682898-682905 (1994).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).
- Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization. J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
- Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse. J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).
- Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells. J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).
- Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature. 441, 847-852 (2006).
