Summary
우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.
Abstract
특성화 미생물에 대한 양적 접근 방식은 생태계 내에서 미생물의 상태와 기능의 폭넓은 이해를위한 열쇠입니다. 미생물 분석을 위해 현재의 전략은 전통적인 실험실 문화에 종속적인 기술과 직접 추출 및 특정 생체 1, 2의 결정을 바탕으로 이들을 모두 포함합니다. 흙을 거주 미생물 종의 다양성 가운데 몇몇은 배양해 때문에 문화 종속적인 방법은 상당한 편견, biomarker 분석의 부재 제한을 소개합니다.
글루코사민, mannosamine, galactosamine 및 muramic 산성이 잘 토양 시스템 3의 가장 중요한 성분은 이러한 글루코사민 (가장 풍부)와 muramic 산성 (고유 세균 세포에서)으로 인해 생활과 죽은 미생물의 질량 모두 대책을 역임했습니다 4. 그러나 분석에 대한 지식의 부족은 과학적인 또래 간의 폭넓은 보급을 제한합니다. 모든 exi 중에서aldononitrile로 derivatization를 분석 방법을 아프게하는 것은 GC 기반의 분석을 다음 acetates 최적의 정밀도를 균형에 관하여 좋은 옵션으로 떠오르고, 감도, 단순, 샘플 보관 5시 좋은 색층 분리, 안정성.
여기서는 aldononitrile의 acetates에 대한 그들의 변환 후 토양에서 글루코사민과 muramic 산성의 안정적이고 비교적 간단한 분석을 위해 상세한 프로토콜을 소개합니다. 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivatization 및 GC 결정합니다. 단계별 절차는 옛 간행물 6, 7에 따라 수정됩니다. 또한 구조적으로 전자 이온화에 따라 형성 유도체와 그 이온 조각의 분자 이온의 유효성을 검사하기위한 전략을 제시한다. 우리는 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민과 mur의 분자량을 결정하기 위해 GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS 및 isotopically 분류된 시약을 적용amic 산은, 우리는 각 파생 상품 8 이온 조각을 조사하기 위해 이온 스펙트럼에서 동위 원소 라벨이 표시된 파생 상품의 대량 교대를 사용했습니다. 이론적 해설과 더불어, 파생 및 이온 조각의 분자 이온의 유효성 검사 δ 13 C 또는 biogeochemical 연구 9, 10에서 이러한 생체 이온 조각을 사용하여 연구자에게 도움이 될 것입니다.
Protocol
1. 샘플 준비 및 산성 추출
- 동결 건조 토양 샘플 필드 컬렉션 후.
- 볼 밀, 토양 연삭기, 또는 박격포와 유봉을 사용하여 토양 샘플을 갈아서하고 homogenize.
- 25 ML의 가수 분해 플라스크에 토양 샘플을 (> 0.3 MG N을 포함)의 무게.
- 각 가수 분해 플라스크에 10 ML 6M HCL을 추가 단단히 N 2 flasks의 가스, 뚜껑을 채운다.
- 자동 타이머 스위치를 사용하여 8 시간 105 ° 인큐베이터에서 C에서 Hydrolyze.
2. 샘플 정제
- 인큐베이터에서 flasks 제거, 실온에 좋아.
- 소용돌이로 믹스, 각 플라스크 ~ 100 μL 내부 표준 myo-이노시톨을 (물 1 MG ML -1) 추가합니다.
- ST / NS 24 / 안정성을위한 플라스틱 컵에 설정된 40 관절, 200 ML 배 모양의 flasks로 배수 플라스틱 유입 경로를 설정합니다.
- 공간 워트 먼지 # 2 질적 동아리 (11cm 직경) 숙소와 퍼널을에 세트로. 소용돌이 각 가수 분해 플라스크를, 그리고 (당신이 더 이상의 물을 ~ 3 ML 각 플라스크를 헹굴 수 있음) 필터링 깔때기에 슬러리를 붓는다.
- ~ 45 ° C, 신청 진공에서 회전 증발기를 사용하여 여과액 말리.
- 3 ~ 5 ML 물 (필요한 경우 초음파 목욕을 사용) 각 배 플라스크에서 말린 잔류물을 Resuspend, 그리고 40 ML 테플론 튜브에 부어, 물과의 두 번째 나누어지는로 플라스크를 씻어.
- 6.8 석출물 금속 이온과 다른 유기 분자로 1M 코이 솔루션을 사용하여 - 6.6로 산도를 조정합니다.
- 10 분 2000 rcf에서 원심 분리하여 precipitates 제거합니다.
- 40 ML 유리관에 뜨는을 붓고, -20에서 튜브 parafilm와 개방, 동결 ° C를 포함, 다음 parafilm에 구멍을 찌르지.
- 모든 액체를 제거하는 냉동 뜨는을 동결 건조.
- 3 ML 건조 메탄올과 찌꺼기를 해산 (원하는 경우 초음파 목욕을 사용하여) 철저 vortexing, 캡 튜브, 그리고 이주 10 분 동안 2,000 rcf에서 원심 분리기소금 아웃.
- 3 ML 원뿔 반응 유리병에 뜨는 전송, 45 ° C (또는 원하는 경우 건조 질소 가스의 부드러운 스트림 이하)에서 RapidVap 기계 건조에 증발.
- 각 유리병에,, 100 μL 복구 표준 N-methylglucamine (물 1 MG ML -1)과 1 ML H 2 O를 추가 -20시 유리병의 parafilm와 입을, 동결 ° C를 포함, parafilm을 구멍이 후 건조 동결 .
- 표준을 만들기 : 100 μL muramic 산성 (메탄올의 0.5 MG ML -1), 100 μL 글루코사민 (물 1 MG ML -1), 100 μL myo - 이노시톨 (물 1 MG ML -1), 100 μL N을 추가 methylglucamine (물 1 MG ML -1), 1 ML H 2 O, parafilm 각 유리병, -20 ° C에서 꼼짝 다음, 동결 건조, parafilm을 구멍.
3. Derivatization
- 32 MG ML -1 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 40 밀리그램 ML -1 4 - 디메틸 아미노 - 평을 포함 derivatization 시약을 준비한다의 ridine 피리딘 - 메탄올 (4시 1분 V / V).
- 단단히 모자, 그리고 철저하게 와동, reactivials 각 derivatization 시약 300 μL를 추가합니다.
- 35분에 대해 75-80 ° C의 물 목욕 (물론 어떤 물이 튜브를 입력할 수 있도록 피하기 위해 튜브를 봉인)에 튜브를 넣고.
- 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다.
- 3 ML의 reactivials, 단단히 캡, 그리고 철저히 와동 각 1 ML 아세트산 무수물를 추가한 후 75-80 25분 대한 ° C 물 목욕으로 재가열.
- 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다.
4. 분리 및 측정
- 각 유리병, 단단히 캡, 그리고 철저하게 소용돌이에 1.5 ML의 dichloromethane을 추가합니다.
- 솔루션은 두 개의 구문을 별도 때까지 그대로 앉아있을 수 있도록 각 유리병, 단단히 뚜껑 철저히 와동 1 ML 1M HCL을 추가, 기음 1000 μL pipettor를 사용하여 상위 (수성) 단계를 버리고.
- 같은 F에서ashion, 유기농 단계 3 번씩를 추출하지만, 한 ML H 2 O와 (마지막 세척 단계와 수성 상위 단계의 모든이 제거되었음을 보장하기 위해 특별한 처리).
- 45 RapidVap를 사용하여 최종 솔루션을 건조 ° C (또는 건조한 원하는 경우 질소 가스를 사용하여).
- 300 μL 아세트산 에틸 헥산 (1:1 V / V) 및 소형 볼륨 넣고 단단히 뚜껑 2 개 ML 호박 나사 캡 튜브에 이송에 디졸브.
- ; 고정 위상 5퍼센트 페닐 - 95 % 메틸 polysiloxane (DB-5 또는 동급) 수소와 30m 길이, 0.25 밀리미터 ID, 0.25 음 필름 두께 : 부량 들어, 융합된 실리카 무극 성 모세관 컬럼을 사용하여 GC-FID로 분석 또는 헬륨 캐리어 가스와 같은, 0.5 ML 분 -1 일정한 흐름에서. 크로마 토그래피는 프리미엄 "불활성"단계와 수소 캐리어 가스에 좋다지만,보다 일반적인 종류와 헬륨으로 허용됩니다. 감지기 설정은 300입니다 ° C, 400 ML 분 -1 공기 30 ML 분 -1 질소 및 모두수소 화장 가스. 사출 및 오븐 매개 변수는 다음과 같습니다 ° C ~ 250으로 설정 GC 입구 1 개 μL 분할 주입 (30:1), 초기 오븐 온도 120 ° C, 1 분 개최, 10 오븐 온도를 증가 ° C 분. -1 250 ° C, 2.5 분, 잡아;. 270까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 2 분 개최, 290까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 5 분 누르고 있습니다. 캐리어 가스 유량을 조절하므로 250 ° C에서 이노시톨, 글루코사민과 muramic 산 유도체 elute, 270에서 N-methylglucamine elutes ° C.
5. 파생 검증
- 분자 이온을 파악하고 유도체의 분자량을 결정하는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS를 사용합니다.
- 파생의 대상 이온을 조사하기 위해 감도 향상을위한 GC-EI-MS-SIM 또는 GC-EI-MSMS을 사용하십시오.
- 파생 상품의 준비에 대해 여러 isotopically 라벨이 시약을 사용하고 대량 시프트를 사용하여MS의 이러한 isotopically 표시된 파생 상품의 분자 이온과 이온 조각을 조사합니다.
6. 대표 결과
방식의 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivatization 및 GC 결정 (그림 1). 글루코사민 및 표준 주식과 토양 샘플에서 muramic 산성에 대한 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 글루코사민과 muramic 산, mannosamine 및 galactosamine (글루코사민의 두 isomers) 이외에도 메소드를 사용하여 동시에 확인할 수 있습니다. 내부 표준 myo - 이노시톨과 관련한 표준의 반응 요인에 따라 토양 샘플에서 이러한 생체를 정할 수 있습니다. 복구 기준은 질적 derivatization 과정을 모니터링하는 데 사용되었습니다. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성 형성을위한 구조는 그림 3에 표시됩니다
파생 상품의 제안된 구조는 감도 향상, 또는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS 8시 GC-기독교-SIM에 의해 결정되었다; 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각 제안된 구조의 이온 스펙트럼을 비교하여 연구되었다 샘플은 다양한 동위 원소의 incorporations 11으로 준비했습니다. 그림 4는 지배적인 이온의 질량 변화를 보여주는 비 라벨 대리인, D-아세트산 경석고 및 U -13 C, 글루코사민 사용한 세 개의 시나리오에서 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 M / Z 187.에게 기타 자세한 정보 및 설명은 우리의 최근 출판물 8, 11 참조된 수 있습니다. 이 전략은 파생 화학을 연구하는 모델이 될 수 있습니다.
글루코사민의 분석 및 토양의 muramic 산성에 대한 프로토콜의 그림 1. 측정 플로우 차트샘플. 산성 소화, 정화, Derivatization 및 GC 결정 : 프로토콜은 주로 4 단계가 포함되어 있습니다.
그림 2. 표준 및 토양에 대한 이노시톨, 글루코사민, muramic 산, mannosamine, galactosamine 및 methylglucamine의 aldononitrile의 acetates의 GC-FID chromatograms.
그림 3. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성의 형성 구성표. 숫자 1은 nitrile 반응을 나타냅니다. 숫자 2는 아세틸화를 나타냅니다.
그림 4. 지배 이온 structur와 관련된 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 질량 스펙트럼EI 모드 하에서 네;은 ()가 아닌 라벨이 대리인으로 준비, (B) D-아세트산 경석고, (C) U -13 C-글루코사민. 스타가 무거운 동위 원소 원자 또는 동위 원소 그룹을 나타냅니다.
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Discussion
aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성의 분석을 위해 제시 GC 기반 방식은 토양에서 추출한 이러한 아미노산 설탕을 계량하기 위해 비교적 빠른 방법을 제공합니다. 파생 상품은 화학적으로 안정, 한 분석에서 확인할 수 있습니다. 방법은 토양 샘플에 국한되지 않고, 비 토양 매트릭스에서 샘플에 대해 간단하게 할 수 있습니다.
이 방법에 사용되는 진공 펌프는 산성에 강한 것으로 만들어졌습니다. 우리는 더 6M HCL 솔루션을 증발 때 펌프를 보호하는 기본 트랩을 설정하는 것이 좋습니다. 케어는 시약과 유리 모두를 위해 엄격하게 무수 조건을 유지하기 위해 derivatization 단계 동안 촬영해야합니다. 작품은 지체없이 실시하여야한다. 유리도 550 ° C에서 muffling 또는 용매와 rinsing하여, 가끔 표시되는데, 깨끗한 있어야합니다. 안전 조치는 산, 그리고 증발하는 동안 강한 산성 증기의 취급을 위해 촬영해야합니다. Aminoglycoside,토양 - 사는 생물에 의해 생산되는 항생제의 시리즈가 그것 DB-5 12 글루코사민이나 muramic의 산성과 공동 elutes, 다른 고정 위상 화학 가진 두 번째 컬럼을 권장있는만큼, 가능한 간섭으로 판별되었습니다 GC-FID 경우 이러한 아미노산 설탕 quantifying에 사용되는 기본 방법입니다. 우리는 향후 분석을 위해 GC의 elutes에 따라 확실한 탐지기를 권장합니다. 복잡한 매트릭스에서 추적 biomarker의 모호하지 식별을 위해서는 여러 반응 모니터링과 복잡한 기계 장치, 예를 들어 GC-MSMS를 사용하는 것이 좋습니다; interferents의 앞에서 biomarker의 정확한 양을 정함 동안 우리는 biomarker에 고유한 몇몇 지배적인 매스 이온을 기반으로 교정하는 것이 좋습니다 파생 상품.
설탕 구조 정체성의 확인이 15 N-히드록 실 아민 하이드로 클로라이드를 대체에 의해 만들어진, 아세트산 무수물를 진정제를 맞았을, 그리고 13 C와 비 분류 히드록실 용 / 15 N 분류 생체아민 염산염, 파생 상품의 준비에 아세트산 무수물 및 생체, 더 나아가 모니터링은 레이블이 지정되지 않은 파생 적어 넣은 라벨의 특성 이온의 m / z는 변화를 예측했다. 아세테이트 그룹의 각 3 deuteriums를 포함하고 각 nitrile 그룹 1 15 N 개의 원자를 포함하고 있기 때문에 특정에서는, 그것은 이온 M / Z 대량 시프트는 아세테이트 그룹과 nitrile 그룹이 이온의 구조에 표시됩니다 얼마나 많은에 의해 결정되는 것으로 예측하실 수 있습니다 파편. 마찬가지로, 13 C 및 / 또는 15 N-레이블링 세균성 세포 것은 모두 몇 개의 C 원자 조각 이온 구조에서이 글루코사민이나 muramic 산에서 유래하고 결정하는 데 사용할 수있는, 또는 글루코사민-N 또는 muramic 산성 - N이 존재하는지 여부 조각 구조.
GC-EI-MS-SIM은 전자 충격 이온화 및 quadropole 질량 분리 및 선택된 이온 모니터링을 사용하여 질량 분광법 다음에 가스 크로마 토그래피이다; LC-ESI-TOF-MS는 elec 뒤에 액체 크로마 토그래피이다trospray 이온화하고 시간의 비행 질량 분리를 사용하여 질량 분광법. 우리는 여기서 분자량 및 이온 조각을 확인하기 위해 사용되는 이러한 방법의 차이점을 지적. ESI-TOF-MS는 더 단편화가 발생하지 않도록 충분히 낮은 analyte 분자로 이수 이온화 에너지 "소프트 이온화 '기법이며, 생산되는 신호가 analyte의 분자량의 고도로 정확한 통계입니다. GC-EI-MS에서는 많은 에너지가 analyte로 전송되고, 분자가 떨어져 충전 조각의 숫자를 항복시킵니다. quadropole는 특정 양산 / 비용 비율만이 조각이 검출기에 도달 있도록 대용량 필터 역할을합니다. analyte의 특징은 조각,의 분포는 강도 또는 풍부는 M / Z 역모를 꾸몄다되는 이온 스펙트럼을 불리는 그래프로 표시됩니다. 감도를 향상시키기 위해, 우리는 MS 밖에 몇 가지 구체적인 M / Z 값을에게 RA를 수집하는 프로그램하는, 선택된 이온 모니터링 (SIM)를 사용전체 질량 스펙트럼보다 군터.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 검사서 오대호 Bioenergy 연구 센터 (DE-FC02-07ER64494 과학 검사서 BER 사무실)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 박사 Xudong 장 및 프로토콜을 마무리 유용한 기술적인 토론과 소중한 의견에 대한 자신의 그룹 회원들에게 감사를드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
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