Summary
Мы описываем метод протокола для GC на основе анализа aldonitrile ацетат производных глюкозамина и мурамовой кислота извлекается из почвы. Для выяснения химического механизма, мы также представляем стратегию, чтобы подтвердить структуру производной и ионов фрагментов, образующихся при ионизации электрона.
Abstract
Количественный подход к описанию микроорганизмов имеют решающее значение для более глубокого понимания микробной статус и функции в экосистемах. Современные стратегии для микробной анализа включают в себя как традиционные лаборатории культуры зависит от техники и те, которые основаны на прямых добычи и определение определенных биомаркеров 1, 2. Немногие среди разнообразия микробных видов, обитающих в почве может быть культурным, так культура зависит от метода внедрения значительных смещений, ограничение отсутствует в биомаркеров анализа.
Глюкозамин, mannosamine, галактозамина и мурамовой кислоты, хорошо служили в качестве меры живых и мертвых масса микробов, из них глюкозамин (наиболее распространенный) и мурамовой кислоты (единственным из бактериальной клетки) являются наиболее важными составляющими в почве системы 3 , 4. Тем не менее, отсутствие знаний по анализу ограничивает широкой популяризации среди научных коллег. Среди всех Exiжалить аналитических методов, производных для aldononitrile ацетаты затем GC-анализа стала хорошим выбором в отношении оптимального баланса точность, чувствительность, простоту, хороший хроматографического разделения и стабильности на хранение образец 5.
Здесь мы представляем подробный протокол для надежной и сравнительно простой анализ глюкозамин и мурамовой кислоту из почвы после их преобразования в aldononitrile ацетаты. Протокол в основном состоит из четырех этапов: кислотного разложения, образец очистки, производных и GC определения. Шаг за шагом процедуры изменение в соответствии с бывшими публикаций 6, 7. Кроме того, мы представляем стратегию структурной проверки молекулярного иона производная и ее фрагментов ион образуется при ионизации электрона. Мы обратились GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS и изотопно-меченых реагентов для определения молекулярной массы aldononitrile ацетат производные глюкозамина и мурАМИК кислоты, мы использовали массовый переход изотопно-меченых производных в ионных спектра для исследования ионных фрагментов каждого производные 8. В дополнение к теоретическому выяснению, проверка молекулярного иона производного и его фрагменты иона будет полезной для исследователей, использующих δ 13 С или ионно фрагменты этих биомаркеров в биогеохимических исследований 9, 10.
Protocol
1. Подготовка проб и извлечения кислоты
- Freeze-сухих образцов почвы после коллекцию полей.
- Измельчить и гомогенизации проб почвы помощью шаровой мельницы, дробилки почвы, или ступки и пестика.
- Взвешивание образцов почвы (содержащие> 0,3 мг N) в 25 мл колбу гидролиза.
- Добавить 10 мл 6М HCl в каждую колбу гидролиза, заполните N 2 газа в колбах, а крышка плотно.
- Гидролизу при 105 ° C в инкубаторе в течение 8 часов с использованием переключателя автоматического таймера.
2. Пример очистки
- Удалить колбы из инкубатора, охладить до комнатной температуры.
- Добавить 100 мкл внутреннего стандарта мио-инозит (1 мг мл -1 в воде) в каждую колбу, микс закрученной.
- Установить пластиковые воронки слива в 200 мл грушевидной формы колбы с ST / NS 24/40 суставов, устанавливается на пластиковые стаканчики для стабильности.
- Fold Ватман № 2 Качественные кругов (11 см в диаметре) в помещениях и набор в воронки. Swirl каждый гидролиза колбу, и залить раствор в воронку фильтра (можно дальше промывать каждую колбу с ~ 3 мл воды).
- Высушите фильтрата с помощью роторного испарителя при температуре ~ 45 ° C, применяя вакуум.
- Ресуспендируют сухой остаток от каждой груши колбу с 3 ~ 5 мл воды (использовать ультразвуковую ванну по желанию), и залить в трубу 40 мл тефлон, промыть колбу со второй аликвоты воды.
- Скорректировать значение рН до 6,6 - 6,8 использованием 1М КОН решение осадок ионов металлов и других органических молекул.
- Удаление осадка путем центрифугирования при 2000 RCF в течение 10 минут.
- Вылить надосадочную в 40 мл стеклянная трубка, покрытия труб с открытием парафильмом, замораживание при температуре -20 ° C, то тыкать отверстий в парафильмом.
- Морозильнике замороженный супернатант, чтобы удалить всю жидкость.
- Растворить остаток с 3 мл сухого метанола, встряхивая тщательно (используется ультразвуковой ванне при желании); крышка трубки, а затем центрифуги в 2000 RCF в течение 10 минут, чтобы решитьиз соли.
- Перенести супернатант в 3 мл флакон конической реакции, выпаривают досуха на RapidVap машине при 45 ° C (или под струю сухого азота при желании).
- В каждый флакон, добавить 100 мкл восстановления стандартных N-метилглюкамин (1 мг мл -1 в воде) и 1 мл H 2 O, охватывают флакон рот парафильмом, замораживание при температуре -20 ° C, перфорировать парафильмом, а затем заморозить сухой .
- Сделать стандартов: добавить 100 мкл мурамовой кислоты (0,5 мг мл -1 в метанол), 100 мкл глюкозамин (1 мг мл -1 в воде), 100 мкл мио-инозит (1 мг мл -1 в воде), 100 мкл N- метилглюкамин (1 мг мл -1 в воде), и 1 мл H 2 O, парафильмом каждого флакона, замораживание при температуре -20 ° C, перфорировать парафильмом, то в морозильнике.
3. Дериватизации
- Подготовить производных реагентов содержащих 32 мг мл -1 гидроксиламин гидрохлорида и 40 мг мл -1 4-диметиламино-руridine в пиридин-метанол (4:1 об / об).
- Добавить 300 мкл производных реагентов для каждого из reactivials, крышка плотно, и вихрь полностью.
- Положите флаконов в 75-80 ° С на водяной бане 35 минут (хорошо запечатаны флаконы, чтобы избежать попадания воды позволяет войти в ампулах).
- Удалить из флаконов на водяной бане, охладить до комнатной температуры.
- Добавить 1 мл ангидрида уксусной кислоты в каждом из 3 мл reactivials, крышка плотно, и вихрь полностью, то разогревать в 75-80 ° С на водяной бане 25 минут.
- Удалить из флаконов на водяной бане, охладить до комнатной температуры.
4. Разделение и измерение
- Добавить 1,5 мл дихлорметана в каждом флаконе, крышка плотно, и вихрь полностью.
- Добавить 1 мл 1М HCl в каждом флаконе, крышка плотно и вихре тщательно, чтобы решения, чтобы сидеть спокойно, пока два отдельных фраз, аспирации и отказаться от верхней (водной) фазы с помощью пипетки 1000 мкл.
- В том же Fashion, извлечения органической фазы в 3 раза, а с 1 мл H 2 O (с последней промывки, проявлять особую осторожность, чтобы все водные верхней фазе была удалена).
- Высушите окончательного решения с использованием RapidVap при 45 ° C (или сухой использования азота при желании).
- Растворите в 300 мкл этилацетата и гексана (1:1 об / об) и трансфер в 2 мл янтаря завинчивающейся крышкой флакона с небольшим объемом вставки и крышку.
- Для количественного анализа методом ГХ-ПИД использовании плавленого кварца неполярной капиллярной колонкой 30 м в длину, 0,25 мм ID, 0,25 мкм толщина пленки; стационарной фазы 5% фенил-, 95% метил-полисилоксан (DB-5 или эквивалент) с водородом или гелия в качестве газа-носителя, в 0,5 мл мин -1 постоянным потоком. Хроматографии лучше на премию "инертный" фазы и водорода перевозчика, но приемлемо на наиболее распространенные сорта и с гелием. Детектор настройки 300 ° C, 400 мл мин -1 воздуха и 30 мл мин -1 для азота игазы водород макияж. Впрыска и печь параметры следующим образом: 1 мкл инъекции раскола (30:1) с GC входе установлен в 250 ° C, начальная температура духовки 120 ° С; держать 1 мин, повысить температуру в духовке при температуре 10 ° C мин. -1 до 250 ° C, удерживайте 2,5 мин;. рампы до 270 ° C при 20 ° С мин -1; провести 2 минуты, рампы до 290 ° C при 20 ° С мин -1, держать 5 минут. Отрегулируйте поток газа-носителя, скорость, так что инозит, глюкозамин и производные мурамовой кислоты элюируются при 250 ° С, а N-метилглюкамин элюируется при 270 ° C.
5. Производные проверка
- Используйте мягкую ионизацию LC-ESI-TOF-MS для идентификации молекулярных ионов и определения молекулярного веса производной.
- Используйте GC-EI-MS-SIM или GC-EI-MSMS для повышения чувствительности к расследованию целевых ионов производных.
- Использование нескольких изотопно меченых реагентов для подготовки производных, а затем использовать массовый переходтех, изотопно меченых производных в MS исследовать молекулярный ион и ион фрагментов.
6. Представитель Результаты
Протокол метода состоит в основном из четырех этапов: кислотного разложения, примеры очищения, производных и GC определения (рис. 1). Пример анализа глюкозамин и мурамовой кислоты из стандартной акции и из образца почвы показано на рисунке 2. Кроме того глюкозамин и мурамовой кислоты, mannosamine и галактозамина (два изомера глюкозамин) также могут быть определены одновременно, используя этот метод. На основе ответов факторов стандартов по отношению к внутреннему стандарту мио-инозит, мы можем количественно этих биомаркеров в образцах почвы. Восстановление стандартной была использована для качественно контролировать процесс производных. Схемы формирования aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой показано на рисунке 3
Предлагаемая структура производных определяется GC-EIMS-SIM для повышения чувствительности, или мягкой ионизации LC-ESI-TOF-MS 8, предлагаемая структура ионных осколков, образующихся при ионизации электронным изучали путем сравнения ионных спектров образцов, полученных с различных инкорпорации изотопов 11. Рисунок 4 показывает массовый переход доминирующей ион м / з 187 aldononitrile ацетат производные глюкозамина в трех сценариях, подготовленных с не-меченых агентов, D-уксусный ангидрит, и U-13 C-глюкозамин. Другие подробную информацию и разъяснения можно отнести к нашей недавней публикации 8, 11. Эта стратегия могла бы служить моделью для изучения химии производных.
Рисунок 1. Измерение схема протокола для анализа глюкозамин и мурамовой кислоты в почвеобразцов. Протокол основном состоит из 4 шагов: Acid пищеварения, очистки, дериватизации и GC определения.
Рисунок 2. GC-FID хроматограммы aldononitrile ацетатов инозит, глюкозамин, мурамовой кислоты, mannosamine, галактозамина и метилглюкамин стандартов и почвы.
Рисунок 3. Схемы формирования aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой. № 1 представляет нитрил реакции. № 2 представляет ацетилирования.
Рисунок 4. Масс-спектры aldononitrile ацетат производные глюкозамина связанные с доминирующим структурно ионх годов в режиме Е.И. подготовлен с (А) без меток агентов, (B) D-уксусной ангидрит, (C) U-13 C-глюкозамин. Звезда представляет тяжелого изотопа атома изотопа или группы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленные GC-метод, основанный на анализе aldononitrile ацетат производные кислоты и глюкозамина мурамовой обеспечивает относительно быстрый метод количественной оценки этих аминосахаров, извлеченных из почвы. Производных химически стабильны, и могут быть определены в одном анализе. Этот метод не только для образцов почвы и может быть упрощена для образцов без почвы матрицы.
Вакуумный насос, используемые в этом методе построена, чтобы быть устойчивыми к кислоте. Кроме того, мы предлагаем создание базы ловушка для защиты насосов при испарении 6М HCl решений. Необходимо соблюдать осторожность при производных меры для поддержания строго безводных условиях, как для реагентов и посуды. Эта работа должна быть проведена безотлагательно. Стекло должно быть скрупулезно чистым, либо глушения при 550 ° С или промывка растворителем. Меры предосторожности должны быть приняты для обработки кислотами и сильных паров кислоты в процессе испарения. Аминогликозидов,Серия антибиотик, произведенный почвенных организмов, были определены в качестве возможного вмешательства, как со-элюируется с глюкозамином или мурамовой кислоты на DB-5 12, так что вторая колонка с различными стационарными химии фазы рекомендуется, если GC-FID является основным методом, используемым для количественной эти аминосахаров. Мы рекомендуем подтверждающего детектор после СУ элюируется для последующего анализа. Для однозначной идентификации следов биомаркеров в сложных матрицах, мы предлагаем с помощью сложных приборов, например, GC-MSMS с несколькими мониторинг реакции, для точного количественного биомаркеров в присутствии мешающих, мы рекомендуем делать калибровку на основе некоторых доминирующих ионов масса уникальных для биомаркеров производных.
Подтверждение идентичности сахар структура была заменив 15 N-гидроксиламин гидрохлорида, дейтерированного уксусного ангидрида и 13 С и / или 15 N помечены биомаркеров для немеченого гидроксильныхамина гидрохлорид, ангидрид уксусной кислоты и биомаркеров в подготовке производных и дальнейшего мониторинга предсказал м / з смещения характерных ионов меченых против немеченого производных. В отдельных, так как каждый из ацетата группа состоит из 3 deuteriums и каждая группа содержит нитрил 1 15 N атомов, то можно прогнозировать, что ион м / з массовый переход решает, сколько ацетатных групп и нитрильной группы будут представлены в структурах ион фрагментов. Кроме того, 13 C и / или 15 N-маркировки бактериальных клеток может быть использована как определить, сколько атомов углерода в структуре фрагмент ионов возник из глюкозамина или мурамовой кислота, или глюкозамин-N или мурамовой кислота-N существует Фрагмент структуры.
GC-EI-MS-SIM-газовой хроматографии следует ударной ионизации электронов и масс-спектрометрии использованием разделения квадрупольные масс и отдельных мониторинга ионов, LC-ESI-TOF-MS является жидкостной хроматографии следует электроновионизации trospray и масс-спектрометрии использованием время-пролетным масс-сепарации. Мы здесь, указывают на различия между этими методами, которые используются для определения молекулярного веса и ионного фрагмента. ESI-TOF-MS является «мягкой ионизации» техники в ионизации энергия, переданная молекул аналита, что является достаточно низким, так что не происходит фрагментация и сигнал, является очень точной мерой молекулярной массы вещества. В GC-EI-MS, больше энергии передается аналита, и молекула распадается уступая количество заряженных фрагментов. Квадрупольные действует как фильтр масс так, что только те фрагменты удельная масса / заряд соотношение достигает детектора. Распределения осколков, что характерно для аналита, показано на графике называется спектра ионов, в которых интенсивность и обилие построена на т / г. Для повышения чувствительности, мы используем выбран ион мониторинга (SIM), в котором мы программируем MS собрать лишь несколько конкретных м / з значения ратермо, чем весь спектр масс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Министерства энергетики Великих озер биоэнергетики научно-исследовательский центр (DOE BER офис науки DE-FC02-07ER64494). Мы благодарны доктору Сюйдун Чжан и его членов группы за полезные обсуждения технических вопросов и бесценные комментарии по доработке протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
