Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

وقد تم تطوير جهاز بسيط ميكروفلويديك لأداء مخدر مجانا

Abstract

مايكرو الأجهزة fluidic ملفقة توفير الوصول الجزئي للبيئة في الدراسات المجراة على الكائنات الصغيرة. عمليات تصنيع بسيطة متوفرة لأجهزة ميكروفلويديك باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة 1-3. وقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك لشبه الخلوية التصوير 4،5، في الجسم الحي ليزر 2،6 المجهرية والخلوية التصوير 4،7. في الجسم الحي التصوير يتطلب تجميد الكائنات الحية. وقد تحقق ذلك باستخدام الشفط 5،8، 6،7،9 قنوات مدبب، الأغشية تشوه 2-4،10، مع شفط تبريد إضافية 5، مخدر الغاز 11، درجة حرارة المواد الهلامية الحساسة 12، 13 و الغراء CYANOACRYLATE التخدير مثل الليفاميزول 14 ، 15. يشيع استخدام التخدير تؤثر انتقال متشابك و16،17 ومن المعروف أن يكون لها آثار ضارة على شبه الخلوية 4 النقل العصبية. في هذا شudy نظهر غشاء بولي ميثيل يعتمد-siloxane (PDMS) الجهاز الذي يسمح مخدر تجميد سليمة خالية من الكائنات نموذج الوراثية مثل ايليجانس Caenorhabditis (C. ايليجانس)، ذبابة الفاكهة اليرقات واليرقات الزرد. هذه الكائنات هي مناسبة لنموذج من الدراسات المجراة في أجهزة ميكروفلويديك بسبب صغر أقطار والهيئات شفافة بصريا أو شفافة. بأقطار تتراوح من الجسم ميكرومتر ميكرومتر إلى 10 ~ 800 ~ للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس والزرد اليرقات وتتطلب الأجهزة ميكروفلويديك من مختلف الأحجام لتحقيق الشلل الكامل لارتفاع الوقت الفاصل بين التصوير القرار. وثبتوا هذه الكائنات باستخدام الضغوط التي مارستها غاز النيتروجين المضغوط من خلال عمود السائل وتصويرها باستخدام مجهر مقلوب. صدر الحيوانات من مصيدة العودة إلى طبيعته في غضون تنقل 10 دقيقة.

علينا أن نبرهن أربعة طلبات من الوقت الفاصل بين التصوير في C. ايليجانسوهي التصوير النقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية، ما قبل متشابك الحويصلة النقل في النقل عيب متحولة والنقل مستقبلات الغلوتامات وس انقسام الخلايا أرومة عصبية. البيانات التي تم الحصول عليها من مثل هذه الأفلام تظهر أن تجميد ميكروفلويديك هو وسيلة مفيدة ودقيقة في الحصول على البيانات الجسم الحي للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بالمقارنة مع الحيوانات تخدير (الشكل 3C 1J و 4-F).

تم تغيير أبعاد الجهاز لإتاحة الوقت الفاصل بين التصوير من مراحل مختلفة من C. ايليجانس، أولا يرقات ذبابة الفاكهة واليرقات الزرد الطور. نقل الحويصلات التي تحمل علامة synaptotagmin ذات الكلمات الدلالية مع GFP (syt.eGFP) في الخلايا العصبية الحسية تظهر الحركة الموجهة من علامات حويصلة متشابك المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية سليمة العاملات في 1 يرقات ذبابة الفاكهة الطور. وقد استخدم جهاز مماثل لتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير من نبضات القلب خلال 30 ساعة ~ الإخصاب آخر (HPF)الزرد اليرقات. هذه البيانات تظهر أن يمكن تطبيق أجهزة بسيطة وضعنا لمجموعة متنوعة من نظم نموذجية لدراسة الظواهر البيولوجية والخلية عدة التنموية في الجسم الحي.

Protocol

1. SU8 ماجستير التصنيع

  1. تصميم هياكل ميكروفلويديك باستخدام Clewin البرمجيات وطباعته باستخدام الليزر الراسمة 65024 DPI مع حجم ميزة الحد الأدنى من 8 ميكرون على الفيلم وحات الدارات الكهربائية.
  2. تنظيف 2 سم X سم 2 رقائق السيليكون مع أكسيد الأصلي في KOH 20٪ لمدة 1 دقيقة وشطف في الماء منزوع الأيونات، واحد في كل من رقاقة طبقة وطبقة تدفق الرقابة المقابلة.
  3. ضربة الجافة القطع مع غاز النيتروجين ويذوى على لوحة الساخن 120 ° C في لمدة 4 ساعة. السماح للقطع لتهدئة لدرجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.
  4. قطعة السيليكون مكان واحد في وقت واحد على تشاك الدوار وتشغيل الفراغ. تغطية الأسطح السيليكون مع 20 ميكرولتر ~ disilazane-سداسي (HMDS) ومعطف لهم باستخدام ملف. SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى ثم 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية
  5. تغطية رقائق السليكون تماما مع 1.5 مل من 2025 ~-SU8 ( الإلكتروني http://يتبع www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) ورقائق معطف باستخدام SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى من 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. هذا البروتوكول الغزل ينتج مقاومة للضوء من سمك ميكرومتر 40 ~ التي هي مناسبة لمراقبة وطبقات تدفق للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس.
  6. تدور ~ 1.5 مل SU8-2050 باستخدام SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى ثم 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على سمك مقاومة للضوء من ميكرون 80 ~ التي هي مناسبة لتصنيع طبقة تدفق للمراحل المتأخرة من اليرقات C. ايليجانس، القاعدية طبقة تدفق لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات والسيطرة على الطبقات المقابلة.
  7. ضع قطعة السيليكون على لوحة الساخن مع طبقة المغلفة SU8 على القمة. لينة خبز القطع المغلفة السيليكون في 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها C ° 95 لمدة 10 دقيقة. السماح للقطع لتهدئة لدرجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.
  8. ضع قطعة خبز السيليكون لينة على المسرح مع التعرض SU8-2025 سور المغلفةوجه على رأس تواجه مصباح الأشعة فوق البنفسجية. استخدام قناع الصورة مع التصميم I (L1، 1B الشكل) والتصميم الثاني (L2، 1B الشكل) للطبقة تدفق ومراقبة نمط طبقة على التوالي للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس. وضع قناع الصورة في أعلى طبقة SU8 وضمان القناع المسطحة ضد طبقة المغلفة. فتح مصراع من مصباح الأشعة فوق البنفسجية وفضح ينة خبز رقائق SU8 إلى 200 واط مصباح الأشعة فوق البنفسجية من خلال القناع لمدة 15 ثانية الصورة.
  9. استخدام قناع الصورة مع التصميم I (L1، 1B الشكل) والتصميم الثاني (L2، 1B الشكل) على SU8-2050 قطعة مغلفة (أعدت في الخطوة 1.6) لصنع طبقة وطبقة تحكم تدفق للمراحل المتأخرة من اليرقات C. ايليجانس. استخدام قناع الصورة مع التصميم I (L1، الشكل 1C) والتصميم الثاني (L2، الشكل 1C) للطبقة القاعدية وتدفق طبقة تحكم على التوالي لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات على رقائق مغلفة عام 2050 SU8 (أعددتن الخطوة 1.6). كشف الأسطح SU8 من خلال قناع الصورة إلى 200 واط مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية.
  10. ضع قطعة السيليكون تعرض على لوحة الساخن مع طبقة المغلفة على القمة. أضف خبز رقائق في C ° 65 لل1 دقيقة تليها C ° 95 لمدة 10 دقيقة. تسمح القطع ليبرد قبل الشروع في الخطوة التالية.
  11. تطوير القطع باستخدام الحل المطور SU8 لمدة 20 دقيقة. شطف القطع في ISO-بروبيل الكحول (IPA) وضربة الجافة باستخدام غاز النيتروجين.
  12. ضع قطعة السيليكون داخل مجفف مع نمط SU8 على القمة. معطف القطع مع 50 ميكرولتر من tricholoro (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) بخار سيلاني داخل مجفف لمدة 2 ساعة.

الاحتياطات: خذ احتياطات السلامة للتعامل مع المواد الكيميائية أثناء العلاج KOH، طلاء مقاوم الضوء والنامية. يجب أن يتم تنفيذ سيلاني بخار طلاء داخل مجفف في منطقة جيدة التهوية. حماية SU8 مقاومة من خلال التعرض للضوء. استخدام النظارات الواقية مع التركي الممتاز UVحزب التحرير المصدر.

2. PDMS العفن التصنيع

  1. إعداد 10:01 PDMS من خلال الجمع بين 50 غ من قاعدة Sylgard 184 مع 5 غ من وكيل علاج في كوب من البلاستيك. تخلط المحتويات يدويا عن حد أدنى 3 ~. ديغا الخليط داخل مجفف لإزالة جميع فقاعات الهواء تشكلت خلال الخلط.
  2. صب الخليط 5 مم PDMS سميكة على رقائق السليكون مع SU8 نمط الثاني للتصميم، للطبقة تحكم، بلطف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. في حال شكلت خلال فقاعات تتدفق، وديغا PDMS على نمط SU8 في فراغ الأقل إلى إزالة كافة الفقاعات.
  3. وضع رقائق السليكون مع SU8-2025 نمط تصميم I، للطبقة التدفق، على تشاك الدوار وتشغيل الفراغ لانعقادها. تغطية رقائق مع 1 مل من مزيج ~ PDMS ومعطف باستخدام رقائق SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى ثم من 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  4. معطف ~ 1 مل مزيج PDMS على رقائق السليكون 80 ميكرومتر مع SU8-2050 نمط تصميم I (L1، 1B الشكل)، لطبقة تدفق للمراحل المتأخرة من اليرقات C. يتبع ايليجانس باستخدام الدوار SPIN150 في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوانى من 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. معطف طبقة سميكة من المزيج على قطع PDMS السيليكون مع SU8-2050 نمط طبقة تدفق I تصميم (L1، الشكل 1C) لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات، وذلك باستخدام SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 35 ثانية.
  5. تخبز قطع PDMS المغلفة السيليكون للتصميم الأول والثاني للتصميم رقائق مع المقابلة للطبقة التحكم التي تحتوي على PDMS لC. ايليجانس و / أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات في فرن الهواء الساخن الحراري في 50 ° C لمدة 6 ساعة.
  6. قطع قطعة من PDMS الركيزة السيليكون التي تحتوي على نمط II SU8 لC. ايليجانس و / أو يرقات ذبابة الفاكهة / الزرد باستخدام شفرة حادة. لكمة ثقب صغير بقطر 1 مم ~ على أعلى من الخزان الرئيسي الذي يربط بين فخ في قالب PDMS باستخدام الناخس هاريس.
  7. وضع كمات PDMS كتلة (التي تحتوي على العفن سميكة 40 ميكرون من أجل السيطرةطبقة L2) على صينية من البلاستيك، مع الجانب مصبوب من طبقة التحكم مواجهة. وضع رقاقة السيليكون PDMS المغلفة التي تحتوي على 40 ميكرومتر سميكة SU8 تصميم I على علبة نفسه، مع سطح PDMS المغلفة لأعلى. أدخل الدرج داخل غرفة الأنظف البلازما وتشغيل الفراغ لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل الطاقة البلازما وخفض ضغط غرفة غرفة حتى يتحول ردي فاتح اللون. فضح كل من الأسطح إلى 18 وات الهواء البلازما تحت فراغ منخفضة لمدة 2 دقيقة.
  8. وضع كتلة PDMS كمات إزالتها من ميكرون سميكة 80 SU8 الرئيسية المحتوية على نمط II لمراحل متأخرة من اليرقات C. ايليجانس أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات على صينية من البلاستيك، مع الجانب مصبوب من طبقة التحكم مواجهة. وضع طبقة PDMS المقابلة خبز تدور المغلفة على رقاقة السيليكون تحتوي على 80 ميكرومتر سميكة تصميم I لاحقا C. ايليجانس مراحل أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات في وقت واحد على الدرج نفسه مع ليالي شقة المغلفة PDMSurface مواجهة. ذكر استخدام نفس البروتوكول السابق لليعرضهم لبلازما الهواء.
  9. وضع السطوح البلازما 2 المعالجة لC. ايليجانس و / أو ذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات مع ضغط لطيف وخبز لهم في الهواء الساخن في الفرن الحراري C ° 50 لمدة 2 ساعة.
  10. قطع الأجهزة المستعبدين من الركيزة السيليكون مع تصميم I SU8 لC. ايليجانس و / أو يرقات ذبابة الفاكهة / الزرد. الثقوب لكمة في وصول خزانات مدخل ومخرج للقناة التدفق.
  11. مكان القالب PDMS المستعبدين على صينية من البلاستيك لC. ايليجانس، مع الجانب مصبوب من تدفق تصميم طبقة مواجهة. نظيفة زلة غطاء الزجاج (22 X 22 مم، سماكة رقم 1) ووضعها على علبة من البلاستيك نفسه. أدخل الدرج تحتوي على العفن PDMS والزجاج غطاء زلة داخل غرفة البلازما. كشف سطح PDMS السفلي من الجهاز والزجاج غطاء زلة إلى 18 وات البلازما الجوية في الضغط المنخفض لمدة 2 دقيقة. وضع السطوح البلازما 2 تعامل مع الجنرالTLE الضغط وخبز لهم في الهواء الساخن في الفرن الحراري C ° 50 لمدة 2 ساعة.
  12. حافظ على بقاء الجهاز في بيئة نظيفة لاستخدامها في المستقبل.

3. خطوات إضافية لذبابة الفاكهة / جهاز اسماك الزرد

  1. كشف نظيفة سطح الزجاج من حجم 2 سم X 2 سم مع 50 ميكرولتر من tricholoro (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) بخار سيلاني داخل مجفف لمدة 2 ساعة.
  2. تدور ~ 1 مل من مزيج PDMS 10:01 أعدت في الخطوة 2.1 على سطح الزجاج باستخدام silanized SPIN150 الدوار في 500 دورة في الدقيقة لمدة 35 ثانية. خبز ركائز الزجاج المطلي PDMS في فرن الهواء الساخن في C ° 50 ساعة لمدة 6 مع السطح المطلي مواجهة. السماح للطبقة PDMS لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في الخطوة التالية.
  3. لكمة طبقة المغلفة باستخدام مخصص بنيت الناخس معدنية حادة في منتصف PDMS، لتشكيل طبقة PDMS التبادل. تم تصميم شكل الناخس معدنية مماثلة في تصميم لتدفق ذبابة الفاكهة / الزرد (L1، الشكل 1C
  4. فضح طبقة التبادل PDMS واحد المستعبدين كتلة (طبقة وطبقة تدفق السيطرة، في الخطوة 2.9 لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات) إلى 18 وات الهواء النظيف باستخدام البلازما البلازما في فراغ منخفضة. وضع السطوح البلازما 2 تعامل معا وخبز لهم في فرن الهواء الساخن عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. قطع الجهاز المستعبدين من الزجاج، والثقوب لكمة في وصول خزانات مدخل ومخرج والسندات لتغطية زلة كوب (22 X 22 مم، سماكة رقم 1) باستخدام منظف البلازما كما ذكر في الخطوة 2.11. هذا من شأنه أن ينتج عبوة الشلل لأول اليرقات طور مرحلي ذبابة الفاكهة مع ارتفاع قناة ميكرومتر 500 ~. ليرقات اسماك الزرد، مكررة طبقة PDMS التبادل مع عملية تصنيع خطوة الترابط إضافية. طبقة مزدوجة من PDMS-S تنتج على ارتفاع من 900 قناة لمدة 30 ميكرومتر اليرقات الزرد HFP.

الاحتياطات: تجنب ذرات الغبار أثناء تصنيع الجهاز. اثنين البلازما تنظيف سطحق يجب أن تكون خالية تماما الغبار عن الترابط الصحيح. تخزين الأجهزة داخل مجفف في الحالات التي غرفة خاصة نظيفة غير متوفرة من أجل تقليل تراكم الغبار في الأجهزة.

4. باستخدام غشاء PDMS

  1. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب الصغير المرن (القطر الداخلي 1.6 مم ~، ~ القطر الخارجي 4.8 ملم) لمنظم الضغط النيتروجين امدادات الغاز والطرف الآخر إلى الخزان الرئيسي من خلال فخ إبرة قياس 18 (القطر الخارجي ~ 1.25 مم) لصقها على أنبوب. A 3-محبس الطريقة المستخدمة في منتصف اتصال أنبوب يسمح التطبيق أو إطلاق الضغط على الغشاء.
  2. ملء الأنبوب متصلا الجهاز PDMS مع عمود 10 سم من الماء المقطر قبل توصيله إلى الخزان من فخ الرئيسية للC. ايليجانس و / أو ذبابة الفاكهة / الزرد الجهاز اليرقات.
  3. تحويل صمام توريد النيتروجين ليلي: 14 PSI ورصد غشاء من فخ الرئيسي تشتيت نحو اله قناة تدفق تضخم منخفضة من مجهر مقلوب. يتم ضغط طول عمود الماء في أنبوب الصغير المرن كلما محبس 3-الطريق مفتوح. حواف الغشاء تهرب واضحة في الضوء المرسل (الشكل 1I و1J). انحراف الغشاء يسبب تشريد جزيئات الغبار / فقاعات تحت الغشاء PDMS ويدفعهم إلى حدود القناة.
  4. الانتظار حتى الجبهة السائل يملأ متناهية تماما دون أي الهواء المحبوس.
  5. الافراج عن الضغط باستخدام محبس 3-سيلة للاسترخاء الغشاء إلى موقعها الراحة.

5. إدراج C. ايليجانس، وذبابة الفاكهة اسماك الزرد اليرقات في الجهاز والشل منهم تحت الغشاء PDMS مرنة

  1. ملء قناة تدفق العازلة M9 مع [3 غ KH 2 PO 4 و 6 ز نا 2 HPO 4 و 5 ز كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgSO 4، H 2 O إلى 1 L، تعقيم بواسطة التسليمoclaving] لC. ايليجانس 18 أو 1X PBS [8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 ز بوكل، 1.44 ز نا 2 HPO 4، 0،24 ز KH 2 PO 4، H 2 O إلى 1 L، تعقيم بواسطة التعقيم] لذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات (19) ل10 دقيقة قبل التجربة.
  2. تحديد موقع واحد C. ايليجانس المرحلة المطلوبة على لوحة NGM 18 (يرقات ذبابة الفاكهة أو الأولى من العمر اليرقي لوحة أجار أو البيض يدويا dechorionated الزرد HPF 30 اليرقات في وسط سائل 20) باستخدام المجهر ستيريو تضخم منخفضة. اختيار حيوان واحد باستخدام كمية صغيرة من محلول منظم في تلميح الصغيرة. خفض استخدام تلميح الصغيرة مع نهايته لاستيعاب أكبر ذبابة الفاكهة أو الزرد اليرقات في المخزن المؤقت.
  3. دفع الكائن الحي واحد من خلال تدفق مدخل القناة. ضبط ضغط pipetting لوضع الحيوان في فخ الفردية بموجب الرئيسي.
  4. زيادة الضغط للغشاء PDMS ببطء لوضع الحيوانات ضد تشاننيل الحدود مع شل والضغط PSI 14 للC. ايليجانس، 7 PSI لذبابة الفاكهة و 3 رطل ليرقات اسماك الزرد.
  5. وضع الحيوان يجمد في وسط الميدان المجهري للعرض. استخدام مجهر مقلوب في الإعدادات المطلوبة لحقل عالية الدقة مشرق أو التصوير مضان. الحصول على صور مضان واحد أو انقضاء الوقت، في إطار معدل معرفة مسبقا.
  6. الافراج عن الضغط فخ ورصد تحرك للحيوان لمدة 5-10 دقيقة في تضخم منخفضة.
  7. مطاردة الحيوان وإدراج حيوان جديدة لتكرار الخطوات المذكورة أعلاه.
  8. يغسل كل الحيوانات من الخزان النفايات باستخدام الماء المقطر تطبيقها باستخدام حقنة. تجفيف عن طريق دفع الهواء قناة باستخدام حقنة لإعادة استخدامها في المستقبل.

الاحتياطات: الحيوانات التي تتطلب الضغط العالي pipetting في التدفق داخل القناة الرئيسية تميل إلى إظهار تنقل الفقراء / الصحة بعد الإفراج من فخ ويجب تجنب لمعهد العالم العربيجينج. تنظيف قناة تدفق للأي أثر للعازلة لمنع انسداد القناة البلورات. إذا تم استخدام النفط لتصوير عالية الدقة، وتنظيف الزجاج لتغطية زلة تكون قادرة على الحفاظ على إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء للتجارب اللاحقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجهاز هو شل حركة كتلة PDMS طبقة ثنائية ملفقة من قبل الرابطة طبقتين: طبقة تدفق (طبقة 1) وطبقة التحكم (طبقة 2) كما هو موضح في الشكل 1. توصيل فخ الرئيسي لاسطوانة غاز النيتروجين من خلال تنظيم وقفة الديك 3-سيلة لتطبيق اللازمة (3-14 رطل) الضغط على الغشاء من خلال عمود السائل (الشكل 1A). الغشاء نحيد يشل C. ايليجانس، ذبابة الفاكهة أو يرقات اسماك الزرد في قناة تدفق مصممة مع أبعاد مختلفة (الشكل 1B و 1C). تستخدم أقنعة الضوئية لتصميم طبقات الجهاز مع الشلل هندستها مختلفة لC. ايليجانس (1D الشكل)، ذبابة الفاكهة اليرقات (الشكل 1F) والزرد اليرقات (الشكل 1G). وقد تباينت ذروة قناة طبقة تدفق (H1 في الشكل 1E، 1K) باستخدام مختلف سرعات الدوران لاستيعاب طلاء أوganisms من أقطار مختلفة داخل قناة التدفق. ملفقة مرتفعات طبقة تدفق في 40 ميكرومتر، ميكرومتر 80، 500 و 900 ميكرومتر ميكرومتر لC. ايليجانس مراحل اليرقات، البالغ C. ايليجانس، أولا يرقات ذبابة الفاكهة واليرقات طور مرحلي الزرد على التوالي (الجدول 1). الجهاز مع تدفق ارتفاع من 40 ميكرومتر قناة المناسب من L1 إلى أوائل C. L4 ايليجانس اليرقات. ويستخدم الجهاز مع ارتفاع ميكرون 80 قناة تدفق ليرقات L4 في وقت متأخر والكبار C. ايليجانس عندما يبدأ الفرج تبرز. ويمكن أيضا الأجهزة أكبر الزرد أن تستخدم ليرقات ذبابة الفاكهة أقدم. كانت ملفقة سمك الغشاء PDMS (م) في 40 ميكرومتر ميكرومتر و300 للC. ايليجانس والأجهزة ذبابة الفاكهة / الزرد على التوالي. كانت ملفقة ذروة قناة ميكروفلويديك في طبقة 2 في 40 ميكرون للمراحل الأولى من اليرقات C. وايليجانس ميكرون 80 لمراحل متأخرة من اليرقات C. ايليجانس وذبابة الفاكهة/ الزرد اليرقات. تم قياس ارتفاع تدفق قناة، والغشاء قناة التحكم في الأجهزة ملفقة على دفعات متعددة ومستقلة وجدت لتكون متسقة داخل ± 5 ميكرون من بعضها البعض. الجهاز يستخدم تقنية انحراف الغشاء (الشكل 1H-J) إلى شل الكائنات في قناة التدفق.

الكائنات الحية تدفق قناة (PDMS-1) تدور الظروف لقناة تدفق PDMS التبادل (PDMS-S) تدور PDMS لظروف التبادل ضغط الشلل (PSI)
C. ايليجانس (L1 لL4 المبكر) 40 ميكرون (SU8-2025) 500 دورة في الدقيقة (5 ثانية)، 2،000 دورة في الدقيقة (30 ثانية) NA NA 14
C. ايليجانس (L4 في وقت متأخر والبالغين) 80 &مو، م (SU8-2050) 500 دورة في الدقيقة (5 ثانية)، 2،000 دورة في الدقيقة (30 ثانية) NA NA 14
ذبابة الفاكهة (أول الطور) 80 ميكرومتر (SU8-2050) 500 دورة في الدقيقة (5 ثانية)، 2،000 دورة في الدقيقة (30 ثانية) 400 ميكرومتر (PDMS) 500 دورة في الدقيقة (35 ثانية) 7
الزرد (30 HPF) 80 ميكرومتر (SU8-2050) 500 دورة في الدقيقة (5 ثانية)، 2،000 دورة في الدقيقة (30 ثانية) 2X 400 ميكرومتر (PDMS) 500 دورة في الدقيقة (35 ثانية) 3

أبعاد الجدول 1 الأجهزة. للقناة تدفق (PDMS-1) والتبادل PDMS طبقة (PDMS-S) المستخدمة في C. ايليجانس والأجهزة ذبابة الفاكهة / الزرد.

على الحركة C. ايليجانس L4 اليرقات في القناة ميكرون 80 جهاز ميكروفلويديك PDMS ارتفاع استخدام 14 رطل غاز النيتروجين (الشكل 2A). الوقت الفاصل بين الصور مضان ثتصور يحرث المكتسبة في سرعة 2 إطارا في الثانية (fps) باستخدام الهدف 60X (الفتحة العددية 1.4، الهدف النفط) لنقل التصوير من الميتوكوندريا باستخدام مصفوفة GFP الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المستهدفة مستقبلات اللمس 21. تم تحويل جميع الأطر 400 إلى kymographs باستخدام يماغيج ( www.rsbweb.nih.gov / ط ) وصنفت وفقا لتوجيهات anterogradely الميتوكوندريا (بعيدا عن جسم الخلية) للمخرج retrogradely (نحو جسم الخلية) أو ثابتة (2E الشكل). لاحظنا النقل الميتوكوندريا تصل إلى 21 رطل لكل بوصة مربعة من الضغط الشلل، ولكن كان تدفق أكبر إلى حد ما في ضغط أقل الشلل. تم قياس تدفق تقدمي ورجعي من الميتوكوندريا لتكون ± 1.1 و 1.6 ± 0.23 0.22 رطل في الساعة 7 في حين 0،8 ± 0.25 و 1.2 ± 0.34 رطل في 14 ضغط الشلل. كانت القيم لا تختلف إحصائيا من 1.1٪ ± 0.33٪ و 1.3 & Pيجمد تم الحصول عليها من الحيوانات 0،42 باستخدام 3 الليفاميزول ملي (ف القيم> 0.45 في ن = 30 الحيوانات)؛ lusmn.

ويمكن استخدام أجهزة أكبر مع ارتفاع ميكرومتر 500 إلى شل 1 يرقات ذبابة الفاكهة الطور (الشكل 2B) و 28-30 اليرقات الزرد HPF (الشكل 2D). يمكن تشريح يرقات ذبابة الفاكهة لأول الطور أن يكون تحديا. وعلى النقيض من أجهزة ميكروفلويديك توفير وسيلة لأداء عالية مشرق الميدان القرار و / أو التصوير مضان باستخدام الكائنات سليمة. على الحركة الفردية ذبابة الفاكهة باستخدام اليرقات 7 رطل من غاز النيتروجين المضغوط (الشكل 2B، الجدول 1) والصور مضان النقل synaptotagmin.eGFP في الخلايا العصبية الحسية تم الحصول عليها (الشكل 2C). وأظهرت الوقت الفاصل بين الأفلام المتحركة والثابتة البضائع synaptotagmin ملحوظ في الخلايا العصبية الحسية (الشكل 2F). وقد تم قياس متوسط ​​سرعة تقدمي ورجعي من كيمographs أن يكون 0،92 ± 0.04 ميكرون / ثانية و 1.00 ± 0.05 ميكرون / ثانية على التوالي (ن = 6 الحيوانات، ن> قطاعات 40). هذه هي مماثلة لسرعات نقل تقل الحويصلات synaptotagmin قياس في تشريح الخلايا العصبية الحركية ذبابة الفاكهة تتحرك كل anterogradely (0.84 ± 0.05 ميكرون / ثانية) وretrogradely (0.76 ± 0.03 ميكرون / ثانية) 22.

واستخدمت أجهزة مشابهة مع ارتفاع ميكرومتر 900 إلى شل مراحل مختلفة من اليرقات الزرد (الشكل 2D، الجدول 1). يرقات اسماك الزرد اثناء مراحله المبكرة التنموية تقلب ذيله كل 10 ثانية إلى 15 ويتم عادة استخدام يجمد tricaine 0.02٪ (MS-222) في حل أو على وسائط تصاعد لارتفاع القرار التصوير 23. لدينا PDMS الجهاز يوفر وسائل بديلة لتجميد سريع ويلغي الحاجة لتركيب المتوسطة لا يمكن الاعتماد عليها في مسار بصري خلال التصوير عالية الدقة 24. نحن dechorionated يدويا 28-30 HPF اليرقات وثبتوا منهم على حدة في جهاز PDMS باستخدام 3 غاز النيتروجين المبادرة لاكتساب الوقت الفاصل بين الأفلام من ضربات القلب اليرقات. وقد تم قياس معدل ضربات القلب لتكون 136.8 ± 1.6 في دقيقة (N 8 أفلام =) وكان مماثلة لغيرها من التقارير المنشورة 25.

وقد تم بالفعل لدينا جهاز ميكروفلويديك بسيطة أظهرت لقياس مجموعة متنوعة من الأحداث الفرعية الخلوية والخلوية في البرية نوع C. ايليجانس 4. لدينا في الجهاز ميكروفلويديك والبرية نوع C. ايليجانس تظهر عدد أكبر من البضائع مثل حويصلات متشابك الخلايا العصبية التي تتحرك في مقابل الحيوانات التي يجمد باستخدام التخدير. ومع ذلك، كان لدينا لم تختبر أجهزتنا للحيوانات متحولة لمعرفة ما اذا هذه النتائج صحيحة. لاختبار هذا استخدمنا متحولة قوية hypomorphic في kinesin3 / UNC-104 المحركات الجزيئية، UNC-104 (e1265)، الذي ينقل ما قبل متشابك حويصلات 26. قارنا تدفق GFP :: RAB-3 ملحوظة ما قبل متشابك vesiيجمد الجسيمات في الخلايا العصبية الأمامي الجانبي ميكانيكية حسية في التخدير ويجمد الجهاز aniamls متحولة (الشكل 3A). وكان تدفق حويصلات متشابك قبل أكبر تدفق الحيوانات في الجهاز يجمد بالمقارنة مع بيانات تم الحصول عليها من الحيوانات UNC-104 تخدير في الليفاميزول ملي 1 (الشكل 3B، 3C) 27. هذا يدل على أن التصوير المسوخ النقل قوية عيب في أجهزة ميكروفلويديك من المرجح أن تكون وسيلة أكثر كفاءة لجمع البيانات. نعرض أيضا أنه يمكن تصوير أخرى مثل نقل البضائع شجيري من مستقبلات الغلوتامات في الخلايا العصبية في الحيوانات أوروغواي الجهاز يجمد (الشكل 3D، 3E). ويمكن أيضا أن تستخدم الجهاز لعمليات الخلوية خلال الصورة C. المبكر ايليجانس التنمية مثل تقسيم أرومة عصبية في الحيوانات س L1. تم تصوير الخلية QR لتقسيم لتشكيل خلايا QR.a هما ابنة وQR.p ~ ساعة 3 بعد الفقس (الشكل 3F) بما يتفق معفي وقت سابق ملاحظات 28.

أبعاد الجدول 1 الأجهزة. للقناة تدفق (PDMS-1) والتبادل PDMS طبقة (PDMS-S) المستخدمة في C. ايليجانس والأجهزة ذبابة الفاكهة / الزرد.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي تمثيل الأجهزة ميكروفلويديك PDMS للكائنات نموذج الوراثية. (A) يتم تحميل كائن باستخدام تلميح الصغيرة في القناة وتدفق يجمد باستخدام غاز النيتروجين المضغوط التحكم باستخدام منظم وصمام. الجهاز هو مناسب للتصوير الميداني / مضان مشرق في مجهر مقلوب. تصميم يتكون من قناة تدفق طويلة 10 مم (تصميم I، L1) وقناة التحكم (تصميم II، L2) على التوالي لC. ايليجانس (B) وذبابة الفاكهة / الزرد اليرقات (C). يشار إلى أبعاد على تصميم (B و C). (D، F، G) تخطيطي للالمتنوعق من طبقات PDMS (PDMS-1، PDMS-2، PDMS الغشاء، PDMS والزجاج-S) في تقديم C. ايليجانس، وذبابة الفاكهة الزرد الجهاز الشلل. (E) تمثيل تخطيطي لمقطع عرضي للجهاز تظهر الجزء الأكبر PDMS طبقة (PDMS-2)، تدور PDMS المغلفة طبقة (PDMS-1) لتشكيل غشاء مرن والتبادل PDMS طبقة (PDMS-S) لإضافة ارتفاع تدفق إلى القناة (لذبابة الفاكهة / الزرد الجهاز). والمستعبدين الهيكل كله لا رجعة فيه إلى الصف البصرية الزجاج زلة غطاء لاستيعاب الكائن الحي (دائرة في البني). التخطيطي يشير ارتفاع 'H2' قناة التحكم، "H1" تدفق قناة واللكم طبقة التبادل 'S' و غشاء سمك 'م'. (H) يشير إلى انحراف الغشاء نحو قناة تدفق في وجود عمود السائل تحت الضغط في قناة التحكم. وتظهر الصور من الميدان مشرق غشاء مجانا (I) وتهرب (J) تحت الصفر و 14 رطل ضغط عمود السائل على التوالي. السهم ورأس السهم يشير فقاعة شالتانجو والخروج من الغشاء في قناة تدفق على التوالي. (K) صورة مقطعية الصليب من C. ايليجانس الجهاز الذي اتخذ في موقع منطقة الشلل. شريط النطاق هو 50 ميكرومتر (K) و 200 ميكرومتر (I، J). (D، F، G) ليست نوعي Schematics إلى مقياس. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. يجمد الكائنات التصوير نموذج الجينية في جهاز ميكروفلويديك. صورة مشرقة مجال لC. يجمد ايليجانس (A)، يرقات ذبابة الفاكهة الأولى الطور (B) ويرقات اسماك الزرد لمدة 30 HPF (D) في جهاز ميكروفلويديك PDMS. تحليل مخطاط التموج من الوقت الفاصل بين التصوير من jsIs609، وC. ايليجانس سلالة، تعبر عن GFP مصفوفة الميتوكوندريا استهدفت خلية عصبية في الأطراف الأمامية ميكانيكية حسية (ALM) لجهاز immobilأوتوماتيكية الحيوانية (E). وتصنف الميتوكوندريا وتقدمي ('أسفل' رأس السهم)، إلى الوراء (رئيس 'حتى' السهم) والثابتة (علامة 'نجمة') في مخطاط التموج. (C) الإسفار صورة لذبابة الفاكهة سليمة 1 يرقة الطور. المربع يشير إلى الموقع حيث يتم عالية الدقة الوقت الفاصل بين التصوير syt.eGFP النقل في الخلايا العصبيه العاملات. وأشار المونتاج من خمسة إطارات المكتسبة في 5 هرتز مع أرقام الإطار على كل صورة والبضائع GFP ملحوظ كما هو مبين تقدمي، وثابتة إلى الوراء في المونتاج (F). في مربع (D) إلى منطقة تخضع لرقابة لحساب معدل ضربات القلب من اليرقات الزرد. شريط المقياس 5 ميكرون (F)، و 10 ميكرومتر (E)، و 100 ميكرومتر (A، B) و 200 ميكرومتر (D).

الشكل 3
الشكل 3. التصوير الخلوية وشبه الخلوية في C. ايليجانس باستخدام أجهزة ميكروفلويديك PDMS. (A) تخطيطي للنملةتميز erior الجانبية ميكانيكية حسية (ALM) الخلايا العصبية مع التوجهات تقدمي ورجعي. يظهر مربع منقط المنطقة تصويرها للنقل محور عصبي. يتم الحصول على 350 أطر باستخدام مجهر القرص الغزل مبائر في 5 إطار في الثانية مع جسم الخلية (CB) على الحلقة والحق العصبية (NR) على اليمين. ويتم تحليل البيانات باستخدام kymographs للحيوانات يجمد في جهاز أو باستخدام 1 الليفاميزول ملي (C). وتظهر الشحنة تتحرك في اتجاهات تقدمي ورجعي باستخدام أسهم تشير 'أسفل' و 'حتى' على التوالي. (B) تدفق تقدمي ورجعي من الجزيئات التي لوحظت في UNC-104 (e1265) الحيوانات في منطقة ميكرون 20 من الخلايا العصبية أكثر من ALM إطارات الوقت الفاصل بين 350. (D) رسم تخطيطي للتميز خلية عصبية أوروغواي المستخدمة في GFP الصورة الغلوتامات مستقبلات النقل. يتم تحويل 350 الوقت الفاصل بين الأطر التي تظهر في kymographs البضائع تتحرك في الاتجاهات تقدمي ورجعي في الحيوانات يجمد في الجهاز PDMS أو باستخدام 1 الليفاميزول ملي (E). الوقت الفاصل بين الصور المكتسبة خلال أرومة عصبية س ديالرؤية والهجرة في المراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس. (F) ثلاثة الوقت الفاصل بين الإطارات التي تظهر QR تقسيم تمر إلى شكله ابنة الخلايا QR.a وQR.p. شريط المقياس 5 ميكرون (C، E و F). البيانات الممثلة في (B) ويعني ± SEM (ن> 4). يتم إجراء المقارنات فيما يتعلق بالقيم التي تم الحصول عليها في التخدير والرمز بواسطة * (P <0.05) و** (P <0.005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS الأجهزة ميكروفلويديك شفافة بصريا بالتالي يمكن استخدامها لتصوير بجودة عالية في الجسم الحي من أي كائن نموذج شفاف / شفافة. لدينا تصميم مناسب لتصوير عالية المكانية والزمانية التكبير من الأحداث الخلوية وشبه الخلوية في الحيوانات الحية سليمة. باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الدقيق microfabrication لينة سهلة من التلاعب يسمح أبعاد الجهاز لأحجام مختلفة من الكائنات النموذج. هي ملفقة الأجهزة من مختلف الأحجام لمختلف مراحل C. ايليجانس، ذبابة الفاكهة اليرقات واليرقات الزرد. الأجهزة مع ارتفاعات مختلفة من 40 ميكرومتر ميكرومتر و80 في قنواتها طبقة تدفق تظهر الشلل تحسين وأفضل ما بعد التصوير صحة كل من في وقت مبكر (L1) وبعد (L4 الراحل) مراحل C. ايليجانس على التوالي. نحقق نسبة نجاح 100٪ في تصنيع جهاز لC. ايليجانس وذبابة الفاكهة / الزرد دون أي أجهزة معيبة. ويمكن استخدام أجهزة عدة مرات حتىملوثة قناة التحكم مع جزيئات الغبار أو نمو البكتيريا. يجمد الجهاز C. ايليجانس تظهر تدفق البضائع أكبر في كل نوع والحيوانات البرية متحولة بالمقارنة مع الحيوانات anesthesized. تجميد جهاز يلغي الحاجة إلى بروتوكولات تشريح تحديا تقنيا وخاصة بالنسبة للمراحل النمو الأولى من يرقات ذبابة الفاكهة 29.

بروتوكولات تجميد فوري في أجهزة ميكروفلويديك PDMS لديها ميزة المتأصلة في تقليل الوقت التجريبية بالمقارنة مع أوقات أطول التعرض عادة المطلوبة لتطبيق التخدير خارجيا. جميع الكائنات يجمد العودة إلى طبيعته في غضون تنقل 5-10 دقيقة بعد الافراج عن الضغط على الغشاء PDMS تشوه. C. وثبتوا على الحدود ايليجانس للقناة تدفق وبعيدا عن الجزء المركزي من الغشاء الشلل. الحيوانات يجمد في منتصف القناة تدفق تظهر حالة صحية سيئة بعد immobilizaنشوئها ويموت في غضون يوم أو اثنين. وقد استخدم الجهاز لدينا ميكروفلويديك للحفاظ على L4 المرحلة C. ايليجانس يجمد لمدة تصل إلى ساعة واحدة تحت الغشاء دون أن يؤثر ذلك على الصحة، أو تطور لاحق. يمكن المحاصرين الحيوانات يجمد لأقصر الأوقات (حتى 10 دقيقة) عدة مرات للتصوير. لمراحل النمو المبكرة، C. على الحركة ايليجانس مع ضغط أقل قليلا (7 رطل) للتجارب الوقت الفاصل بين المدى الطويل (~ 3 ساعة). تركت الحيوانات يجمد تحت الغشاء بعد الافراج عنه في نفس الجهاز في وقت التدخل. هذه الحيوانات قابلة للمقارنة مع النوع البري في التنمية على حد سواء والصحة العامة. الكبار C. وأظهرت ايليجانس يجمد مع انخفاض الضغط (7 رطل) الانجراف البطيء خلال التجارب عالية الوقت الفاصل بين القرار وتتطلب أدوات تحليل مركب لتحليل النقل. واستخدمت ضغوط أقل ولكن لإجراء دراسات على المدى الطويل مثل أرومة عصبية س انقسام الخلايا / الهجرة خلال الساعات 3 ~ أو شبه الكمي mitochondria النقل توصيف؛ العمليات التي لا تحتاج تجميد كامل. ويمكن استخدام الضغوط أقل من الشلل بالتالي اعتمادا على مجموعة البيانات التي تحتاج إلى أن يتم جمعها.

الوقت الفاصل بين التصوير من L4 C. ايليجانس يبين حركة قفزي من GFP تميز الميتوكوندريا في الخلايا العصبية ALM (سلالة jsIs609) كما تم الإبلاغ عن نظم الخلايا العصبية في نموذج آخر 30-32. بعض هذه الخلايا العصبية في الميتوكوندريا تظهر النقل ثنائي الاتجاه في حين أن الغالبية منهم هي ثابتة طوال مدة الفيلم. على الرغم من الاختلافات الصغيرة في حالة تغير مستمر واصلنا الضغط باستخدام 14 PSI الشلل في حالة C. ايليجانس للحصول على تجميد كامل وتجنب أي انحراف أثناء التصوير عالية الوقت الفاصل بين قرار النقل محور عصبي. نقترح استخدام 14 رطل لكل بوصة مربعة في بروتوكول عام وتبعا الاحتياجات التجريبية يمكن زيادة هذا أو ينخفض. استغرق ما يقرب من الحيوانات في نفس الوقت للعودة إلى locomotio الطبيعين من كل الضغوط الشلل الدنيا والعليا والحيوانات يجمد تطوير مماثل لتلك التي نمت دون تجميد.

ويمكن استخدام الجهاز عند ملفقة باستخدام أبعاد أكبر مع طبقات التبادل للكائنات أكبر نموذج ذبابة الفاكهة مثل اليرقات الزرد و. التصوير synaptotagmin.eGFP النقل في الخلايا العصبية سليمة 1 ذبابة الفاكهة الطور الحسي يظهر النقل النشط في الاتجاهين تقدمي ورجعي. وأعلى متوسط ​​مقارنة السرعات في قياس اليرقات الجهاز يجمد على القيم المقاسة في الخلايا العصبية الحركية تشريح 22. قد تنشأ عن هذا الاختلاف الحصول على البيانات بشكل أسرع في تجاربنا (5 هرتز الخامس / ق 1،1-1،4 هرتز)، الخلايا العصبية الخاصة الاختلافات في النقل عضية (الحسية الخامس / ق المحركات الخلايا العصبية) و / أو الآثار الناجمة عن تشريح.

وأجريت التجارب لدينا من قبل حصرا في الحيوانات البرية نوع 4، وبالتالي فإننا تحديد ما إذا كانوكان التصوير في المسوخ الأجهزة ميكروفلويديك أيضا مفيدة. الوقت الفاصل بين التصوير من C. ايليجانس L4 الحيوانات يظهر انخفاض تدفق GFP :: RAB-3 ملحوظة ما قبل متشابك الحويصلات في kinesin3/unc-104 المسوخ يجمد في الليفاميزول 1.0 مم مقارنة قياسات التدفق التي تم الحصول عليها في الحيوانات باستخدام يجمد لدينا PDMS الجهاز (الشكل 3B). وقد لاحظنا في كثير من الأحيان، وتظهر مثال (الشكل 3C) في المسوخ التي لوحظ القليل جدا من وسائل النقل إذا ثبتوا الحيوانات باستخدام تركيزات مخدر نوع الحيوانات التي شل البرية. عدد الحويصلات في نقل الحيوانات UNC-104 هو أعلى بكثير عندما نستخدم أجهزة ميكروفلويديك. الحيوانات تخدير تظهر خصائص مماثلة النقل عند وضعه تحت ضغط 14psi تطبيقها على الغشاء PDMS (الشكل 3B). كما تم ملاحظات مماثلة في الحيوانات التي النوع البري 4. هذه البيانات تشير إلى أن زيادة تدفق من غير المحتمل أن تنشأ من الدردشةتعبئة تحت النيتروجين ولكن نظرا إلى البروتوكول الذي كان أقل ضررا على النقل داخل الخلوية.

من حيث المبدأ، يمكن أن جميع الأحداث الأخرى مثل الكالسيوم وديناميات انقسام الخلايا يمكن تصوير في يرقات ذبابة الفاكهة / الزرد سليمة أيضا. بعد التصوير استرداد الحيوانات يجمد الجهاز هو أقل ضررا لبقاء الكائن الحي (4) وبالتالي يمكن أيضا أن تستخدم هذه الأجهزة لأداء طويل الأمد التصوير الكائنات نموذج الجينية الوراثية للأحداث التي تحدث عبر جداول زمنية أطول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور راي Krishanu للأسهم ذبابة الفاكهة، Tarjani أغاروال للحفاظ على قفص ذبابة الفاكهة، بيتر Juo لnuIs25 وCGC لC. ايليجانس السلالات. أدلى SPK jsIs609 في المختبر مايكل Nonet ل. نشكر آربان أجنيهوتري (BITS بيلاني) لمساعدته في الوقت الفاصل بين التصوير النقل الميتوكوندريا من الحيوانات jsIs609 في أجهزة ميكروفلويديك. ونحن ممتنون للدكتور براكاش Vatsala كرومالاي وSURYA لتزويدنا الأجنة الزرد. نشكر الدكتور كريشنا والمكاتب المركزية الوطنية في CIFF لاستخدام المجهر القرص الغزل مبائر بدعم من وزارة العلوم والتكنولوجيا مركز لتقنية النانو-(رقم SR/55/NM-36-2005). نشكر أيضا Kaustubh راو، فينكاترامان V. وSachidanand Chetana للمناقشات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة ما بعد الدكتوراه DBT (SM)، DST المسار السريع مخطط (SM) ومنحة لDBT (SPK). وأيد SA من المنح وDST CSIR لSPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 67، البيولوجيا الجزيئية وعلم الأعصاب، على microfluidics،
ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;،<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; واسماك الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter