Summary
एक सरल युक्ति microfluidic चतनाशून्य करनेवाली औषधि मुफ्त प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया है
Protocol
1. SU8 मास्टर फैब्रिकेशन
- डिजाइन microfluidic Clewin सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संरचनाओं और इसे मुद्रित सर्किट बोर्ड फिल्म पर 8 सुक्ष्ममापी की न्यूनतम सुविधा आकार के साथ +६५०२४ डीपीआई लेजर आलेखक का उपयोग कर.
- प्रवाह परत और अपनी इसी नियंत्रण परत के लिए एक वफ़र प्रत्येक, 1 मिनट और विआयनीकृत पानी में कुल्ला के लिए 20% KOH में देशी ऑक्साइड के साथ 2 सेमी एक्स 2 सेमी सिलिकॉन वेफर्स साफ.
- नाइट्रोजन गैस के साथ टुकड़े सूखी और 4 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर निर्जलीकरण उड़ा. टुकड़े नीचे अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें.
- जगह सिलिकॉन एक स्पिनर चक पर एक समय में टुकड़े और शून्य पर बारी. ~ 20 μl (HMDs) hexamethyl - disilazane और उन्हें कोट एक SPIN150 5 के लिए 500 rpm पर स्पिनर सेकंड 30 सेकंड के लिए 3,000 rpm द्वारा पीछा किया. का उपयोग कर के साथ सिलिकॉन सतहों को कवर
- सिलिकॉन वेफर्स पूरी तरह से कवर ~ SU8 २,०२५ की 1.5 मिलीलीटर ( http://) www.microchem.com/Prod-SU82000.htm और 30 सेकंड के लिए कोट 5 सेकंड के लिए 500 rpm पर SPIN150 स्पिनर का उपयोग वेफर्स 2,000 rpm द्वारा पीछा किया. यह कताई प्रोटोकॉल ~ 40 सुक्ष्ममापी की एक photoresist मोटाई है कि और सी. जल्दी लार्वा चरणों के लिए नियंत्रण प्रवाह परतों के लिए उपयुक्त है का उत्पादन एलिगेंस.
- स्पिन ~ 1.5 SU8-2050 मिलीलीटर 5 के लिए 500 rpm पर SPIN150 स्पिनर का उपयोग सेकंड 30 सेकंड के लिए 2,000 rpm से पालन करने के लिए ~ 80 सुक्ष्ममापी की एक photoresist मोटाई है कि सी. देर लार्वा चरणों के लिए प्रवाह परत निर्माण के लिए उपयुक्त है प्राप्त एलिगेंस, ड्रोसोफिला / zebrafish लार्वा और उनके इसी नियंत्रण परतों के लिए बेसल प्रवाह परत.
- गर्म थाली पर सिलिकॉन टुकड़े SU8 लेपित परत के साथ शीर्ष पर रखें. 65 में शीतल लेपित सिलिकॉन टुकड़े ° सी 1 बाद 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस मिनट के लिए सेंकना. टुकड़े नीचे अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें.
- SU8 2025 लेपित सुर के साथ नरम बेक्ड जोखिम मंच पर सिलिकॉन टुकड़े प्लेसयूवी दीपक का सामना शीर्ष पर चेहरा. डिजाइन (L1, चित्रा 1B) मैं और डिजाइन द्वितीय (L2, चित्रा 1B) के साथ प्रवाह परत और नियंत्रण परत पैटर्न के लिए फोटो मुखौटा क्रमशः प्रयोग सी. जल्दी लार्वा चरणों के लिए एलिगेंस. फोटो मुखौटा SU8 परत के ऊपर रखें और यह सुनिश्चित करें मुखौटा लेपित परत के खिलाफ फ्लैट है. यूवी दीपक के शटर खुला और 200 वाट यूवी दीपक के 15 सेकंड के लिए फोटो मुखौटा के माध्यम से नरम बेक्ड SU8 वेफर्स बेनकाब.
- डिजाइन (L1, चित्रा 1B) मैं और डिजाइन द्वितीय (L2, चित्रा 1B) के साथ SU8-2050 लेपित टुकड़े पर फोटो मुखौटा (1.6 चरण में तैयार) का उपयोग करने के लिए सी. देर लार्वा चरणों के लिए प्रवाह परत और नियंत्रण परत बनाना एलिगेंस. डिजाइन (L1, चित्रा 1C) मैं और डिजाइन द्वितीय (L2, चित्रा 1C) के साथ बेसल परत और प्रवाह नियंत्रण परत SU8-2050 के साथ लेपित वेफर्स पर क्रमशः ड्रोसोफिला / zebrafish लार्वा के लिए के लिए फोटो मुखौटा का उपयोग करें (मैं तैयारn 1.6 कदम). 15 सेकंड के लिए 200 वाट यूवी दीपक फोटो मुखौटा माध्यम से SU8 सतहों बेनकाब.
- शीर्ष पर लेपित परत के साथ एक गर्म थाली पर उजागर सिलिकॉन टुकड़े रखें. 65 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा वेफर्स सेंकना पोस्ट. टुकड़े नीचे अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले शांत करने के लिए अनुमति दें.
- 20 मिनट के लिए SU8 डेवलपर समाधान का उपयोग कर टुकड़े का विकास करना. आईएसओ Propyl शराब (आईपीए) में टुकड़े कुल्ला और सूखी नाइट्रोजन गैस का उपयोग झटका.
- एक desiccator में सिलिकॉन टुकड़े शीर्ष पर SU8 पैटर्न के साथ रखें. कोट की 50 μl tricholoro (1h, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) 2 घंटे के लिए एक desiccator में silane वाष्प के साथ टुकड़े.
सावधानियां KOH उपचार, photoresist कोटिंग और विकासशील के दौरान रासायनिक से निपटने के लिए सुरक्षा सावधानियों ले लो. Silane वाष्प कोटिंग एक हवादार क्षेत्र में एक desiccator अंदर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. SU8 रक्षा प्रकाश के संपर्क में ज्यादा से विरोध. एक यूवी lig के साथ सुरक्षात्मक eyewear का प्रयोग करेंht स्रोत.
2. PDMS मोल्ड फैब्रिकेशन
- इलाज के एजेंट के 5 जी के साथ एक प्लास्टिक के कप में 184 आधार Sylgard की 50 ग्राम के संयोजन के द्वारा 10:01 PDMS को तैयार करो. सामग्री मैन्युअल मिक्स ~ 3 मिनट के लिए. Degas सभी हवा मिश्रण के दौरान गठित बुलबुले को दूर desiccator अंदर मिश्रण.
- डिजाइन द्वितीय के SU8 पैटर्न के साथ सिलिकॉन वेफर्स पर 5 मिमी मोटी PDMS मिश्रण डालो, नियंत्रण परत के लिए, धीरे हवा के बुलबुले के गठन से बचने के. मामले में बुलबुले कम निर्वात में SU8 पैटर्न सभी बुलबुले को दूर करने पर, degas PDMS डालने का कार्य के दौरान गठित कर रहे हैं.
- मैं डिजाइन पैटर्न SU8 २०२५ के साथ सिलिकॉन wafers प्लेस, प्रवाह परत के लिए, स्पिनर चक पर और शून्य पर बारी के लिए उन्हें पकड़. ~ PDMS मिश्रण के 1 मिलीग्राम और 5 के लिए 500 rpm पर SPIN150 स्पिनर का उपयोग कोट वेफर्स के साथ वेफर्स कवर सेकंड 30 सेकंड के लिए 1500 rpm के द्वारा पीछा किया.
- ~ कोट के लिए डिजाइन मैं (L1, चित्रा 1B) के 80 पैटर्न SU8-2050 सुक्ष्ममापी के साथ 1 मिलीग्राम सिलिकॉन वेफर्स पर PDMS मिश्रण,सी. देर लार्वा चरणों के लिए प्रवाह परत 5 सेकंड के लिए 500 rpm पर SPIN150 स्पिनर का उपयोग एलिगेंस 30 सेकंड के लिए 1,000 rpm द्वारा पीछा किया. कोट प्रवाह ड्रोसोफिला / zebrafish लार्वा के लिए परत डिजाइन (L1, चित्रा 1C) के पैटर्न SU8-2050 के साथ सिलिकॉन टुकड़े, 35 सेकंड के लिए 500 rpm पर SPIN150 स्पिनर का उपयोग पर एक PDMS मिश्रण की मोटी परत.
- सेंकना डिजाइन के PDMS लेपित सिलिकॉन टुकड़े मैं और सी. के लिए नियंत्रण परत के लिए इसी डिजाइन द्वितीय के साथ वेफर्स PDMS युक्त एक गर्म हवा संवहन ओवन में 50 एलिगेंस और / या / ड्रोसोफिला zebrafish लार्वा ° सी के लिए 6 घंटा.
- सिलिकॉन सब्सट्रेट युक्त सी. के लिए SU8 पैटर्न द्वितीय से PDMS टुकड़ा काट एलिगेंस और या ड्रोसोफिला / zebrafish लार्वा / एक तेज ब्लेड का उपयोग कर. ~ PDMS ढालना एक हैरिस छिद्रकार का उपयोग में मुख्य जाल जोड़ने जलाशय के शीर्ष पर 1 मिमी व्यास का एक छोटा सा छेद मुक्का.
- छिद्रित PDMS ब्लॉक (40 सुक्ष्ममापी नियंत्रण के लिए मोटी ढालना युक्त रखेंL2 परत) एक प्लास्टिक ट्रे पर नियंत्रण परत के ऊपर का सामना करना पड़ ढाला पक्ष के साथ. PDMS लेपित सिलिकॉन वफ़र ही ट्रे पर 40 सुक्ष्ममापी मोटी SU8 डिजाइन मैं युक्त PDMS लेपित सतह का सामना करना पड़ के साथ रखें. प्लाज्मा क्लीनर के कक्ष के अंदर ट्रे डालें और 2 मिनट के लिए शून्य पर बारी. इसके बाद, प्लाज्मा सत्ता पर बारी और चैम्बर दबाव कम जब तक चैम्बर हल्के गुलाबी रंग में बदल जाता है. 18 वाट हवा प्लाज्मा 2 मिनट के लिए कम निर्वात के तहत दोनों सतहों बेनकाब.
- सी. देर लार्वा चरणों के लिए छिद्रित PDMS 80 सुक्ष्ममापी मोटी SU8 मास्टर युक्त पैटर्न द्वितीय से हटा ब्लॉक प्लेस एक प्लास्टिक ट्रे पर एलिगेंस / या ड्रोसोफिला zebrafish molded नियंत्रण परत के ऊपर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ, लार्वा. इसी बेक्ड PDMS परत 80 सुक्ष्ममापी मोटी डिजाइन मैं युक्त बाद में सी के लिए सिलिकॉन वफ़र पर लेपित स्पिन रखें एलिगेंस चरणों या एक ही ट्रे पर / ड्रोसोफिला zebrafish साथ फ्लैट PDMS लेपित है साथ लार्वाurface का सामना करना पड़ रहा है. ऊपर उल्लेख किया ही प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए उन्हें हवा प्लाज्मा को बेनकाब.
- सी. के लिए दो प्लाज्मा इलाज सतहों प्लेस एलिगेंस और / या ड्रोसोफिला zebrafish लार्वा कोमल दबाव और 50 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए उन्हें गर्म हवा संवहन ओवन में सेंकना के साथ मिलकर /.
- सी. के लिए डिजाइन SU8 मैं के साथ सिलिकॉन सब्सट्रेट से बंधुआ उपकरणों कट एलिगेंस और या ड्रोसोफिला / zebrafish लार्वा /. पंच Inlet और आउटलेट प्रवाह चैनल के जलाशयों पर पहुँच छेद.
- सी. के लिए एक प्लास्टिक ट्रे पर बंधुआ PDMS ढालना रखें प्रवाह परत को सामना करना पड़ रहा डिजाइन के ढाला पक्ष के साथ एलिगेंस,. स्वच्छ कांच के कवर स्लिप (22 x 22 मिमी, मोटाई नंबर 1) और यह एक ही प्लास्टिक ट्रे पर जगह. PDMS मोल्ड और ग्लास प्लाज्मा चैम्बर के अंदर कवर पर्ची युक्त ट्रे डालें. डिवाइस के नीचे PDMS सतह और कांच के कवर पर्ची के लिए 18 वाट 2 मिनट के लिए कम दबाव पर हवा प्लाज्मा बेनकाब. जनरल के साथ दो प्लाज्मा इलाज सतहों प्लेसtle दबाव और 50 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए उन्हें गर्म हवा संवहन ओवन में सेंकना.
- भविष्य के उपयोग के लिए एक स्वच्छ वातावरण में डिवाइस स्टोर.
3. ड्रोसोफिला / Zebrafish डिवाइस के लिए अतिरिक्त कदम
- आकार की साफ कांच की सतह 2 सेमी X tricholoro की 50 μl के साथ 2 सेमी (1h, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) 2 घंटे के लिए एक desiccator में silane वाष्प. बेनकाब
- ~ स्पिन 10:01 PDMS silanized गिलास 500 rpm पर 35 सेकंड के लिए SPIN150 स्पिनर का उपयोग कर सतह पर 2.1 चरण में तैयार मिश्रण की 1 मिलीग्राम. लेपित सतह ऊपर का सामना करना पड़ के साथ 6 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर गर्म हवा ओवन में PDMS लेपित गिलास substrates बनाओ. PDMS परत नीचे अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें.
- पंच लेपित PDMS के बीच में एक कस्टम बनाया तेज धातु छिद्रकार का उपयोग कर, PDMS स्पेसर परत फार्म परत. धातु छिद्रकार का आकार प्रवाह डिजाइन (L1, चित्रा 1C ड्रोसोफिला / zebrafish के लिए समान बनाया गया है
- PDMS स्पेसर परत और एकल बंधुआ ब्लॉक (प्रवाह परत और नियंत्रण परत, ड्रोसोफिला / zebrafish लार्वा के लिए 2.9 चरण में बनाया) 18 वाट हवा प्लाज्मा कम निर्वात में प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग बेनकाब. दो प्लाज्मा इलाज सतहों को एक साथ रखें और उन्हें 50 में एक गर्म हवा ओवन ° 2 घंटे के लिए सी में सेंकना.
- कांच से बंधुआ डिवाइस को काटो, पंच Inlet और आउटलेट जलाशयों और यह एक गिलास (22 x 22 मिमी, मोटाई नंबर 1) को कवर पर्ची एक प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग कर के रूप में 2.11 कदम में उल्लेख करने के लिए बांड पर पहुँच छेद. यह ~ 500 सुक्ष्ममापी एक चैनल ऊंचाई के साथ 1 instar ड्रोसोफिला लार्वा के लिए एक स्थिरीकरण उपकरण का निर्माण होगा. Zebrafish लार्वा के लिए, एक अतिरिक्त कदम के साथ संबंध PDMS स्पेसर परत निर्माण की प्रक्रिया नकल. PDMS-S की दोहरी परत 900 सुक्ष्ममापी की एक 30 एचपीएफ zebrafish लार्वा के लिए चैनल ऊंचाई पैदा करता है.
सावधानियां उपकरण निर्माण के दौरान धूल कणों से बचें. दो प्लाज्मा सतह साफउचित संबंधों के लिए मुक्त करने के लिए पूरी तरह से धूल की जरूरत है. स्थितियों में एक desiccator जहां एक विशेष साफ कमरे क्रम में उपलब्ध उपकरणों में धूल के कणों के संचय को कम करने के लिए नहीं है में उपकरणों की दुकान.
4. PDMS झिल्ली का उपयोग
- एक 18 गेज सुई (बाहरी व्यास ~ 1.25 मिमी) के माध्यम से दबाव नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति नियामक और मुख्य जाल जलाशय से दूसरे छोर में एक सूक्ष्म फ्लेक्स ट्यूब (भीतरी व्यास ~ 1.6 मिमी, बाहरी व्यास ~ 4.8 मिमी) के एक अंत कनेक्ट ट्यूब को चिपके. एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी ट्यूब कनेक्शन के बीच में प्रयोग किया जाता है या झिल्ली पर दबाव की रिहाई के आवेदन की अनुमति देता है.
- आसुत जल के एक 10 सेमी स्तंभ के साथ यह एक सी के मुख्य जाल के जलाशय को जोड़ने से पहले PDMS डिवाइस जुड़े ट्यूब भरें एलिगेंस और या / ड्रोसोफिला zebrafish लार्वा उपकरण /.
- नाइट्रोजन आपूर्ति की वाल्व बंद 14 साई को पढ़ सकते हैं और मुख्य वें की ओर deflecting जाल की झिल्ली की निगरानीई एक औंधा माइक्रोस्कोप के कम बढ़ाई प्रवाह चैनल. सूक्ष्म फ्लेक्स ट्यूब में पानी स्तंभ की लंबाई संकुचित है जब भी पानी निकलने की टोंटी 3-तरह खुला है. Deflected झिल्ली के किनारों प्रेषित प्रकाश (चित्रा 1ï और 1j) में दिखाई दे रहे हैं. झिल्ली विक्षेपन धूल कणों बुलबुले PDMS झिल्ली तहत / के विस्थापन का कारण बनता है और उन्हें चैनल सीमाओं को धक्का.
- रुको जब तक तरल सामने microchannel कोई फँस हवा के बिना पूरी तरह से भरता है.
- पानी निकलने की टोंटी 3-तरह का उपयोग करने के लिए अपने आराम की स्थिति के लिए झिल्ली आराम से दबाव जारी.
5. सी. डालने डिवाइस में एलिगेंस, ड्रोसोफिला, और Zebrafish लार्वा और उन्हें लचीला PDMS झिल्ली के तहत immobilizing
- M9 बफर साथ प्रवाह चैनल भरें [3 जी KH 2 4 पीओ, 6 छ ना 2 4 HPO, 5 ग्राम NaCl, 1 मिलीग्राम 1 एम 4 MgSO, एच 2 एल 1 हे, aut द्वारा बाँझ बनानासी. के लिए] oclaving एलिगेंस 18 या 1X पीबीएस / ड्रोसोफिला zebrafish 19 लार्वा के लिए एक से पहले 10 मिनट के लिए [8 जी, NaCl 0.2 छ KCl, 1.44 छ ना 2 4 HPO, 0.24 छ KH 2 4 पीओ, एच 2 ओ एल 1, वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा बाँझ बनाना] प्रयोग.
- एक एकल सी. ढूँढें आवश्यक चरण के एक एन जी एम 18 प्लेट पर एलिगेंस (या अगर अंडा थाली या मैन्युअल dechorionated तरल 20 मध्यम में 30 HPF zebrafish लार्वा से 1 instar ड्रोसोफिला लार्वा) एक कम बढ़ाई स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. एक भी एक माइक्रो टिप में बफर समाधान की एक छोटी मात्रा का उपयोग पशु उठाओ. अपने अंत के साथ एक सूक्ष्म टिप का उपयोग करने के लिए बड़ा ड्रोसोफिला या बफर में zebrafish लार्वा को समायोजित में कटौती.
- प्रवाह चैनल इनलेट के माध्यम से एक जीव पुश. दबाव pipetting मुख्य जाल के तहत व्यक्तिगत जानवर की स्थिति को समायोजित करें.
- PDMS झिल्ली के दबाव बढ़ाएँ धीरे चान के खिलाफ पशु स्थितिनेल सीमा है और यह 14 सी. के लिए साई के दबाव के साथ स्थिर एलिगेंस, ड्रोसोफिला और zebrafish लार्वा के लिए 3 साई के लिए 7 साई.
- देखने के सूक्ष्म क्षेत्र के केंद्र में स्थिर पशु स्थिति. उच्च संकल्प उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए वांछित सेटिंग्स पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें. पूर्वनिर्धारित फ्रेम दर पर एक या समय चूक प्रतिदीप्ति छवियों मोल.
- जाल दबाव रिलीज और कम बढ़ाई 5-10 मिनट के लिए जानवर की हरकत पर नजर रखने.
- पशु फ्लश और एक ताजा पशु डालने के लिए ऊपर के चरणों को दोहराएँ.
- अपशिष्ट जलाशय से सभी जानवरों आसुत एक सिरिंज का उपयोग कर लागू पानी का उपयोग कर धो लें. भविष्य में पुन: उपयोग करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग कर हवा धक्का द्वारा चैनल सूखी.
सावधानियां मुख्य चैनल के अंदर प्रवाह उच्च pipetting दबाव की आवश्यकता पशु जाल से रिहाई के बाद गरीब हरकत / स्वास्थ्य दिखा देते हैं और भारतीय सैन्य अकादमी के लिए नहीं होना चाहिएging. बफर के किसी भी पता लगाने के लिए क्रिस्टल द्वारा चैनल के clogging रोकने के लिए प्रवाह चैनल साफ. अगर तेल की उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, गिलास को कवर करने के बाद के प्रयोगों के लिए शोर अनुपात करने के लिए अच्छा संकेत बनाए रखने में सक्षम होना पर्ची साफ करने के लिए.
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Representative Results
: स्थिरीकरण डिवाइस एक bilayer PDMS संबंध दो परतों द्वारा गढ़े ब्लॉक एक प्रवाह परत (1 परत) और एक नियंत्रण परत (परत 2) के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है. मुख्य नियामक और एक 3 तरह रोक के लिए एक तरल स्तंभ (चित्रा 1 ए) के माध्यम से झिल्ली पर आवश्यक दबाव (3-14 साई) लागू मुर्गा जाल के माध्यम से एक नाइट्रोजन गैस सिलेंडर से जुड़ा है. deflected झिल्ली सी. immobilizes विभिन्न आयामों (चित्रा 1B और 1C) के साथ डिजाइन प्रवाह चैनल में एलिगेंस, ड्रोसोफिला, या zebrafish लार्वा. फोटो मास्क सी. के लिए अलग geometries के साथ स्थिरीकरण युक्ति परतों को डिजाइन करने के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 1D) एलिगेंस, ड्रोसोफिला लार्वा (चित्रा 1F) और zebrafish लार्वा (चित्रा 1G). प्रवाह परत (चित्रा 1E में h1, 1K) के चैनल ऊंचाई अलग स्पिन कोटिंग गति का उपयोग करने को समायोजित विविध था याप्रवाह चैनल के अंदर विभिन्न diameters के ganisms. फ्लो परत हाइट्स 40 सुक्ष्ममापी, 80 सुक्ष्ममापी, 500 सुक्ष्ममापी और सी. के लिए 900 सुक्ष्ममापी पर गढ़े गए थे एलिगेंस लार्वा चरणों, वयस्क सी. एलिगेंस, instar 1 ड्रोसोफिला लार्वा और zebrafish लार्वा क्रमशः (1 टेबल). 40 सुक्ष्ममापी की एक प्रवाह चैनल ऊंचाई के साथ डिवाइस L1 से जल्दी L4 सी. उपयुक्त है एलिगेंस लार्वा. एक 80 सुक्ष्ममापी प्रवाह चैनल ऊंचाई के साथ एक डिवाइस देर L4 लार्वा और वयस्क सी. के लिए प्रयोग किया जाता है एलिगेंस जब योनी बहर करने के लिए शुरू होता है. बड़ा zebrafish उपकरणों को भी पुराने ड्रोसोफिला लार्वा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. PDMS झिल्ली मोटाई (एम) सी के लिए 40 और 300 सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी में निर्मित किया गया था एलिगेंस और क्रमशः ड्रोसोफिला / zebrafish उपकरणों. परत 2 में microfluidic चैनल की ऊंचाई 40 सुक्ष्ममापी पर सी. जल्दी लार्वा चरणों के लिए निर्मित किया गया था एलिगेंस और सी. देर लार्वा चरणों के लिए 80 सुक्ष्ममापी एलिगेंस और ड्रोसोफिला/ Zebrafish लार्वा. प्रवाह चैनल, झिल्ली और नियंत्रण चैनल की ऊंचाई कई स्वतंत्र बैचों में निर्मित उपकरणों में मापा गया था और ± 5 सुक्ष्ममापी के भीतर एक दूसरे के अनुरूप होना पाया. इस उपकरण में एक झिल्ली विक्षेपन (चित्रा 1H जम्मू) तकनीक के प्रवाह चैनल में जीवों को स्थिर करने के लिए उपयोग करता है.
| जीव | प्रवाह चैनल (PDMS 1) | प्रवाह चैनल के लिए शर्तों स्पिन | स्पेसर PDMS (PDMS-S) | स्पेसर PDMS के लिए स्पिन की स्थिति | स्थिरीकरण दबाव (साई) |
| सी. एलिगेंस (L1 L4 जल्दी) | 40 सुक्ष्ममापी (SU8 2025) | 500 (5 सेकंड) rpm, 2,000 rpm (30 सेकंड) | NA | NA | 14 |
| सी. एलिगेंस (देर से L4 और वयस्कों) | 80 औरम्यू, मीटर (SU8-2050) | 500 (5 सेकंड) rpm, 2,000 rpm (30 सेकंड) | NA | NA | 14 |
| ड्रोसोफिला (1 instar) | 80 सुक्ष्ममापी (SU8-2050) | 500 (5 सेकंड) rpm, 2,000 rpm (30 सेकंड) | 400 सुक्ष्ममापी (PDMS) | 500 rpm (35 सेकंड) | 7 |
| Zebrafish (30 HPF) | 80 सुक्ष्ममापी (SU8-2050) | 500 (5 सेकंड) rpm, 2,000 rpm (30 सेकंड) | 400 सुक्ष्ममापी (PDMS) 2X | 500 rpm (35 सेकंड) | 3 |
तालिका 1. प्रवाह चैनल (PDMS-1) और स्पेसर PDMS परत (PDMS-S) डिवाइस आयाम सी. में इस्तेमाल किया एलिगेंस और ड्रोसोफिला / zebrafish उपकरणों.
सी. एलिगेंस L4 लार्वा 80 सुक्ष्ममापी चैनल ऊंचाई PDMS microfluidic डिवाइस का उपयोग कर 14 साई नाइट्रोजन गैस (2A चित्रा) में स्थिर थे. समय चूक प्रतिदीप्ति छवियों w2 फ्रेम प्रति सेकंड की गति (fps) mitochondria की इमेजिंग परिवहन के लिए एक 60x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 1.4, तेल उद्देश्य) का उपयोग करने में अधिग्रहीत अरे स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स 21 में एक mitochondrial लक्षित GFP मैट्रिक्स का उपयोग visualized. सभी 400 फ्रेम (ImageJ का उपयोग kymographs / www.rsbweb.nih.gov ij ) और सेल शरीर से दूर anterogradely () निर्देशित प्रतिगमनपूर्वक निर्देशित (सेल शरीर की ओर) या स्थिर (चित्रा 2 ई) के रूप में mitochondria में वर्गीकृत किया गया है. हम mitochondrial परिवहन मनाया स्थिरीकरण दबाव के 21 साई, लेकिन प्रवाह कुछ हद तक कम स्थिरीकरण दबाव में अधिक से अधिक था. mitochondria की अग्रगामी और प्रतिगामी प्रवाह 0.8 ± 0.25 और 1.2 ± 0.34 14 साई स्थिरीकरण दबाव जबकि 7 साई पर 1.1 ± 0.23 और 1.6 ± 0.22 मापा गया. मान सांख्यिकीय 1.1 से अलग नहीं थे ± 0.33 और 1.3 & Plusmn, 0.42 जानवरों से प्राप्त 3 मिमी levamisole (पी मूल्यों 0.45>, n = 30 जानवरों) का उपयोग immobilized.
500 सुक्ष्ममापी ऊंचाई के साथ बड़े उपकरणों के लिए 1 instar ड्रोसोफिला (चित्रा 2B) लार्वा और 28-30 HPF zebrafish लार्वा (चित्रा 2 डी) को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विच्छेदन पहले instars ड्रोसोफिला लार्वा के चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसके विपरीत करके microfluidic उपकरणों एक उच्च संकल्प उज्ज्वल क्षेत्र और / या प्रतिदीप्ति इमेजिंग बरकरार जीवों का उपयोग करने के लिए विधि प्रदान करते हैं. व्यक्तिगत ड्रोसोफिला लार्वा संवेदी न्यूरॉन्स में संकुचित नाइट्रोजन गैस के 7 साई (चित्रा 2B, 1 टेबल) और synaptotagmin.eGFP परिवहन के प्रतिदीप्ति छवियों का उपयोग कर रहे थे अधिग्रहण (चित्रा 2C) immobilized गया. समय चूक फिल्मों संवेदी न्यूरॉन्स (चित्रा 2 एफ) में चलती है और स्थिर synaptotagmin चिह्नित कार्गो दिखाया. औसत अग्रगामी और प्रतिगामी वेग Kym से मापा गया थाographs 0.92 ± 0.04 सुक्ष्ममापी / s और 1.00 ± 0.05 सुक्ष्ममापी / s क्रमशः (n = 6 जानवरों, n> 40 खंडों). ये परिवहन ले जाने synaptotagmin dissected ड्रोसोफिला मोटर दोनों (0.84 ± 0.05 सुक्ष्ममापी / s) anterogradely और (0.76 ± 0.03 सुक्ष्ममापी / एस) 22 प्रतिगमनपूर्वक चलती न्यूरॉन्स में मापा vesicles के वेग के बराबर हैं.
900 मीटर ऊंचाई के साथ इसी तरह के उपकरणों zebrafish लार्वा (चित्रा 2 डी, 1 टेबल) के विभिन्न चरणों स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया. अपनी प्रारंभिक विकास के चरणों के दौरान Zebrafish लार्वा अपनी पूंछ हर 10 से 15 सेकंड flips कर रहे हैं और आम तौर पर समाधान में या उच्च संकल्प इमेजिंग 23 के लिए बढ़ते मीडिया पर 0.02% tricaine (MS-222) का उपयोग immobilized. हमारे PDMS डिवाइस तेजी स्थिरीकरण के लिए एक वैकल्पिक साधन प्रदान करता है और उच्च संकल्प इमेजिंग 24 के दौरान ऑप्टिकल पथ में एक अविश्वसनीय बढ़ते मध्यम की जरूरत समाप्त. हम स्वयं 28-3 dechorionated0 HPF लार्वा और उन्हें एक PDMS 3 साई नाइट्रोजन गैस का उपयोग करने के लिए लार्वा दिल की धड़कन के समय चूक फिल्मों का अधिग्रहण डिवाइस में व्यक्तिगत immobilized. दिल की धड़कन की दर 136.8 मापा गया था ± मिनट (n = 8 फिल्मों) 1.6 प्रतिशत और अन्य प्रकाशित 25 रिपोर्टों के समान था.
हमारे सरल microfluidic डिवाइस पहले से ही जंगली प्रकार सी. में उप सेलुलर और सेलुलर घटनाओं की एक किस्म को मापने के लिए प्रदर्शन किया गया था 4 एलिगेंस. हमारे microfluidic डिवाइस, जंगली प्रकार सी. एलिगेंस synaptic vesicles कि जानवरों कि anesthetics immobilized का उपयोग कर रहे हैं की तुलना में न्यूरॉन्स में कदम के रूप में इस तरह के एक माल की बड़ी संख्या दिखाते हैं. हालांकि, हम हमारे उपकरणों उत्परिवर्ती पशुओं के लिए परीक्षण नहीं किया था देखने के लिए अगर इन निष्कर्षों को सही पकड़. इस परीक्षण के हम kinesin3 / UNC-104 आणविक मोटर, UNC 104 (e1265), कि पूर्व synaptic vesicles 26 transports में एक मजबूत hypomorphic उत्परिवर्ती का इस्तेमाल किया. हम GFP का प्रवाह :: RAB 3 चिह्नित vesi पूर्व synaptic की तुलना मेंपूर्वकाल चतनाशून्य करनेवाली औषधि में पार्श्व mechanosensory न्यूरॉन्स immobilized और डिवाइस में cles उत्परिवर्ती aniamls (चित्रा 3A) immobilized. पूर्व synaptic vesicles की फ्लक्स डिवाइस immobilized जानवरों में अधिक से अधिक प्रवाह के रूप में unc +१०४ 1 मिमी (चित्रा 3B, 3C) levamisole 27 में anesthetized जानवरों से प्राप्त आंकड़ों की तुलना में था. इससे पता चलता है कि इमेजिंग microfluidic उपकरणों में मजबूत परिवहन दोषपूर्ण म्यूटेंट डेटा इकट्ठा करने का एक अधिक कुशल साधन होने की संभावना है. हम यह भी पता चलता है कि URY न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की अन्य माल जैसे वृक्ष के समान परिवहन डिवाइस immobilized जानवरों में imaged किया जा सकता है (चित्रा 3, 3E). इस उपकरण में भी जल्दी सी. छवि के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस क्यू L1 पशुओं में neuroblast विभाजन के रूप में विकास. मूल्यांकन सेल करने के लिए दो बेटी कोशिकाओं QR.a और QR.p ~ 3 घंटा अंडे सेने के बाद (3F चित्रा) के साथ संगत फार्म विभाजित करने के लिए ली गईपहले 28 टिप्पणियों.
तालिका 1. प्रवाह चैनल (PDMS-1) और स्पेसर PDMS परत (PDMS-S) डिवाइस आयाम सी. में इस्तेमाल किया एलिगेंस और ड्रोसोफिला / zebrafish उपकरणों.
चित्रा 1 PDMS आनुवंशिक मॉडल जीवों के लिए microfluidic उपकरणों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) जीव प्रवाह चैनल में एक माइक्रो टिप का उपयोग कर भरी हुई है और संकुचित नाइट्रोजन गैस नियंत्रित का उपयोग कर एक नियामक और वाल्व का उपयोग immobilized. इस उपकरण में एक औंधा माइक्रोस्कोप में उज्ज्वल क्षेत्र / प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उपयुक्त है. डिजाइन एक 10 मिमी लंबे समय के प्रवाह (डिजाइन मैं, L1) चैनल और एक नियंत्रण चैनल (डिजाइन द्वितीय, L2) क्रमशः होते सी. के लिए (बी) एलिगेंस और / ड्रोसोफिला zebrafish लार्वा (सी). आयाम डिजाइन (बी और सी) पर संकेत कर रहे हैं. (डी, एफ, जी) variou के योजनाबद्धPDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS झिल्ली, PDMS-S और ग्लास) परतें एक सी में मौजूद है एलिगेंस, ड्रोसोफिला, और zebrafish स्थिरीकरण डिवाइस. (ई) थोक PDMS (PDMS-2) परत, एक स्पिन लेपित PDMS परत (PDMS-1) को दिखाने के लिए एक लचीला झिल्ली और एक स्पेसर PDMS परत (PDMS-S) जोड़ने के फार्म डिवाइस के एक क्रॉस सेक्शन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रवाह चैनल ऊंचाई (ड्रोसोफिला / zebrafish डिवाइस के लिए). पूरे ढांचे अचल एक ऑप्टिकल ग्रेड ग्लास कवर जीव (भूरे रंग में सर्कल) को समायोजित करने के लिए पर्ची के लिए बंधुआ है. योजनाबद्ध नियंत्रण चैनल 'h2' की ऊंचाई, प्रवाह चैनल 'h1', छिद्रित स्पेसर परत 'एस' और झिल्ली मोटाई 'मी' को इंगित करता है. (एच) नियंत्रण चैनल में दबाव में तरल स्तंभ की उपस्थिति में प्रवाह चैनल की ओर झिल्ली विक्षेपन बताता है. उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को एक मुफ्त (आई) और deflected झिल्ली (जे) के तहत शून्य दिखाया जाता है और 14 साई तरल स्तंभ क्रमशः दबाव. तीर और तीर सिर बुलबुला यू से संकेत मिलता हैnder और प्रवाह चैनल में झिल्ली क्रमशः. सी. (कश्मीर) क्रॉस अनुभागीय छवि एलिगेंस उपकरण स्थिरीकरण क्षेत्र के स्थान पर ले लिया है. स्केल बार 50 (कश्मीर) सुक्ष्ममापी और 200 सुक्ष्ममापी (मैं, जम्मू) है. Schematics (डी, एफ, जी) के पैमाने पर नहीं कर रहे हैं बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. इमेजिंग आनुवंशिक मॉडल जीवों एक microfluidic डिवाइस में immobilized. एक immobilized सी. के उज्ज्वल क्षेत्र छवि (ए) एलिगेंस, एक 1 instar ड्रोसोफिला (बी) एक PDMS microfluidic डिवाइस में और एक 30 HPF zebrafish लार्वा (डी) लार्वा. समय चूक jsIs609 इमेजिंग, एक सी Kymograph विश्लेषण एलिगेंस तनाव, एक पूर्वकाल एक युक्ति है immobil के पार्श्व mechanosensory न्यूरॉन (एएलएम) में एक mitochondrial मैट्रिक्स लक्षित GFP व्यक्तized जानवर (ई). अग्रगामी ('डाउन' तीर सिर), ('अप' तीर सिर) प्रतिगामी और स्थिर (स्टार 'चिह्न) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं kymograph में Mitochondria. (सी) के प्रतिदीप्ति छवि एक अक्षुण्ण 1 instar ड्रोसोफिला लार्वा. बॉक्स स्थान जहां syt.eGFP परिवहन के उच्च संकल्प इमेजिंग समय चूक एक cholinergic न्यूरॉन में किया जाता है को इंगित करता है. असेंबल पांच फ्रेम संख्या के साथ 5 हर्ट्ज पर अधिग्रहीत फ्रेम के प्रत्येक छवि और GFP चिह्नित कार्गो अग्रगामी, प्रतिगामी और असेंबल (एफ) में स्थिर के रूप में दिखाया पर संकेत दिया. (डी) में बॉक्स क्षेत्र है कि zebrafish लार्वा के दिल की धड़कन की दर की गणना के लिए नजर रखी थी इंगित करता है. स्केल बार 5 (एफ) सुक्ष्ममापी, 10 सुक्ष्ममापी (ई), 100 (ए, बी) सुक्ष्ममापी और 200 सुक्ष्ममापी (डी) के है.
चित्रा 3 सी. में सेलुलर और उप सेलुलर इमेजिंग. एलिगेंस PDMS microfluidic उपकरणों का उपयोग कर. (ए) एक चींटी के योजनाबद्धerior अग्रगामी और प्रतिगामी दिशाओं के साथ पार्श्व mechanosensory न्यूरॉन (ALM) के रूप में चिह्नित है. डॉटेड बॉक्स axonal परिवहन के लिए imaged क्षेत्र से पता चलता है. 5 fps पर 350 फ्रेम सेल शरीर (सीबी) के साथ बाईं तरफ सही और तंत्रिका अंगूठी (एनआर) पर एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन का उपयोग कर हासिल किया है. डेटा एक डिवाइस में immobilized जानवरों के लिए kymographs या 1 मिमी levamisole (सी) का उपयोग का उपयोग का विश्लेषण कर रहे हैं. अग्रगामी और प्रतिगामी दिशाओं में घूम रहा है 'नीचे' और 'ऊपर' की ओर इशारा करते हुए क्रमशः तीर का उपयोग कार्गो दिखाए जाते हैं. (बी) एक 20 ALM न्यूरॉन के 350 समय व्यतीत हो जाने के तख्ते पर सुक्ष्ममापी क्षेत्र में (e1265) unc 104 पशुओं में मनाया कणों के अग्रगामी और प्रतिगामी प्रवाह. (डी) एक URY छवि GFP के लिए इस्तेमाल किया न्यूरॉन के योजनाबद्ध ग्लूटामेट रिसेप्टर्स परिवहन के रूप में चिह्नित है. 350 समय चूक फ्रेम kymographs कि माल दिखाने के लिए PDMS डिवाइस में immobilized जानवरों में अग्रगामी और प्रतिगामी दिशाओं में चलती है या 1 मिमी levamisole (ई) का उपयोग में परिवर्तित कर रहे हैं. समय चूक क्यू neuroblast di दौरान अधिग्रहीत छवियोंदृष्टि और सी. के प्रारंभिक लार्वा चरणों में प्रवास एलिगेंस. (एफ) तीन समय चूक फ्रेम है कि मूल्यांकन के दौर से गुजर विभाजन दिखाने के फार्म करने के लिए अपनी बेटी की कोशिकाओं QR.a और QR.p. स्केल बार 5 सुक्ष्ममापी (सी, ई और एफ) है. डेटा (बी) में प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM (4). तुलना चतनाशून्य करनेवाली औषधि में प्राप्त मूल्यों के लिए सम्मान के साथ बना रहे हैं और द्वारा चिह्नित किया जाता है * (पी <0.05) और ** (0.005 <पी).
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Discussion
PDMS microfluidic उपकरणों ऑप्टिकली पारदर्शी है इसलिए किसी भी मॉडल / पारदर्शी पारदर्शी जीव के vivo इमेजिंग में उच्च संकल्प के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैं. हमारे डिजाइन बरकरार जीवित पशुओं में सेलुलर और उप सेलुलर घटनाओं की उच्च वृद्धि spatio-अस्थायी इमेजिंग के लिए उपयुक्त है. नरम लिथोग्राफी तकनीक का उपयोग कर Microfabrication मॉडल जीवों के विभिन्न आकार के लिए डिवाइस आयाम के आसान हेरफेर की अनुमति देता है. विभिन्न आकार के उपकरण सी. के विभिन्न चरणों के लिए गढ़े हैं एलिगेंस, ड्रोसोफिला लार्वा और zebrafish लार्वा. अपने प्रवाह परत चैनलों में 40 सुक्ष्ममापी और 80 सुक्ष्ममापी के विभिन्न ऊंचाइयों के साथ उपकरण सुधार स्थिरीकरण और दोनों जल्दी (L1) और बाद के बेहतर स्वास्थ्य के बाद इमेजिंग (L4 देर) सी. के चरणों दिखा क्रमशः एलिगेंस. हम डिवाइस के निर्माण में एक 100% सी. के लिए सफलता की दर को प्राप्त करने एलिगेंस और किसी भी दोषपूर्ण उपकरणों के बिना / ड्रोसोफिला zebrafish. उपकरणों तक कई बार इस्तेमाल किया जा सकता हैनियंत्रण चैनल धूल कणों या बैक्टीरियल वृद्धि के साथ दूषित है. डिवाइस सी. immobilized एलिगेंस दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पशुओं में अधिक से अधिक माल का प्रवाह जब anesthesized जानवरों की तुलना में दिखाते हैं. डिवाइस स्थिरीकरण ड्रोसोफिला 29 लार्वा के प्रारंभिक विकास चरणों के लिए विशेष रूप से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण विच्छेदन प्रोटोकॉल के लिए की आवश्यकता eliminates.
PDMS microfluidic उपकरणों में तात्कालिक स्थिरीकरण प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक समय को कम करने के रूप में आम तौर पर लंबे समय तक जोखिम बाह्य लागू anesthetics के लिए आवश्यक समय की तुलना में एक अंतर्निहित लाभ है. सभी immobilized जीवों 5-10 मिनट के भीतर deformable PDMS झिल्ली पर दबाव की रिहाई के बाद सामान्य हरकत लौटने के सी. एलिगेंस प्रवाह चैनल और स्थिरीकरण झिल्ली के मध्य भाग से दूर की सीमा पर स्थिर हैं. पशु प्रवाह चैनल के बीच में immobilized गरीबों के स्वास्थ्य के बाद immobiliza दिखानेtion और एक या दो दिन के भीतर मर जाते हैं. हमारे microfluidic युक्ति L4 मंच सी. रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस के लिए immobilized अपने स्वास्थ्य या बाद के विकास को प्रभावित किए बिना एक घंटे के लिए झिल्ली के तहत. कम समय (10 मिनट) के लिए immobilized पशु इमेजिंग के लिए कई बार फंस सकता है. सी. जल्दी विकास के चरणों के लिए, एलिगेंस लंबी अवधि के समय चूक प्रयोगों (~ 3 घंटा) के लिए थोड़ा कम दबाव (7 साई) के साथ immobilized थे. झिल्ली के बाद रिहाई के तहत immobilized पशु बीच समय में एक ही डिवाइस में छोड़ दिया गया. इन जानवरों को दोनों अपने विकास और सामान्य स्वास्थ्य में जंगली प्रकार तुलना कर रहे हैं. वयस्क सी. कम दबाव (7 साई) के साथ immobilized एलिगेंस उच्च संकल्प समय चूक प्रयोगों के दौरान धीमी बहाव से पता चला है और परिवहन विश्लेषण के लिए जटिल विश्लेषण उपकरण की आवश्यकता होती है. हालांकि कम दबाव के लिए क्यू neuroblast सेल / ~ 3 घंटे या अर्द्ध मात्रात्मक mitoch पर विभाजन प्रवास के रूप में लंबी अवधि के अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गयाondria परिवहन लक्षण वर्णन, प्रक्रियाओं है कि पूरा स्थिरीकरण की जरूरत नहीं है. स्थिरीकरण के इस प्रकार कम दबाव डेटा सेट है कि एकत्रित करने की जरूरत पर निर्भर करता है इस्तेमाल किया जा सकता है.
L4 सी. के समय चूक इमेजिंग एलिगेंस GFP की ऊबड़ - खाबड़ गति से पता चलता है ALM न्यूरॉन (jsIs609 तनाव) में mitochondria के रूप में चिह्नित अन्य मॉडल 30-32 सिस्टम में न्यूरॉन्स के लिए सूचित किया गया है. इन न्यूरॉन्स में कुछ mitochondria द्विदिश परिवहन चलता है, जबकि उनमें से अधिकांश फिल्म की अवधि पर स्थिर रहे हैं. हम सी. के मामले में 14 साई स्थिरीकरण दबाव का उपयोग जारी रखने प्रवाह में छोटे मतभेदों के बावजूद पूरा स्थिरीकरण प्राप्त और axonal परिवहन के उच्च संकल्प इमेजिंग समय व्यतीत हो जाने के दौरान किसी भी बहाव से बचने एलिगेंस. हम सुझाव है कि एक सामान्य प्रोटोकॉल में 14 साई का उपयोग कर और प्रयोगात्मक जरूरतों पर निर्भर करता है यह भी हो सकता है या बढ़ा जा सकता है की कमी हुई. पशु लगभग उसी समय सामान्य locomotio वापस लियाn दोनों निचले और उच्च स्थिरीकरण दबावों और immobilized जानवरों से स्थिरीकरण के बिना हो उन लोगों के लिए समान विकसित किया है.
युक्ति जब गढ़े स्पेसर परतों के साथ बड़ी आयामों का उपयोग कर बड़ा ड्रोसोफिला और zebrafish लार्वा के रूप में इस तरह के मॉडल जीवों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बरकरार 1 instar ड्रोसोफिला संवेदी न्यूरॉन्स में synaptotagmin.eGFP परिवहन की इमेजिंग अग्रगामी और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में सक्रिय परिवहन से पता चलता है. औसत डिवाइस immobilized लार्वा में मापा वेग उच्च dissected मोटर न्यूरॉन्स 22 में मापा मूल्यों की तुलना कर रहे हैं. इस अंतर हमारे प्रयोगों में डेटा की तेजी से अधिग्रहण (5 हर्ट्ज v / s हर्ट्ज 1.1-1.4), organelle परिवहन (संवेदी v / s मोटर न्यूरॉन्स) और / या विच्छेदन के कारण प्रभाव में न्यूरॉन विशेष अंतर से पैदा हो सकता है.
हमारे पूर्व प्रयोगों से बाहर किए गए विशेष रूप से जंगली प्रकार 4 पशुओं में, इस तरह हम निर्धारित चाहेmicrofluidic उपकरणों में इमेजिंग म्यूटेंट भी लाभप्रद था. समय चूक इमेजिंग सी. एलिगेंस L4 जानवरों से पता चलता है GFP की प्रवाह :: 1.0 मिमी levamisole में immobilized kinesin3/unc-104 म्यूटेंट में RAB 3 चिह्नित vesicles पूर्व synaptic है रूप में प्रवाह पशुओं में प्राप्त माप हमारे PDMS डिवाइस (3B चित्रा) का उपयोग immobilized की तुलना में कम है. हम अक्सर देखा है एक उदाहरण है कि (चित्रा 3C) म्यूटेंट में बहुत कम परिवहन अगर पशुओं चतनाशून्य करनेवाली औषधि सांद्रता कि जंगली जानवरों की तरह स्थिर immobilized का उपयोग कर रहे हैं मनाया जाता है दिखाने के लिए. unc 104 पशुओं में बढ़ vesicles की संख्या काफी अधिक है जब हम microfluidic उपकरणों का उपयोग है. Anesthetized जानवरों के समान परिवहन विशेषताओं को दिखाने जब 14psi PDMS झिल्ली (3B चित्रा) लागू दबाव के तहत रखा है. इसी प्रकार की टिप्पणियों को भी जंगली प्रकार 4 पशुओं में किया गया है. ये आंकड़े बताते हैं कि वृद्धि हुई प्रवाह im से पैदा होने की संभावना नहीं हैनाइट्रोजन के तहत जुटाना लेकिन एक प्रोटोकॉल है कि कम अंतर सेलुलर परिवहन के लिए हानिकारक था की वजह से है.
सिद्धांत रूप में, कैल्शियम गतिशीलता और कोशिकाओं के विभाजन के रूप में अन्य घटनाओं के सभी बरकरार लार्वा / ड्रोसोफिला zebrafish में imaged किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से. इमेजिंग डिवाइस immobilized जानवरों की वसूली के बाद कम जीव 4 व्यवहार्यता के लिए हानिकारक है और इस तरह इस तरह के उपकरणों को भी घटनाओं है कि लंबे समय तराजू पर होते हैं के लिए इमेजिंग आनुवंशिक मॉडल आनुवंशिक जीवों के लंबी अवधि के प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
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