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Bioengineering

Simples dispositivos microfluídicos para Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico livre

Abstract

Micro fabricados dispositivos fluídicos fornecer um micro-ambiente acessíveis para estudos in vivo sobre os organismos pequenos. Processos de fabricação simples estão disponíveis para dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia suave 1-3. Dispositivos microfluídicos têm sido utilizados para sub-celular de imagem 4,5, in vivo microcirurgia laser 2,6 e imagiologia celular 4,7. In vivo de imagem requer a imobilização dos organismos. Isto foi conseguido usando sucção 5,8, 6,7,9 canais cónicos, membranas deformáveis ​​2-4,10, com arrefecimento adicional de sucção 5, o gás anestésico 11, geles sensíveis à temperatura 12, 13 e cola de cianoacrilato, tais como anestésicos levamisole 14 de 15. Anestésicos comumente utilizados influenciar a transmissão sináptica 16,17 e são conhecidos por terem efeitos prejudiciais sobre a sub-celular de transporte 4 neuronal. Neste stUdy demonstramos uma membrana de base de poli-dimetil-siloxano dispositivo (PDMS) que permite a imobilização sem anestésico intactos organismos modelo genéticas tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila e larvas de larvas de peixe zebra. Estes organismos modelo são adequados para estudos in vivo em dispositivos microfluídicos devido às suas diâmetros pequenos e corpos opticamente transparentes ou translúcidas. Diâmetros de corpo variar de 10 a ~ uM ~ 800 uM para os primeiros estádios larvais de C. elegans e larvas do peixe-zebra e exigir dispositivos microfluídicos de tamanhos diferentes para atingir a imobilização completa de alta resolução de imagem time-lapse. Estes organismos são imobilizadas através de pressão aplicada por comprimido de gás de azoto através de uma coluna de líquido e visualizados utilizando um microscópio invertido. Animais libertados da armadilha retornar para locomoção normais dentro de 10 min.

Demonstramos quatro aplicações de lapso de tempo de imagem em C. elegansou seja, a imagem de transporte mitocondrial nos neurônios, pré-sináptica transporte vesicular em um transporte defeituoso mutante transporte receptor, glutamato e divisão celular Q neuroblastos. Os dados obtidos a partir de tais filmes mostram que a imobilização de microfluidos é um meio útil e precisa de adquirir dados in vivo de eventos celulares e subcelulares em comparação com animais anestesiados (Figura 1J e 3C F-4).

Dimensões do dispositivo foram alteradas para permitir lapso de tempo imagens de diferentes fases da C. elegans, primeiro larvas Drosophila e larvas de peixe-zebra. Transporte de vesículas marcadas com sinaptotagmina marcados com GFP (syt.eGFP) em neurônios sensoriais mostra movimento dirigido de marcadores das vesículas sinápticas expressos em colinérgicos neurônios sensoriais intactas em primeira larvas Drosophila estádio. Um dispositivo semelhante tem sido utilizada para a realização de lapso de tempo de imagem de pulsação em ~ 30 h pós-fertilização (hpf)Zebrafish larvas. Estes dados mostram que os dispositivos simples que desenvolvemos pode ser aplicada a uma variedade de sistemas modelo para estudar os fenómenos biológicos diversos celulares e de desenvolvimento in vivo.

Protocol

1. SU8 Fabricação Mestre

  1. Projetar as estruturas microfluídicos usando software Clewin e imprimi-lo usando 65.024 plotter laser de DPI com dimensão mínima de 8 m em circuito filme bordo.
  2. Limpar 2 cm x 2 cm com pastilhas de silício óxido nativo em KOH 20%, durante 1 minuto e enxaguar em água desionizada, um wafer de cada camada para o fluxo e a sua camada de controlo correspondente.
  3. Seque as peças com gás de azoto e desidratação em uma placa quente a 120 ° C durante 4 horas. Permitir que as peças de arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar para a próxima etapa.
  4. Coloque pedaços de silício, um de cada vez no mandril giratório e ligue o vácuo. Cobrir as superfícies de silício com 20 ul ~ hexametil-dissilazano (HMDS) e revesti-los utilizando um. SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos seguido de 3.000 rpm durante 30 seg
  5. Cubra completamente com wafers de silício de 1,5 mL de SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) e pastilhas de revestimento utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 2,000 rpm durante 30 segundos. Este protocolo de fiação produz uma espessura de ~ fotorresistência 40 um que seja adequado para o controlo e as camadas de escoamento para os primeiros estádios larvais de C. elegans.
  6. Spin-~ 1,5 ml SU8-2050 usando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 2,000 rpm durante 30 segundos para obter uma espessura de ~ photoresist uM 80 que é adequado para a fabricação da camada de fluxo para tardios estágios larvais de C. elegans, a camada de fluxo basal de Drosophila / zebrafish larvas e suas camadas de controle correspondente.
  7. Coloque os pedaços de silício na chapa quente com a camada SU8 revestido em cima. Cozer os pedaços de silício macio revestido a 65 ° C durante 1 min seguido de 95 ° C durante 10 min. Permitir que as peças de arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar para a próxima etapa.
  8. Coloque os pedaços de soft-cozidos de silício no palco de exposição com SU8-2025 sur revestidoface na parte superior voltada para a lâmpada UV. Use a máscara de foto com design I (L1, Figura 1B) e II design (L2, Figura 1B) para a camada de fluxo e padrão de camada de controle, respectivamente, para os primeiros estágios larvais de C. elegans. Coloque a máscara foto no topo da camada de SU8 e assegurar a máscara é plana contra a camada de revestimento. Abra o obturador da lâmpada UV e expor os soft-cozidos SU8 wafers de 200 Watt lâmpada UV através da máscara de fotos para 15 seg.
  9. Utilize a máscara fotográfica com desenho I (L1, Figura 1B) e II da concepção (L2, Figura 1B) em SU8-2050 pedaços revestidos (preparado no passo 1.6) para fabricar a camada de fluxo de controle e camada final para as fases larvares de C. elegans. Utilize a máscara foto com o desenho I (L1, Figura 1C), e II da concepção (L2, Figura 1C), para a camada de fluxo de base e da camada de controlo, respectivamente, para Drosophila / zebrafish larvas em pastilhas revestidas com SU8-2050 (preparado in passo 1.6). Expor as superfícies SU8 através da máscara foto à lâmpada UV 200 Watt durante 15 segundos.
  10. Colocar as peças de silício exposto sobre uma placa quente com a camada de revestimento na parte superior. Mensagem cozer as bolachas a 65 ° C durante 1 min seguido de 95 ° C durante 10 min. Permitir que as peças para arrefecer antes de prosseguir para o passo seguinte.
  11. Desenvolver as peças usando a solução de revelação SU8 durante 20 min. Lavar as peças em álcool isopropílico (IPA) e explodir com gás nitrogênio seco.
  12. Colocar as peças de silício em um exsicador com o padrão SU8 no topo. Cubra os pedaços com 50 ul de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor num exsicador durante 2 h.

Precauções: Tome precauções de segurança para a manipulação de produtos químicos durante KOH tratamento, revestimento fotorresiste e em desenvolvimento. Revestimento de vapor de silano deve ser realizada dentro de um secador em uma área ventilada. Proteja SU8 resistir de excesso de exposição à luz. Use óculos de proteção com uma lig UVfonte ht.

2. PDMS fabricação de moldes

  1. Prepare 10:01 PDMS pela combinação de 50 g de base de Sylgard 184 com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misturar o conteúdo manualmente para ~ 3 min. Desgaseificar a mistura dentro de um dessecador para remover todas as bolhas de ar formadas durante a mistura.
  2. Despeje uma mistura de 5 milímetros de espessura PDMS sobre as pastilhas de silício com SU8 padrão de design II, para a camada de controle, com cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. No caso de as bolhas se formam durante o vazamento, desgaseificar o PDMS no padrão SU8 em baixo vácuo para remover todas as bolhas.
  3. Coloque as bolachas de silício com SU8-2025 padrão de projeto que eu, para a camada de fluxo, em mandril giratório e ligue o vácuo para mantê-los. Cobrir as placas com ~ 1 ml de mistura de PDMS e revestir as placas utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 1,500 rpm durante 30 segundos.
  4. Casaco ~ 1 ml mistura PDMS em placas de silício com a 80 uM SU8-2050 padrão de desenho I (L1, Figura 1B), para acamada de fluxo para final estágios larvais de C. elegans usando o spinner SPIN150 a 500 rpm durante 5 segundos, seguido por 1000 rpm durante 30 segundos. Casaco de uma espessa camada de mistura de PDMS sobre as peças de silício com SU8-2050 padrão de fluxo de camada de desenho I (L1, Figura 1C), para Drosophila / larvas de peixe zebra, utilizando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 35 segundos.
  5. Asse PDMS peças de silício revestido de projeto que eu e bolachas com correspondente projeto II para controle de camada contendo PDMS para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas em um forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 6 horas.
  6. Cortar a peça PDMS do substrato de silício contendo o SU8 padrão II para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas usando uma lâmina afiada. Perfurar um furo de pequeno diâmetro de ~ 1 mm na parte superior do reservatório de ligar a armadilha principal no molde PDMS utilizando um perfurador de Harris.
  7. Coloque o bloco perfurado PDMS (contendo o molde 40 um de espessura para o controlocamada L2) num tabuleiro de plástico, com o lado da camada moldada de controle para cima. Colocar a placa de silício revestido de PDMS contendo os 40 um desenho SU8 espesso I na mesma bandeja, com a superfície revestida voltada para cima PDMS. Introduza o tabuleiro no interior da câmara de plasma limpo e ligar o vácuo durante 2 min. Subsequentemente, ligar a energia do plasma e reduzir a pressão da câmara até a câmara fica rosa claro na cor. Expor ambas as superfícies a 18 Watt ar plasma sob baixo vácuo durante 2 min.
  8. Coloque o bloco perfurado PDMS removidos dos 80 mm de espessura SU8 mestre contendo padrão II para final estágios larvais de C. elegans ou Drosophila / zebrafish larvas numa bandeja de plástico, com o lado da camada moldada de controle para cima. Coloque o spin camada correspondente cozido PDMS revestido na pastilha de silício contendo 80 mm de espessura projeto eu para mais tarde C. elegans etapas ou Drosophila / larvas de peixe zebra, simultaneamente, na mesma bandeja com a parte plana PDMS revestido surface voltado para cima. Usar o mesmo protocolo acima mencionado de os expor ao ar plasma.
  9. Coloque as duas superfícies tratadas por plasma C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas, juntamente com uma ligeira pressão e assar no forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 2 horas.
  10. Corte os dispositivos ligados a partir do substrato de silício com SU8 projeto que eu para C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish larvas. Os orifícios de acesso de perfurador em reservatórios de entrada e saída do canal de fluxo.
  11. Coloque o molde PDMS ligado em uma bandeja de plástico para C. elegans, com o lado do desenho moldado camada de fluxo para cima. Lamínula limpa vidro (22 X 22 mm, espessura n º 1) e colocá-lo na mesma bandeja de plástico. Insira a bandeja contendo PDMS molde e deslizamento tampa de vidro no interior da câmara de plasma. Expor a superfície de PDMS parte inferior do dispositivo de deslizamento e tampa de vidro a 18 Watt de plasma de ar a baixa pressão durante 2 min. Coloque as duas superfícies de plasma tratados com gentle pressão e assar no forno de convecção de ar quente a 50 ° C durante 2 horas.
  12. Armazenar o dispositivo num ambiente limpo para uso futuro.

3. Etapas adicionais para Drosophila / Zebrafish Dispositivo

  1. Expor a superfície de vidro limpo de tamanho 2 cm x 2 cm com 50 ul de tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano vapor num exsicador durante 2 h.
  2. Spin-~ 1 ml de 10:1 mistura PDMS, preparado no passo 2.1 na superfície de vidro silanizada usando SPIN150 giratório a 500 rpm durante 35 segundos. Coza os PDMS substratos de vidro revestidos num forno de ar quente a 50 ° C durante 6 horas, com a superfície revestida voltada para cima. Permitir que a camada de PDMS-se arrefecer até à temperatura ambiente antes de prosseguir para o passo seguinte.
  3. Soco a camada revestida utilizando um perfurador de metal construído sob encomenda afiado no meio do PDMS, para formar a camada de espaçador PDMS. A forma do perfurador de metal é concebido similar ao desenho do fluxo de Drosophila / peixe-zebra (L1, Figura 1C
  4. Expor a camada de espaçador PDMS eo single-ligado bloco (camada de fluxo e camada de controle, feita no passo 2,9 para Drosophila / zebrafish larvas) para 18 Watt ar mais limpo utilizando plasma plasma em baixo vácuo. Coloque as duas superfícies de plasma tratadas em conjunto e cozê-los num forno de ar quente a 50 ° C durante 2 horas.
  5. Cortar o dispositivo ligado a partir do vidro, os orifícios de acesso de perfuração nos reservatórios de entrada e de saída e de ligação a uma lamela de vidro (22 X 22 mm, espessura No. 1), utilizando um aspirador de plasma, como mencionado no passo 2.11. Isto produziria um dispositivo de imobilização por larvas de primeiro instar de Drosophila, com uma altura de canal de ~ 500 mm. Para larvas do peixe, duplicar o espaçador PDMS processo de fabricação de camada com um passo de ligação adicional. A dupla camada de PDMS-S produz uma altura de canal de 900 | iM durante 30 larvas de peixe-zebra HFP.

Precauções: Evite as partículas de poeira durante a fabricação do dispositivo. Dois plasma de superfície limpas necessita de ser completamente livre de poeira para a ligação adequada. Armazenar os dispositivos num exsicador em situações em que uma sala limpa especial não está disponível a fim de minimizar a acumulação de partículas de pó nos dispositivos.

4. Usando PDMS Membrana

  1. Conectar uma extremidade de um tubo de micro-flex (diâmetro interno ~ 1,6 mm, diâmetro externo ~ 4,8 mm) a um regulador de pressão de abastecimento de gás de azoto e a outra extremidade para o reservatório de armadilha principal através de uma agulha de calibre 18 (diâmetro externo ~ 1,25 mm) colado ao tubo. Uma torneira de 3 vias utilizadas no meio do tubo de ligação permite que a aplicação ou a libertação da pressão sobre a membrana.
  2. Encher o tubo conectado ao dispositivo de PDMS com uma coluna de 10 cm de água destilada, antes de o ligar ao reservatório da armadilha principal de um C. elegans e / ou Drosophila / zebrafish dispositivo larvas.
  3. Girar a válvula da fonte de azoto de 14 psi ler e monitorizar a membrana da armadilha principal deflexão no sentido thcanal de fluxo e a baixa ampliação de um microscópio invertido. Comprimento da coluna de água no tubo de micro-flex é comprimida quando a torneira de passagem de 3 vias está aberta. Bordas da membrana desviada são visíveis em luz transmitida (Figura 1I e 1J). Deflexão da membrana provocam o deslocamento de partículas de poeira / bolhas sob a membrana PDMS e empurra-los para as fronteiras de canal.
  4. Espere até que o líquido enche a frente de microcanais completamente sem qualquer ar aprisionado.
  5. Libertar a pressão, utilizando a torneira de passagem de 3 vias para relaxar a membrana para a sua posição de repouso.

5. Inserindo C. elegans, Drosophila e Zebrafish larvas no dispositivo e imobilizando-os sob a membrana PDMS flexível

  1. Encher o canal de fluxo com tampão M9 [3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O a 1 L, esterilizar por autoclaving] para C. elegans 18 ou 1X PBS [8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4, H 2 O a 1 L, esterilização em autoclave] para Drosophila / 19 larvas de peixe-zebra, durante 10 min antes de uma experiência.
  2. Localize uma única C. elegans de estágio obrigatório em uma placa NGM 18 (ou primeiro larvas Drosophila da placa de ágar ovo ou manualmente dechorionated 30 larvas do peixe hpf em meio líquido 20) usando um microscópio estéreo baixo ampliação. Escolher um único animal usando um pequeno volume de solução tampão para uma ponta de micro. Utilizar uma ponta de micro corte com a sua extremidade para acomodar o maior ou Drosophila zebrafish larvas em tampão.
  3. Empurrar o único organismo através da entrada do canal de fluxo. Ajuste a pressão de pipetagem para posicionar o animal individual sob a armadilha principal.
  4. Aumentar a pressão da membrana PDMS lentamente para posicionar o animal contra a channel limite e imobilizá-lo, com 14 psi de pressão de C. elegans, 7 psi para Drosophila e 3 psi para larvas do peixe.
  5. Posicionar o animal imobilizado no centro do campo de vista microscópico. Use um microscópio invertido em configurações desejadas para o campo de alta resolução brilhante ou imagens de fluorescência. Adquirir um ou lapso de tempo imagens de fluorescência na taxa de quadros predefinido.
  6. Solte a pressão armadilha e monitorar a locomoção do animal por 5-10 minutos em baixa ampliação.
  7. Lave o animal e inserir um animal fresco para repetir os passos acima.
  8. Lave todos os animais do reservatório de resíduos, utilizando água destilada aplicado utilizando uma seringa. Seca-se o canal empurrando ar utilizando uma seringa para reutilização futura.

Precauções: Animais que requerem maior pressão de pipetagem para correr dentro do canal principal tendem a mostrar locomoção ruim / saúde após o lançamento da armadilha e deve ser evitado por imaging. Limpar o canal de fluxo para qualquer traço de solução tampão para evitar o entupimento do canal por cristais. Se o óleo é usado para geração de imagens de alta resolução, limpar a lâmina de cobertura de vidro para ser capaz de manter um bom sinal-ruído para as experiências subsequentes.

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Representative Results

O dispositivo de imobilização é um bloco de PDMS bicamada fabricadas por colagem de duas camadas: uma camada de fluxo (camada 1) e uma camada de controlo (camada 2), como mostrado na Figura 1. A armadilha principal está ligada a um cilindro de gás de azoto através de um regulador e uma torneira de 3 vias para aplicar pressão (3-14 psi) necessário para a membrana através de uma coluna de líquido (Figura 1A). A membrana é desviado imobiliza C. elegans, Drosophila ou zebrafish larvas no canal de fluxo concebidos com dimensões diferentes (Figura 1B e 1C). Foto máscaras são usadas para projetar camadas de dispositivos de imobilização com geometrias diferentes para C. elegans (Figura 1D), Drosophila larvas (Figura 1F) e larvas de peixe zebra (Figura 1G). A altura do canal de fluxo na camada (h1 na Figura 1E, 1K) foi variada utilizando velocidades de rotação diferentes de revestimento para acomodar ouganisms de diâmetros diferentes no interior do canal de fluxo. Altura das camadas de fluxo foram fabricados a 40 um, 80 um, 500 um e 900 | iM para C. estágios larvais elegans, adulto C. elegans, primeiro larvas de Drosophila e larvas de peixe-zebra, respectivamente (Tabela 1). O dispositivo, com uma altura de canal de fluxo de 40 um é apropriado de L1 a L4 precoce C. larvas elegans. Um dispositivo com uma altura de 80 ^ M do canal de fluxo é utilizada para as larvas L4 tarde e C. adulto elegans quando a vulva começa a sobressair. Os dispositivos maiores zebrafish também pode ser usado para mais larvas de Drosophila. A espessura da membrana PDMS (m) foi fabricado a 40 um e 300 um para C. elegans e Drosophila / zebrafish dispositivos respectivamente. A altura do canal microfluídico em camada 2 foi fabricada a 40 um para os primeiros estádios larvais de C. elegans e 80 mm para final estágios larvais de C. elegans e Drosophila/ Larvas do peixe. A altura do canal de fluxo, membrana e canal de controlo foram medidos em vários dispositivos fabricados em lotes independentes e foram considerados consistentes dentro de ± 5 mm uma da outra. O dispositivo utiliza uma técnica de deflexão da membrana (Figura 1 H-J), para imobilizar os organismos no canal de fluxo.

Organismos Fluxo de canal (PDMS-1) Girar condições para canal de fluxo Espaçador PDMS (PDMS-S) Condições de spin para espaçador PDMS Imobilização pressão (psi)
C. elegans (L1 a L4 precoce) 40 um (SU8-2025) 500 rpm (5 segundos), 2000 rpm (30 sec) NA NA 14
C. elegans (L4 final e adultos) 80 μ m (SU8-2050) 500 rpm (5 segundos), 2000 rpm (30 sec) NA NA 14
Drosophila (primeiro estádio) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 segundos), 2000 rpm (30 sec) 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sec) 7
Zebrafish (30 hpf) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 segundos), 2000 rpm (30 sec) 2X 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sec) 3

As dimensões da tabela 1. Do dispositivo do canal de fluxo (PDMS-1) e do espaçador PDMS camada (PDMS-S) utilizado em C. elegans e Drosophila / zebrafish dispositivos.

C. elegans larvas L4 foram imobilizadas no canal 80 uM dispositivo microfluídico altura PDMS utilizando 14 psi de gás de azoto (Figura 2A). Time-lapse de fluorescência imagens were adquirido à velocidade de 2 quadros por segundo (fps), utilizando uma objectiva 60X (abertura numérica 1,4, objectiva de óleo) para a imagiologia de transporte de mitocôndrias visualizadas utilizando uma matriz mitocondrial alvo GFP em neurónios de toque do receptor 21. Todos os 400 quadros foram convertidos para kymographs usando ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) e das mitocôndrias foram classificados como anterogradamente dirigida (para longe do corpo celular), dirigido retrogradamente (na direcção do corpo celular) ou estacionária (Figura 2E). Observamos transporte mitocondrial de até 21 psi de pressão de imobilização, mas o fluxo foi um pouco maior para a pressão mais baixa de imobilização. O fluxo anterógrada e retrógrada das mitocôndrias foram medidos de 1,1 ± 0,23 e 1,6 ± 0,22, enquanto que a 7 psi 0,8 ± 0,25 e 1,2 ± 0,34 a 14 psi de pressão de imobilização. Os valores não foram estatisticamente diferentes entre 1,1 ± 0,33 e 1,3 p &lusmn; 0,42 obtidos de animais imobilizado com três levamisol mM (valor de p> 0,45, n = 30 animais).

Os dispositivos maiores, com 500 uM de altura pode ser usada para imobilizar primeira larvas de Drosophila (Figura 2B) e 28-30 hpf larvas do peixe (Figura 2D). Dissecção da primeira larvas Drosophila estádios pode ser desafiador. Em contraste dispositivos microfluídicos proporcionar um método para realizar alta resolução campo brilhante e / ou de imagiologia por fluorescência utilizando organismos intactos. Larvas de Drosophila indivíduo foram imobilizadas usando 7 psi de gás de azoto comprimido (Figura 2B, Quadro 1) e as imagens de fluorescência de transporte synaptotagmin.eGFP em neurónios sensoriais foram adquiridas (Figura 2C). Time-lapse filmes mostraram carga sinaptotagmina movimento e parado marcada nos neurônios sensoriais (Figura 2F). Velocidade anterógrada e retrógrada média foi medida a partir kymographs para ser 0,92 ± 0,04 ^ M / s e 1,00 ± 0,05 uM / s, respectivamente (n = 6 animais, n> 40 segmentos). Estes são comparáveis ​​às velocidades de vesículas de transporte que transportam a sinaptotagmina medidos em dissecados neurónios motores de Drosophila que se deslocam ambos anterógrada (0,84 ± 0,05 um / s) e retrogradamente (0,76 ± 0,03 ^ M / s) 22.

Dispositivos semelhantes com 900 mM foram altura usada para imobilizar diferentes fases de larvas de peixe-zebra (Figura 2D, a Tabela 1). Larvas de peixe-zebra, durante as suas fases juvenis inverte a sua cauda a cada 10 segundos a 15 e são geralmente imobilizado utilizando tricaina 0,02% (MS-222), em solução ou em suportes de montagem para alta resolução de imagem 23. O nosso dispositivo PDMS fornece um meio alternativo para a imobilização rápida e elimina a necessidade de um meio não confiável montagem no trajecto óptico durante a alta resolução de imagem 24. Nós manualmente dechorionated 28-30 larvas hpf e imobilizada-los individualmente em um dispositivo de PDMS utilizando gás nitrogênio 3 psi para adquirir time-lapse filmes de batimentos cardíacos larval. A taxa de pulsação foi medido como sendo 136,8 ± 1,6 por min (n = 8 filmes) e era semelhante a outros relatórios publicados 25.

A nossa simples dispositivo microfluídico já tinha sido demonstrada para a medição de uma série de eventos celulares e sub-celular do tipo selvagem em C. elegans 4. No nosso dispositivo micro, selvagem tipo C. elegans mostrar um maior número de cargas, tais como vesículas sinápticas em neurónios que se movem em relação aos animais que são imobilizadas usando anestésicos. No entanto, não havia testado os nossos dispositivos de animais mutantes para ver se estes resultados são verdadeiras. Para testar isto foi utilizado um mutante forte hypomorphic no kinesin3 / UNC-104 motor molecular, unc-104 (e1265), que transporta os pré-sinápticas vesículas 26. Comparou-se o fluxo de GFP :: RAB-3 marcado pré-sináptica vesiculos na lateral anterior em neurónios mecanosensorial anestésico imobilizadas e dispositivo imobilizado aniamls mutantes (Figura 3A). Fluxo de vesículas pré-sinápticas de fluxo foi maior em animais do dispositivo imobilizados, em comparação com os dados adquiridos a partir de unc-104 animais anestesiados em 1 mM de levamisole (Figura 3B, 3C) 27. Isto demonstra que mutantes de imagens fortes transporte defeituosos em dispositivos microfluídicos é provável que seja um meio mais eficiente de recolha de dados. Mostramos também que outro transporte de carga dendrítica por exemplo, dos receptores de glutamato em neurônios URY podem ser visualizados em animais imobilizados dispositivo (Figura 3D, 3E). O dispositivo também pode ser utilizado para processos de imagem celulares durante o início de C. elegans desenvolvimento, tais como Q divisão neuroblastos em animais de L1. A célula QR foi fotografada para dividir para formar duas células filha QR.a e QR.p ~ 3 horas após a eclosão (Figura 3F) consistente comobservações anteriores 28.

As dimensões da tabela 1. Do dispositivo do canal de fluxo (PDMS-1) e do espaçador PDMS camada (PDMS-S) utilizado em C. elegans e Drosophila / zebrafish dispositivos.

Figura 1
Figura 1. Esquema de representação de dispositivos microfluídicos para PDMS organismos modelo genético. (A) O organismo é carregado usando uma ponta de micro para dentro do canal de fluxo e imobilizados utilizando gás comprimido azoto controlada usando um regulador e uma válvula. O dispositivo é adequado para imagiologia de campo / fluorescência num microscópio invertido. O desenho consiste em um canal de escoamento de 10 mm de comprimento (I desenho, L1) e um canal de controlo (design II, L2), respectivamente, para C. elegans (B) e Drosophila / larvas de peixe zebra (C). As dimensões estão indicadas no desenho (B e C). (D, F, G) Esquema de various camadas de PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membrana PDMS-S e vidro) presente numa C. elegans, Drosophila e zebrafish dispositivo de imobilização. (E) Representação esquemática de um corte transversal do dispositivo mostrando a maior parte da camada de PDMS (PDMS-2), uma rotação revestido PDMS camada (PDMS-1) para formar uma membrana flexível e um espaçador PDMS camada (PDMS-S) para adicionar altura do canal de fluxo (por Drosophila / zebrafish dispositivo). Toda a estrutura está ligada irreversivelmente a um grau lamínula de vidro óptico para acomodar o organismo (círculo na cor marrom). O esquema indica a altura de 'h2' o canal de controle, 'h1' fluxo de canal, camada de espaçador perfurado 's' e membrana espessura 'm'. (H) Indica a deflexão da membrana em direcção ao canal de fluxo, na presença de coluna de líquido sob pressão no canal de controlo. As imagens de campo brilhante são mostrados de uma membrana livre (I) e desviada (J), sob a zero e 14 psi pressurizado coluna de líquido, respectivamente. A seta e cabeça de seta indicam bolha under e para fora da membrana do canal de fluxo, respectivamente. (K) imagem da secção transversal da C. dispositivo elegans tomada no local da área de imobilização. Barra de escala é 50 mm (K) e 200 uM (I, J). (D, F, G) Schematics não estão à escala. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Organismos modelo de imagem genéticos imobilizada num dispositivo de microfluidos. Imagem de campo claro de um imobilizado C. elegans (A), um primeiro larvas de Drosophila (B) e um 30 hpf larvas do peixe (D) em um dispositivo micro PDMS. Análise quimógrafo de lapso de tempo de imagem de jsIs609, um C. elegans, estirpe que expressa uma GFP matriz mitocondrial alvo de uma anterior laterais mecanosensorial neurónio (GAP) de um dispositivo de immobilized animal (E). As mitocôndrias são classificados como anterógrada ('down' cabeça de seta), retrógrada ('up' cabeça de seta) e estacionários ("estrela" marca) no quimógrafo. (C) imagem de fluorescência de um primeiro estádio intacto larva Drosophila. A caixa indica o local onde a alta resolução de imagem de lapso de tempo de syt.eGFP o transporte é realizado em um neurónio colinérgico. Montagem de cinco quadros adquiridos em 5 Hz com números de quadro indicado em cada imagem e carga GFP marcada mostrado como anterógrada, retrógrada e estacionária na montagem (F). A caixa em (D) indica a área que foi monitorado para calcular a frequência de pulsação de larvas de peixe-zebra. Barra de escala é de 5 ^ m (F), 10 um (E), 100 um (A, B) e 200 uM (D).

Figura 3
Figura 3. Imagiologia celular e sub-celular em C. elegans usando dispositivos microfluídicos PDMS. (A) Esquema de uma formigaerior laterais mecanosensorial neurônio (ALM) com as direções anterógrada e retrógrada marcado. A caixa pontilhada mostra a região fotografada para o transporte axonal. 350 quadros são adquiridos utilizando um microscópio confocal de disco giratório com 5 fps corpo celular (CB) sobre o anel para a direita e do nervo (NR), à esquerda. Os dados são analisados ​​utilizando kymographs para animais imobilizados num dispositivo ou usando 1 mM de levamisole (C). Carga se movendo em direções anterógrada e retrógrada são mostrados usando setas apontando "para baixo" e "para cima", respectivamente. (B) O fluxo anterógrado e retrógrado de partículas observadas em unc-104 (e1265) animais em uma região de 20 mM do neurônio ALM mais de 350 quadros de lapso de tempo. (D) Esquema de um neurônio URY utilizado para a imagem GFP marcado transporte receptores de glutamato. 350 time-lapse quadros são convertidos em kymographs que mostram movimentação de cargas nas direções anterógrada e retrógrada em animais imobilizados no dispositivo PDMS ou usando um levamisol mM (E). Lapso de tempo imagens adquiridas durante neuroblastos Q divisão e migração nos primeiros estágios larvais de C. elegans. (F) Três lapso de tempo quadros que mostram a divisão passando QR para formar sua filha células QR.a e QR.p. Barra de escala é 5 mm (C, E e F). Dados representados em (B) é a média ± SEM (n> 4). As comparações são feitas com respeito aos valores obtidos no anestésico e denotado por * (p <0,05) e ** (p <0,005).

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Discussion

Dispositivos PDMS microfluidicos são opticamente transparentes, por conseguinte, pode ser utilizado em alta resolução em imagiologia in vivo de qualquer organismo modelo transparente / translúcida. Nosso projeto é adequado para alta de ampliação de imagem espaço-temporal de eventos celulares e sub-celular em intactas animais vivos. Microfabricação utilizando técnicas de litografia suave permite uma fácil manipulação de dimensões do dispositivo para vários tamanhos de organismos modelo. Dispositivos de vários tamanhos são fabricados por diferentes estádios de C. elegans, as larvas Drosophila e larvas de peixe-zebra. Dispositivos com diferentes alturas de 40 um e 80 um em seus canais de camada de fluxo mostram imobilização melhorou e melhor saúde pós-imagem de ambos precoce (L1) e mais tarde (L4 tarde) Ciclo de C. elegans, respectivamente. Alcançamos uma taxa de sucesso de 100% na fabricação de dispositivos para C. elegans e Drosophila / zebrafish sem quaisquer dispositivos defeituosos. Dispositivos podem ser usados ​​várias vezes até queo canal de controlo está contaminado com partículas de poeira ou o crescimento bacteriano. Dispositivo imobilizado C. elegans mostrar fluxo maior de carga em ambos os selvagens e animais mutantes quando comparados com animais anestesiados. Imobilização dispositivo elimina a necessidade de protocolos de dissecção tecnicamente exigentes, especialmente para as fases iniciais de desenvolvimento da Drosophila larvas 29.

Protocolos de imobilização instantâneas em dispositivos PDMS microfluídicos têm uma vantagem inerente de diminuir o tempo experimental, em comparação com os tempos de exposição mais longos, tipicamente exigidos para anestésicos aplicados externamente. Todos os organismos imobilizados voltar a locomoção normal dentro de 5-10 minutos após a libertação da pressão sobre a membrana deformável PDMS. C. elegans são imobilizadas no limite do canal de escoamento e para longe da parte central da membrana de imobilização. Animais imobilizados no meio do canal de fluxo apresentam problemas de saúde pós-imobilizaçãoção e morrer dentro de um dia ou dois. O nosso dispositivo micro tenha sido usada para manter L4 fase C. elegans imobilizado por até uma hora, sob a membrana, sem afectar a sua saúde ou desenvolvimento subsequente. Animais imobilizados por períodos mais curtos (até 10 minutos) pode ser preso várias vezes para a imagiologia. Para os primeiros estágios de desenvolvimento, C. elegans foram imobilizados com uma pressão um pouco mais baixa (7 psi) de longo prazo de lapso de tempo experimentos (~ 3 horas). Animais imobilizados sob a membrana pós-libertação ficaram no mesmo dispositivo de intervalo de tempo. Estes animais são comparáveis ​​aos de tipo selvagem tanto no seu desenvolvimento e da saúde em geral. Adulto C. elegans imobilizadas com menor pressão (7 psi) mostrou deslocamento lento de alta resolução durante lapso de tempo experimentos e requerem ferramentas de análise complexos para análise de transporte. No entanto as pressões mais baixas foram utilizados para realizar estudos de longo prazo, tais como a divisão celular dos neuroblastos Q / migração durante ~ 3 horas ou semi quantitativa mitochondria caracterização transporte; processos que não necessitam de imobilização completa. Assim, as pressões mais baixas de imobilização pode ser utilizado, dependendo do conjunto de dados que tem de ser recolhido.

Lapso de tempo de imagem de L4 C. elegans mostra movimento saltatória da GFP marcado mitocôndrias no neurônio ALM (cepa jsIs609) como foi relatado por neurônios em outros sistemas modelo 30-32. Alguns mitocôndrias nesses neurônios mostram transporte bidirecional enquanto que a maioria deles estão parados ao longo da duração do filme. Apesar das pequenas diferenças no fluxo continuamos utilizando 14 psi de pressão de imobilização em caso de C. elegans para obter a imobilização completa e evitar qualquer desvio durante a alta resolução de imagem time-lapse do transporte axonal. Sugerimos usando 14 psi num protocolo geral, e dependendo das necessidades experimentais este pode ser aumentada ou diminuída. Animais levou quase o mesmo tempo para voltar ao normal, locomotion a partir de ambas as pressões de imobilização inferiores e superiores e animais imobilizados desenvolvido de forma idêntica para as células cultivadas sem imobilização.

O dispositivo, quando fabricados usando dimensões maiores, com camadas separadoras podem ser usados ​​para maiores organismos modelo tais como Drosophila e larvas de peixes-zebra. Imagem de synaptotagmin.eGFP transporte em intactas primeiro neurônios sensoriais estádio Drosophila mostra transporte ativo em direções anterógrada e retrógrada. As velocidades médias medidas em larvas dispositivo imobilizado são maiores comparados com os valores medidos nos neurónios motores dissecados 22. Essa diferença pode resultar de rápida aquisição de dados nas nossas experiências (5 hz v / s 1,1-1,4 Hz), específica para neurónios diferenças de transporte organela (sensorial v / s neurónios motores) e / ou os efeitos devidos à dissecação.

Nossas experiências anteriores foram realizados exclusivamente em animais selvagens 4, assim, verificou-se semutantes de imagem em dispositivos microfluídicos foi também vantajosa. Lapso de tempo de imagem de C. elegans L4 animais mostra reduzido fluxo de GFP :: RAB-3 marcadas vesículas pré-sinápticas no kinesin3/unc-104 mutantes imobilizados em 1,0 mM de levamisole, em comparação com medições de fluxo obtidos nos animais imobilizados usando o nosso dispositivo PDMS (Figura 3B). Temos muitas vezes observado e mostram um exemplo (Figura 3C), que em mutantes muito pouco transporte é observada quando os animais são imobilizados utilizando-se concentrações anestésicas que imobilizam os animais de tipo selvagem. Os números de vesículas que se deslocam em unc-104 animais é significativamente mais elevada quando se usam dispositivos microfluidicos. Animais anestesiados mostram características de transporte semelhantes quando colocado sob pressão 14psi aplicada à membrana PDMS (Figura 3B). Observações semelhantes foram também realizados em animais de tipo selvagem 4. Estes dados sugerem que o aumento do fluxo não é provável que surja a partir de immobilização em azoto, mas devido a um protocolo que foi menos prejudicial para o transporte intra-celular.

Em princípio, outros eventos, como a dinâmica do cálcio e divisão celular podem ser visualizados em larvas Drosophila / zebrafish intacta também. Pós-imagem do dispositivo de recuperação dos animais imobilizados é menos prejudicial para a viabilidade organismo 4 e, portanto, esses dispositivos também podem ser usados ​​para executar a longo prazo de imagens de organismos modelo genéticos genéticos para eventos que ocorrem ao longo de escalas de tempo mais longos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Krishanu Ray para ações de Drosophila, Tarjani Agarwal para a manutenção de uma gaiola Drosophila, Peter Juo para nuIs25 e CGC para C. estirpes elegans. SPK jsIs609 feito em laboratório de Michael Nonet. Agradecemos Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por sua ajuda na lapso de tempo de imagem do transporte de mitocôndrias jsIs609 animais em dispositivos microfluídicos. Somos gratos ao Dr. Vatsala Thirumalai e Prakash Surya para fornecer-nos com embriões de zebrafish. Agradecemos ao Dr. Krishna e CIFF em BCN para uso do microscópio confocal disco giratório apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia Centro-de Nanotecnologia (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos também Kaustubh Rau, V. Venkatraman e Chetana Sachidanand para as discussões. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pós-doutorado DBT (SM), o esquema de DST fast-track (SM) e uma subvenção de DBT (SPK). SA foi apoiado pelo horário de verão e CSIR subsídios a SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

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References

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Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish
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