Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Een eenvoudige microfluïdische apparaat is ontwikkeld om verdoving gratis uit te voeren

Abstract

Micro gefabriceerd fluïduminrichtingen zorgen voor een toegankelijke micro-omgeving voor in vivo studies op kleine organismen. Eenvoudige fabricage processen zijn beschikbaar voor microfluïdische apparaten met behulp van zachte lithografie technieken 1-3. Microfluïdische inrichtingen zijn gebruikt voor subcellulaire imaging 4,5, in vivo laser microchirurgie 2,6 en 4,7 cellulaire beeldvorming. In vivo beeldvorming immobilisatie van organismen vereist. Dit is bereikt met zuig 5,8, taps toelopende kanalen 6,7,9, vervormbare membranen 2-4,10, zuig met extra koeling 5, narcosegas 11, temperatuurgevoelige gels 12, 13 en cyanoacrylaatlijm anesthetica zoals levamisole 14 , 15. Veelgebruikte anesthetica synaptische transmissie beïnvloeden 16,17 en is bekend nadelige effecten op subcellulair neuronale transport 4 hebben. In deze stUdy demonstreren we een membraan uit poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) apparaat dat verdoving vrije immobilisatie van intacte genetisch model organismen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larven en zebravis larven mogelijk. Dit model organismen zijn geschikt voor in vivo studies in microfluïdische inrichtingen vanwege hun kleine diameters en optisch transparant of doorschijnend organen. In diameters van ~ 10 pm tot ~ 800 urn voor vroege larvale stadia van C. elegans en zebravis larven en vereisen microfluïdische apparaten van verschillende afmetingen om volledig te immobiliseren voor hoge resolutie time-lapse imaging bereiken. Deze organismen worden geïmmobiliseerd met behulp van druk van gecomprimeerd stikstofgas door een vloeistofkolom en afgebeeld met een omgekeerde microscoop. Dieren vrijgelaten uit de val terug naar de normale voortbeweging binnen 10 minuten.

We tonen vier toepassingen van time-lapse imaging in C. elegansnamelijk beeldvorming mitochondriaal vervoer in neuronen, pre-synaptische blaasje transport in een transport-defecte mutant, glutamaat receptor transport en Q neuroblast celdeling. Gegevens van dergelijke films laten zien dat microfluïdische immobilisatie is een nuttig en nauwkeurig middel verkrijgen in vivo data van cellulaire en sub-cellulaire gebeurtenissen ten opzichte van verdoofde dieren (Figuur 1J en 3C-F 4).

Afmetingen van het apparaat werden veranderd om time-lapse beeldvorming van de verschillende stadia van C. Laat elegans, eerste instar Drosophila larven en zebravis larven. Transport van blaasjes gemarkeerd met synaptotagmin getagd met GFP (syt.eGFP) in sensorische neuronen toont gerichte beweging van synaptische blaasjes markers uitgedrukt in cholinerge sensorische neuronen in intacte eerste instar Drosophila larven. Een dergelijke inrichting is gebruikt voor het uitvoeren van time-lapse beeldvorming van hartslag in ~ 30 uur na de bevruchting (HPF)zebravis larven. Deze gegevens tonen dat de eenvoudige apparaten we hebben kan op een aantal modelsystemen verschillende celbiologische en ontwikkeling verschijnselen te bestuderen in vivo.

Protocol

1. SU8 Master Fabrication

  1. Ontwerp de microfluïdische structuren met behulp van Clewin software en af ​​te drukken met behulp van 65.024 DPI-laser plotter met minimale feature size van 8 micrometer op de printplaat film.
  2. Reinig 2 cm x 2 cm silicium wafers met native oxide in 20% KOH gedurende 1 min en spoel in gedeïoniseerd water, een wafer elk van de stroming laag en de bijbehorende regellaag.
  3. Föhnen de stukken met stikstofgas en op een hete plaat bij 120 ° C drogen gedurende 4 uur. Laat de stukken afkoelen tot kamertemperatuur alvorens de volgende stap.
  4. Plaats silicium stukken een voor een op de spinner boorkop en schakel het vacuüm. Bedek de siliciumoppervlakken met ~ 20 pi hexamethyl-disilazaan (HMDS) en coat ze met een spinner SPIN150 bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 3000 rpm gedurende 30 sec.
  5. Volledig te bedekken silicium wafers met ~ 1,5 ml SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) en coat wafers met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 2.000 rpm gedurende 30 sec. Deze draaiende protocol levert een fotoresist dikte van ~ 40 urn die geschikt is voor de controle en stroom lagen voor vroege larvale stadia van C. elegans.
  6. Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 2.000 rpm gedurende 30 sec tot een dikte van fotoresist ~ 80 um dat geschikt is voor stroming laag fabricage is voor late larvale stadia van C. verkrijgen elegans, basale stroom laag voor Drosophila / zebravis larven en de bijbehorende controle lagen.
  7. Plaats de siliconen stukken op hete plaat met de SU8 gecoate laag op de top. Zacht bakken de beklede stukken silicium bij 65 ° C gedurende 1 min gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. Laat de stukken afkoelen tot kamertemperatuur alvorens de volgende stap.
  8. Plaats de zachte gebakken silicium stukken op de blootstelling podium met SU8-2025 gecoate surgezicht op de bovenkant naar de UV lamp. Gebruik het fotomasker met design I (L1, Figuur 1B) en ontwerp II (L2, figuur 1B) voor de stroom laag en regellaag patroon respectievelijk vroege larvale stadia van C. elegans. Plaats het fotomasker bovenop de SU8 laag en het masker zorgen plat tegen de aangebrachte laag. Open het schuifje van de UV-lamp en bloot de soft-gebakken SU8 wafers tot 200 Watt UV lamp door de foto masker gedurende 15 sec.
  9. Gebruik de foto masker met ontwerp I (L1, figuur 1B) en ontwerp II (L2, figuur 1B) op SU8-2050 gecoate stukken (bereid in stap 1.6) om de stroom laag en controle laag fabriceren voor late larvale stadia van C. elegans. Gebruik het fotomasker met het ontwerp I (L1, figuur 1C) en ontwerp II (L2, figuur 1C) voor de basale laag en stroom regellaag respectievelijk Drosophila / zebravis larven op wafers gecoat met SU8-2050 (bereid in stap 1.6). Maak de SU8 oppervlakken door de foto masker om de 200 Watt UV lamp gedurende 15 sec.
  10. Plaats de belichte silicium stukken op een hete plaat met de beklede laag geplaatst. Plaats de wafers bakken bij 65 ° C gedurende 1 min gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. Laat de stukken afkoelen voordat u verder gaat met de volgende stap.
  11. Ontwikkelen van de stukken met de SU8 ontwikkeloplossing gedurende 20 minuten. Spoel de stukken in isopropylalcohol (IPA) en föhnen met behulp van stikstofgas.
  12. Plaats de silicium stukken in een exsiccator met de SU8 patroon op de top. Coat de stukken met 50 pi tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaangas in een exsiccator gedurende 2 uur.

Voorzorgsmaatregelen: Neem voorzorgsmaatregelen voor behandeling van chemicaliën tijdens KOH behandeling, fotolak coating en ontwikkelen. Silaan damp coating moet worden uitgevoerd in een exsiccator in een geventileerde ruimte. Bescherm SU8 weerstaan ​​van meer dan blootstelling aan licht. Gebruik beschermende brillen met een UV-light bron.

2. PDMS Mold Fabrication

  1. Bereid 10:01 PDMS door het combineren van 50 g Sylgard 184 base met 5 g uithardingsmiddel in een plastic beker. Handmatig Meng de inhoud voor ca. 3 min.. Degas het mengsel in een exsiccator tot alle luchtbellen gevormd tijdens het mengen te verwijderen.
  2. Giet een 5 mm dikke PDMS mengsel over de silicium wafers met SU8 patroon van het ontwerp II, voor de controle laag, zachtjes om de vorming van luchtbellen te voorkomen. In het geval dat bellen worden gevormd tijdens het gieten, ontgas de PDMS op de SU8 patroon in laag vacuüm om alle bubbels weg te nemen.
  3. Plaats de silicium wafers met SU8-2025 patroon van het ontwerp I, voor de stroom laag, op spinner boorkop en schakel de stofzuiger aan te houden. Bedek de wafers met ~ 1 ml van PDMS mix en bedek de wafers met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 1500 rpm gedurende 30 sec.
  4. Coat ~ 1 ml PDMS mix op silicium wafers met 80 urn SU8-2050 patroon van ontwerp I (L1, figuur 1B), hetstroom laag voor de late larvale stadia van C. elegans met de spinner SPIN150 bij 500 rpm gedurende 5 sec gevolgd door 1000 rpm gedurende 30 sec. Coat een dikke laag PDMS mix op de silicium stukken met SU8-2050 stromingspatroon laag ontwerp I (L1, figuur 1C) voor Drosophila / zebravis larven, met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 35 sec.
  5. Bak PDMS gecoate silicium stukken van het ontwerp I en wafeltjes, met bijbehorende ontwerp II voor de controle laag met PDMS voor C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven in een hete luchtcirculatie oven bij 50 ° C gedurende 6 uur.
  6. Knip de PDMS stuk van het silicium substraat dat de SU8 patroon II voor C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven met een scherp mes. Pons een gaatje van ~ 1 mm diameter bovenop het reservoir die de belangrijkste trap in het PDMS mal met een Harris puncher.
  7. Plaats de geperforeerde PDMS blok (met de 40 urn dikke mal voor controllaag L2) op een plastic bakje met de gevormde kant van de laag naar boven. Plaats de PDMS gecoate silicium wafer met de 40 pm dik SU8 ontwerp heb ik op dezelfde lade, met de PDMS gecoate oppervlak naar boven. Plaats de lade in de kamer van plasma schoner en zet het vacuüm gedurende 2 minuten. Vervolgens zet de plasma stroom en laat de druk in de verbrandingskamer tot de kamer wordt licht roze van kleur. Expose beide oppervlakken tot 18 Watt lucht plasma onder laag vacuüm gedurende 2 minuten.
  8. Plaats de geperforeerde PDMS blok verwijderd van de 80 pm dik SU8 meester bevattende patroon II voor late larvale stadia van C. elegans of Drosophila / zebravis larven op een plastic bakje, met de gevormde kant van de laag naar boven. Plaats de overeenkomstige gebakken PDMS laag gespincoat op de silicium wafer met 80 urn ontwerp I later C. elegans stadia of Drosophila / zebravis larven tegelijkertijd op hetzelfde lade met de platte PDMS gecoate surface naar boven. Gebruik hetzelfde protocol genoemde om ze bloot te stellen aan lucht plasma.
  9. Plaats de twee plasma behandelde oppervlakken C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven met lichte druk en bakken in heteluchtconvectie oven bij 50 ° C gedurende 2 uur.
  10. Knip de gekoppelde apparaten uit het silicium substraat met SU8 ontwerp ik voor C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven. Punch toegangsgaten in de inlaat en uitlaat reservoirs van het stromingskanaal.
  11. Plaats de gebonden PDMS mal op een plastic dienblad voor C. elegans, met de gevormde zijde van de stroom laag ontwerp naar boven. Schoon glas dekglaasje (22 X 22 mm, nr. 1 dikte) en plaats het op dezelfde plastic bakje. Schuif de lade met PDMS mal en glazen afdekplaat slip in de plasmakamer. Bloot onder PDMS oppervlak van het apparaat en glazen dekglas tot 18 Watt luchtplasma bij lage druk gedurende 2 minuten. Plaats de twee plasma behandelde oppervlakken met genTLE druk en bakken in heteluchtconvectie oven bij 50 ° C gedurende 2 uur.
  12. Berg het apparaat op in een schone omgeving voor toekomstig gebruik.

3. Aanvullende stappen voor Drosophila / zebravis Device

  1. Bloot schoon glazen oppervlak van grootte 2 cm x 2 cm met 50 pi tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaangas in een exsiccator gedurende 2 uur.
  2. Spin ~ 1 ml van 10:1 PDMS mengsel bereid in stap 2.1 op de gesilaniseerde glazen oppervlak met SPIN150 spinner bij 500 rpm gedurende 35 sec. Bak de PDMS gecoate glazen substraten in een hete luchtoven bij 50 ° C gedurende 6 uur met het beklede oppervlak naar boven. Laat de PDMS-laag afkoelen tot kamertemperatuur voordat u doorgaat met de volgende stap.
  3. Punch de aangebrachte laag met een op maat gemaakte scherpe metalen puncher in het midden van de PDMS, de PDMS spacer laag. De vorm van het metaal puncher vergelijkbaar is ontworpen om de stroom ontwerp voor Drosophila / zebravis (L1, Figuur 1C
  4. Maak de PDMS spacer laag en de single-gebonden blok (stroom laag en controle laag, gemaakt in stap 2.9 voor Drosophila / zebravis larven) tot 18 Watt lucht plasma met behulp van plasma reiniger bij lage vacuüm. Plaats de twee plasma behandelde oppervlakken en bakken in een hete luchtoven bij 50 ° C gedurende 2 uur.
  5. Snij de gebonden inrichting van het glas, punch toegangsgaten bij de inlaat en uitlaat reservoirs en binding aan een glazen dekglaasje (22 X 22 mm, dikte nr. 1) met een plasma reiniger zoals vermeld in stap 2.11. Dit zou een immobilisatie toestel de eerste instar larven Drosophila met een goothoogte van ~ 500 urn. Voor zebravis larven, dupliceer de PDMS spacer laag fabricageproces met een extra hechting stap. De dubbele laag PDMS-S produceert een goothoogte van 900 urn voor 30 HFP zebravis larven.

Voorzorgsmaatregelen: Vermijd stofdeeltjes tijdens device fabricage. Twee plasma gereinigde oppervlaks moeten volledig stof vrij te zijn voor een goede hechting. De apparaten opslaan in een exsiccator in situaties waar een speciale clean room niet beschikbaar te minimaliseren ophoping van stofdeeltjes in apparaten.

4. Met behulp van PDMS Membraan

  1. Sluit een uiteinde van een micro-flex buis (binnendiameter ~ 1,6 mm, buitendiameter ~ 4,8 mm) een onder druk staande stikstof gas regulator en het andere uiteinde aan de belangrijkste trap reservoir door een 18 gauge naald (buitendiameter 1,25 mm ~) gelijmd aan de buis. Een 3-weg kraan in het midden van de buis-verbinding kan het lossen van de druk op het membraan.
  2. Vul de buis verbonden met de PDMS apparaat met een 10 cm kolom gedestilleerd water alvorens het aan het reservoir van de belangrijkste val van een C. elegans en / of Drosophila / zebravis larven apparaat.
  3. Draai de klep van de toevoer van stikstof naar 14 psi lezen en het membraan van de belangrijkste trap afbuigen naar th bewakene stromingskanaal bij lage vergroting van een omgekeerde microscoop. Lengte van de waterkolom in de micro-flex buis samengedrukt wanneer de 3-weg kraan geopend. Randen van de afgebogen membraan zijn zichtbaar in doorvallend licht (Figuur 1I en 1J). Membraan vervorming veroorzaakt verplaatsing van stofdeeltjes / blaasjes onder de PDMS membraan en duwt deze het kanaal grenzen.
  4. Wacht tot de vloeistof voorzijde vult de microchannel volledig zonder de ingesloten lucht.
  5. Nadat de druk door de 3-wegkraan de membraan ontspannen in de ruststand.

5. Plaatsen van C. elegans, Drosophila en zebravis larven in het apparaat en immobiliseren ze onder de Flexibele PDMS membraan

  1. Vul het stromingskanaal met M9 buffer [3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O tot 1 L, steriliseren autoclaving] voor C. elegans 18 of 1X PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2PO 4, H 2 O tot 1 L, steriliseren in autoclaaf] voor Drosophila / zebravis larven 19 gedurende 10 minuten voordat een experiment.
  2. Zoek een C. elegans van de vereiste fase op een NGM plaat 18 (of eerste instar Drosophila larven en agar-agar ei plaat of handmatig dechorionated 30 hpf zebravis larven in vloeibaar medium 20) met behulp van een lage vergroting stereomicroscoop. Sla een dier met een kleine hoeveelheid bufferoplossing in een micro tip. Gebruik een micro tip met het einde gesneden om de grotere Drosophila of zebravis larven in buffer tegemoet te komen.
  3. Duw de enkel organisme door het stroomkanaal inlaat. Stel de pipetteren druk op het individuele dier plaatsen onder de belangrijkste trap.
  4. De druk van de PDMS membraan langzaam het dier tegen het kanaal positionerennel grens en immobiliseren met 14 psi druk C. elegans, Drosophila 7 psi voor en 3 psi zebravis larven.
  5. Plaats de geïmmobiliseerde dier in het centrum van de microscopische gezichtsveld. Gebruik een omgekeerde microscoop op de gewenste instellingen voor hoge resolutie helderveld of fluorescentie beeldvorming. Acquire een-of time-lapse fluorescentie beelden op vooraf bepaalde frame rate.
  6. Laat de val druk en toezicht op de motoriek van het dier gedurende 5-10 minuten bij een lage vergroting.
  7. Spoel het dier en plaats een nieuwe dier aan de bovenstaande stappen te herhalen.
  8. Was alle dieren uit het afval reservoir met behulp van gedestilleerd water toegepast met behulp van een spuit. Droog het kanaal door te drukken op lucht met behulp van een injectiespuit voor toekomstig hergebruik.

Voorzorgsmaatregelen: Dieren die hogere pipetteren druk te stromen in het hoofdkanaal hebben de neiging om een slechte motoriek / gezondheid blijkt na de release van de val en moeten worden vermeden voor imaGing. Reinig de stromingskanaal voor spoor van buffer tot verstopping van het kanaal voorkomen kristallen. Als olie wordt gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming, Reinig de glazen dekglaasje kunnen goede signaal-ruisverhouding te behouden voor verdere experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De immobilisatie apparaat is een dubbellaag PDMS blok vervaardigd door verbinden van twee lagen: een stroom laag (laag 1) en een regellaag (Layer 2) zoals getoond in figuur 1. De belangrijkste trap is verbonden met een stikstofgas cilinder via een regulator en een 3-weg stopkraan noodzakelijk (3-14 psi) op het membraan zich via een vloeistofkolom (Figuur 1A). De afgebogen membraan immobiliseert C. elegans, Drosophila en zebravis larven in het stromingskanaal ontworpen met verschillende afmetingen (Figuur 1B en 1C). Foto maskers worden gebruikt om immobilisatie apparaat lagen ontwerpen met verschillende geometrieën voor C. elegans (Figuur 1D), Drosophila larven (Figuur 1F) en zebravis larven (figuur 1G). Het kanaal hoogte van de stroom laag (h1 in figuur 1E, 1K) werd gevarieerd met verschillende spin-coating snelheden te vangen oforganismen van verschillende diameters in het stromingskanaal. Flow laag hoogten werden vervaardigd bij 40 urn, 80 urn, 500 um en 900 urn voor C. elegans larvale stadia, volwassen C. elegans, Drosophila eerste instar larven en zebravis larven respectievelijk (Tabel 1). Het apparaat met een stromingskanaal hoogte van 40 urn is geschikt van L1 tot begin L4 C. elegans larven. Een apparaat met een 80 micrometer stroomkanaal hoogte wordt gebruikt voor het einde van L4 larven en volwassen C. elegans wanneer de vulva begint uitsteken. De grotere zebravis apparaten kunnen ook worden gebruikt voor oudere Drosophila larven. De PDMS membraandikte (m) werd vervaardigd bij 40 urn en 300 urn voor C. elegans en Drosophila / zebravis apparaten respectievelijk. De hoogte van de microfluïdische kanaal in laag 2 werd vervaardigd bij 40 pm voor de vroege larvale stadia van C. elegans en 80 micrometer voor late larvale stadia van C. elegans en Drosophila/ Zebravis larven. De hoogte van het stromingskanaal, membraan en besturingskanaal gemeten in apparaten vervaardigd in meerdere onafhankelijke batches en bleken consistent binnen ± 5 pm van elkaar. Het apparaat een membraan doorbuiging techniek (figuur 1H-J) te immobiliseren organismen in het stromingskanaal.

Organismen Stromingskanaal (PDMS-1) Spin voorwaarden voor flow kanaal Spacer PDMS (PDMS-S) Spin voorwaarden voor spacer PDMS Immobilisatie druk (psi)
C. elegans (L1 tot begin L4) 40 pm (SU8-2025) 500 rpm (5 sec), 2000 rpm (30 sec) NA NA 14
C. elegans (late L4 en volwassenen) 80 μ m (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2000 rpm (30 sec) NA NA 14
Drosophila (eerste instar) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2000 rpm (30 sec) 400 urn (PDMS) 500 rpm (35 sec) 7
Zebravis (30 hpf) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sec), 2000 rpm (30 sec) 2x 400 urn (PDMS) 500 rpm (35 sec) 3

Tabel 1. Device afmetingen van het stromingskanaal (PDMS-1) en spacer PDMS laag (PDMS-S) in C. elegans en Drosophila / zebravis apparaten.

C. elegans L4 larven werden geïmmobiliseerd in de 80 pm goothoogte PDMS microfluïdische apparaat met 14 psi stikstofgas (Figuur 2A). Time-lapse fluorescentie beelden were verkregen met een snelheid van 2 frames per seconde (fps) met een 60X objectief (numerieke lensopening 1,4, olie-objectief) voor het afbeelden vervoer van mitochondria gevisualiseerd met behulp van een mitochondriale matrix gerichte GFP in de aanraking receptor neuronen 21. Alle 400 frames omgezet naar kymographs met ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) en mitochondriën werden geclassificeerd als anterogradely gerichte (van het cellichaam), retrogradely gericht (naar het cellichaam) of vaste (figuur 2E). We observeerden mitochondriale transport tot 21 psi immobilisatie druk, maar de flux enigszins groter bij de laagste druk immobilisatie. De anterograde en retrograde beweging van mitochondriën werden gemeten tot 1,1 ± 0,23 en 1,6 ± 0,22 zijn op 7 psi terwijl 0,8 ± 0,25 en 1,2 ± 0,34 bij 14 psi immobilisatie druk. De waarden waren niet statistisch verschillend van 1,1 ± 0,33 en 1,3 & plusmn; 0,42 is verkregen van dieren geïmmobiliseerd met behulp van 3 mM levamisol (p-waarden> 0,45, n = 30 dieren).

De grotere apparaten met 500 pm hoogte kan worden gebruikt om eerste instar larven Drosophila (Figuur 2B) en van 28-30 hpf zebravis larven (figuur 2D) immobiliseren. Dissectie van de eerste stadia Drosophila larven kan een uitdaging zijn. Daarentegen microfluïdische inrichtingen een werkwijze om hoge resolutie helderveld en / of fluorescentie beeldvorming met intacte organismen voeren. Individuele Drosophila larven werden geïmmobiliseerd met behulp van 7 psi gecomprimeerd stikstofgas (Figuur 2B, Tabel 1) en fluorescentiebeelden van synaptotagmin.eGFP transport in sensorische neuronen werden verkregen (Figuur 2C). Time-lapse filmpjes toonde bewegende en stilstaande synaptotagmin duidelijke lading in sensorische neuronen (figuur 2F). Gemiddelde anterograde en retrograde snelheid werd gemeten van Kymographs om 0,92 ± 0,04 um / s en 1,00 ± 0,05 pm / s respectievelijk (n = 6 dieren, n> 40 segmenten). Deze zijn vergelijkbaar met snelheden van synaptotagmin die transport vesicles gemeten ontleed Drosophila neuronen bewegen zowel anterogradely (0,84 ± 0,05 um / s) en retrograad (0,76 ± 0,03 um / s) 22.

Toestellen met 900 pm lengte werden gebruikt om verschillende stadia van zebravis larven (figuur 2D, tabel 1) immobiliseren. Zebravis larven tijdens de vroege ontwikkelingsstadia klapt zijn staart elke 10 tot 15 sec en gewoonlijk geïmmobiliseerd met 0,02% tricaine (MS-222) in oplossing of op fixeermiddelen voor hoge resolutie beeldvorming 23. De PDMS, geeft een ander middel voor snelle immobilisatie en elimineert de noodzaak van een onbetrouwbaar fixeermiddel in de lichtweg bij hoge resolutie beeldvorming 24. We handmatig dechorionated achtentwintig-drie0 hpf larven en geïmmobiliseerd ze individueel in een PDMS apparaat met behulp van 3 psi stikstofgas om time-lapse filmpjes van larvale hartslag te verwerven. De snelheid van hartslag werd gemeten als zijnde 136,8 ± 1,6 per min (n = 8 films) en was vergelijkbaar met andere gepubliceerde rapporten 25.

Onze eenvoudige microfluïdische apparaat was al aangetoond voor het meten van een groot aantal sub-cellulaire en cellulaire gebeurtenissen in wild type C. elegans 4. In onze microfluïdische apparaat, wild-type C. elegans tonen een groter aantal lading zoals synaptische blaasjes die in neuronen bewegen ten opzichte van dieren die worden geïmmobiliseerd met verdoving. Maar we hadden niet getest onze apparaten voor gemuteerde dieren om te zien of deze bevindingen opgaan. Om dit te testen hebben we gebruik gemaakt van een sterke hypomorphic mutant in de kinesin3 / UNC-104 moleculaire motor, unc-104 (e1265), dat transporteert pre-synaptische blaasjes 26. We vergeleken de flux van GFP :: RAB-3 gemarkeerde pre-synaptische vesikelen in anterieure laterale mechanosensorische neuronen in verdoving geïmmobiliseerd en inrichting geïmmobiliseerd mutant aniamls (Figuur 3A). Flux van pre-synaptische vesicles was groter in flux inrichting geïmmobiliseerd dieren vergeleken met data verkregen van unc-104 dieren verdoofd in 1 mM levamisol (Figuur 3B, 3C) 27. Hieruit blijkt dat imaging sterke transport defectieve mutanten in microfluïdische inrichtingen waarschijnlijk een efficiënter middel van gegevensverzameling. We tonen ook aan dat andere lading zoals dendritische vervoer van glutamaat receptoren in URY neuronen kunnen worden afgebeeld in het apparaat geïmmobiliseerd dieren (Figuur 3D, 3E). Het apparaat kan ook worden gebruikt om cellulaire processen beeld tijdens de vroege C. elegans ontwikkeling, zoals Q neuroblast divisie in L1 dieren. De QR cel werd afgebeeld te delen in twee dochtercellen QR.a en QR.p ~ 3 uur na het uitkomen (figuur 3F) in overeenstemming met vormeneerdere waarnemingen 28.

Tabel 1. Device afmetingen van het stromingskanaal (PDMS-1) en spacer PDMS laag (PDMS-S) in C. elegans en Drosophila / zebravis apparaten.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van PDMS microfluïdische inrichtingen voor genetische modelorganismen. (A) Het organisme wordt geladen met een micro tip in het stromingskanaal en geïmmobiliseerd met perslucht bediend stikstofgas met een regelaar en klep. Het apparaat is geschikt voor helderveld / fluorescentie beeldvorming in een omgekeerde microscoop. Het ontwerp bestaat uit een 10 mm lange stromingskanaal (design I, L1) en een besturingskanaal (design II, L2) voor respectievelijk C. elegans (B) en Drosophila / zebravis larven (C). De afmetingen zijn aangegeven op het ontwerp (B en C). (D, F, G) Schema van various lagen PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membraan PDMS-S en Glass) aanwezig zijn in een C. elegans, Drosophila en zebravis immobilisatie apparaat. (E) Schematische weergave van een dwarsdoorsnede van de inrichting die de bulk PDMS laag (PDMS-2), een spin bekleed PDMS laag (PDMS-1) een flexibel membraan en een spacer laag PDMS (PDMS-S) toevoegen vormen hoogte tot het stromingskanaal (voor Drosophila / zebravis apparaat). De hele structuur is onomkeerbaar gebonden aan een optische kwaliteit glas dekglaasje aan het organisme (cirkel in bruine) tegemoet te komen. Het schema geeft de hoogte van de 'h2' het controle-kanaal, stroom kanaal 'h1', geperforeerd afstandslaag 's' en membraandikte 'm'. (H) de membraan afbuiging naar het stromingskanaal in aanwezigheid van vloeistofkolom onder druk in het besturingskanaal. Helderveld beelden worden getoond van een vrij (I) en afgebogen membraan (J) onder nul en 14 psi druk vloeistofkolom respectievelijk. De pijl en pijlpunt geeft bubble under en uit het membraan in het stromingskanaal respectievelijk. (K) dwarsdoorsnede beeld van de C. elegans inrichting die ter plaatse van de immobilisatie gebied. Schaalbalk is 50 pm (K) en 200 urn (I, J). (D, F, G) Schema's zijn niet op schaal. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Imaging genetische modelorganismen geïmmobiliseerd in een microfluïdische apparaat. Helderveld beeld van een geïmmobiliseerd C. elegans (A), een eerste instar larven Drosophila (B) en een 30 hpf zebravis larven (D) in een PDMS microfluïdische apparaat. Kymograaf analyse van time-lapse imaging van jsIs609, een C. elegans stam, uiting van een mitochondriële matrix gerichte GFP in een anterieure laterale mechanosensorische neuron (ALM) van een apparaat Immobilseerde dieren (E). Mitochondriën worden geclassificeerd als anterograde ('down' pijlpunt), retrograde ('up' pijlpunt) en stationaire ('ster' merk) in de kymograaf. (C) Fluorescentie beeld van een intacte eerste instar larve Drosophila. Het vak geeft de locatie waar hoge resolutie time-lapse imaging van syt.eGFP vervoer wordt uitgevoerd in een cholinerge neuronen. Montage van vijf frames verworven op 5 Hz met frame nummers aangegeven op elke afbeelding en GFP duidelijke lading weergegeven als anterograde, retrograde en stationair in de montage (F). De doos (D) geeft het gebied dat werd gecontroleerd rekensnelheid van de hartslag van zebravis larven. Schaalstaaf is 5 pm (F), 10 urn (E), 100 urn (A, B) en 200 urn (D).

Figuur 3
Figuur 3. Cellulaire en sub-cellulaire beeldvorming in C. elegans met PDMS microfluïdische apparaten. (A) Schematische weergave van een miererior laterale mechanosensorische (ALM) neuron met de anterograde en retrograde richtingen gemarkeerd. De gestippelde vak toont de regio afgebeeld voor axonale transport. 350 frames worden verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop bij 5 fps met cellichaam (CB) aan de rechterkant en zenuw ring (NR) aan de linkerkant. De gegevens worden geanalyseerd met kymographs voor dieren geïmmobiliseerd in een inrichting of met 1 mM levamisol (C). Cargo bewegen in anterograde en retrograde richtingen worden weergegeven met behulp van pijlen 'down' en 'up' respectievelijk. (B) Anterograde en retrograde flux van deeltjes waargenomen in unc-104 (e1265) dieren in een 20 urn regio van de ALM-neuron meer dan 350 time-lapse frames. (D) Schematische voorstelling van een URY neuron wordt gebruikt om beeld GFP gemarkeerd glutamaat receptoren vervoer. 350 time-lapse beelden worden omgezet in kymographs die lading laten bewegen in de anterograde en retrograde opvragen bij dieren geïmmobiliseerd in PDMS apparaat of met 1 mM levamisol (E). Time-lapse beelden die tijdens Q neuroblast divisie en migratie in de vroege larvale stadia van C. elegans. (F) Drie time-lapse frames die QR ondergaan divisie te tonen aan haar dochter cellen QR.a en QR.p. vormen Schaalstaaf is 5 pm (C, E en F). Gegevens weergegeven in (B) gemiddelde ± SEM (n> 4). Vergelijkingen worden gemaakt met betrekking tot waarden verkregen in verdoving en aangegeven met * (p <0,05) en ** (p <0,005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS microfluïdische inrichtingen zijn optisch transparant kan daarom worden gebruikt voor hoge resolutie in vivo beeldvorming van elke doorzichtige / doorschijnende modelorganisme. Ons ontwerp is geschikt voor een sterke vergroting van spatio-temporele Beeldvorming van cellulaire en sub-cellulaire gebeurtenissen in intacte levende dieren. Microfabricage met behulp van zachte lithografie technieken maakt een eenvoudige manipulatie van het apparaat afmetingen voor verschillende maten van modelorganismen. Inrichtingen van verschillende afmetingen worden vervaardigd voor verschillende fasen van C. elegans, Drosophila larven en zebravis larven. Apparaten met verschillende hoogten van 40 urn en 80 um in hun stroom layer kanalen vertonen verbeterde immobilisatie en betere post-imaging gezondheid van vroege (L1) en later (late L4) stadia van C. elegans respectievelijk. We komen tot een 100% slagingspercentage in apparaat fabricage voor C. elegans en Drosophila / zebravis zonder defecte apparaten. Apparaten kunnen meerdere keren worden gebruikt tothet besturingskanaal is verontreinigd met stofdeeltjes of bacteriegroei. Apparaat geïmmobiliseerd C. elegans vertonen grotere lading flux in zowel wildtype en mutante dieren in vergelijking met geanestheseerd dieren. Apparaat immobilisatie overbodig technisch uitdagende dissectie protocollen vooral voor vroege ontwikkelingsstadia van Drosophila larven 29.

Momentane immobilisatie protocols in PDMS microfluïdische inrichtingen hebben een inherent voordeel dat experimentele tijd in vergelijking met de typisch langere belichtingstijden vereist voor uitwendig anesthetica. Alle geïmmobiliseerd organismen terug te keren naar de normale voortbeweging binnen 5-10 minuten na de release van de druk op de vervormbare PDMS membraan. C. elegans worden geïmmobiliseerd op de grens van het stromingskanaal en weg van het centrale deel van de immobilisatie membraan. Dieren geïmmobiliseerd in het midden van het stromingskanaal tonen slechte gezondheid na immobilisatietie en sterven binnen een dag of twee. Onze microfluïdische apparaat is gebruikt om L4 stadium C. te houden elegans geïmmobiliseerd tot een uur onder het membraan zonder dat de gezondheid en het verdere ontwikkeling. Dieren geïmmobiliseerd kortere tijden (tot 10 min) kan worden opgesloten meerdere keren imaging. Voor de vroege ontwikkelingsstadia, C. elegans werden geïmmobiliseerd met iets lagere druk (7 psi) voor langdurige time-lapse experimenten (~ 3 uur). Dieren geïmmobiliseerd onder het membraan na introductie bleven in dezelfde inrichting in de tussentijd. Deze dieren zijn vergelijkbaar met wildtype zowel in hun ontwikkeling en algemene gezondheid. Volwassen C. elegans geïmmobiliseerd met lagere druk (7 psi) liet langzame drift tijdens hoge resolutie time-lapse experimenten en vereisen complexe analyse-tools voor het vervoer analyse. Maar lagere druk werden gebruikt om op langere termijn studies zoals Q neuroblast celdeling / migratie meer dan ~ 3 uur of semi-kwantitatieve mitoch uit te voerenondria vervoer karakterisering, processen die niet hoeven dieren volledig te immobiliseren. Dus lagere drukken van immobilisatie kan worden gebruikt afhankelijk van de dataset die moeten worden verzameld.

Time-lapse imaging van L4 C. elegans toont sprongsgewijze beweging van GFP mitochondria gemarkeerd in de ALM-neuron (stam jsIs609) zoals is gerapporteerd voor neuronen in andere modelsystemen 30-32. Sommige mitochondriën in deze neuronen vertonen bidirectionele vervoer, terwijl de meerderheid van hen zijn stationaire over de duur van de film. Ondanks de kleine verschillen in flux we verder met 14 psi druk immobilisatie bij C. elegans om volledig te immobiliseren verkrijgen en een eventuele verschuiving in hoge resolutie een time-lapse imaging van axonaal transport te voorkomen. We raden gebruik van een 14 psi in een algemeen protocol en afhankelijk van experimentele behoeften dit kan worden verhoogd of verlaagd. Dieren duurde bijna dezelfde tijd om terug te keren naar de normale locomotion van zowel lagere als hogere druk en immobilisatie geïmmobiliseerd dieren ontwikkelde identiek aan die gekweekt zonder immobilisatie.

Het apparaat wanneer gefabriceerd met grotere afmetingen met spacer lagen kunnen worden gebruikt voor grotere model organismen zoals Drosophila en zebravis larven. Imaging van synaptotagmin.eGFP vervoer in intacte eerste instar Drosophila sensorische neuronen toont actief transport in zowel anterograde en retrograde richting. De gemiddelde snelheden gemeten in het apparaat geïmmobiliseerd larven zijn hoger in vergelijking met de gemeten waarden in ontleed motorneuronen 22. Dit verschil kan ontstaan ​​uit een snellere verwerving van data in onze experimenten (5 hz v / s 1,1 tot 1,4 hz), neuron-specifieke verschillen in organel transport (zintuiglijke v / s motorneuronen) en / of de effecten door dissectie.

Onze eerdere experimenten werden uitgevoerd uitsluitend in wild type dieren 4, dus we bepaald ofimaging mutanten in microfluïdische inrichtingen ook voordelig. Time-lapse imaging van C. elegans L4 dieren betekent minder flux van GFP :: RAB-3 gemerkte pre-synaptische vesicles in kinesin3/unc-104 mutanten geïmmobiliseerd in 1.0 mM levamisol vergeleken met metingen die flux in dieren geïmmobiliseerd met behulp van onze PDMS (figuur 3B). We hebben vaak waargenomen en tonen een voorbeeld (figuur 3C) dat mutanten weinig transport wordt waargenomen indien de dieren geïmmobiliseerd met verdoving concentraties wild type dieren immobiliseren. Het aantal blaasjes bewegen unc-104 dieren significant hoger wanneer we microfluïdische apparaten. Verdoofde dieren vertonen soortgelijke kenmerken als transport onder 14psi druk waarbij de PDMS membraan (Figuur 3B). Vergelijkbare opmerkingen zijn ook gemaakt in wild type dieren 4. Deze gegevens suggereren dat de toegenomen flux niet dreigt te ontstaan ​​van immobilisatie onder stikstof, maar als gevolg van een protocol dat was minder schadelijk voor het intra-cellulaire transport.

In principe kunnen andere gebeurtenissen zoals calcium dynamiek en celdeling allemaal afgebeeld in intact Drosophila / zebravis larven ook. Na herstel van imaging apparaat geïmmobiliseerde dieren minder schadelijk organisme levensvatbaarheid 4 en dus dergelijke apparaten kunnen ook worden gebruikt om lange termijn beeldvorming van genetisch model genetische organismen uitvoeren gebeurtenissen die zich voordoen over langere tijd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken Dr Krishanu Ray voor Drosophila voorraden, Tarjani Agarwal voor het handhaven van een Drosophila kooi, Peter Juo voor nuIs25 en CGC voor C. elegans stammen. SPK gemaakt jsIs609 in het laboratorium van Michael Nonet's. Wij danken Arpan Agnihotri (BITS Pilani) voor zijn hulp bij time-lapse imaging van mitochondriën transport van jsIs609 dieren in microfluïdische apparaten. We zijn dankbaar voor Dr Vatsala Thirumalai en Surya Prakash voor het verstrekken van ons met zebravis embryo's. Wij danken dr. Krishna en CIFF bij de NCB's voor het gebruik van de draaiende schijf confocale microscoop wordt ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie-Centrum voor Nanotechnologie (nr. SR/55/NM-36-2005). We danken ook Kaustubh Rau, V. Venkatraman en Chetana Sachidanand voor discussies. Dit werk werd gefinancierd door de DBT post-doctorale beurs (SM), DST versnelde regeling (SM) en een DBT subsidie ​​(SPK). SA werd ondersteund door DST en CSIR subsidies aan SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Bioengineering Moleculaire Biologie Neurowetenschappen Microfluidics, zebravis larven verdoving pre-synaptische blaasje vervoer dendritische transport van glutamaat receptoren mitochondriaal vervoer synaptotagmin vervoer hartslag
Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; En zebravis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter