Summary
Drosophila melanogaster è un sistema genetico e comportamentale del modello trattabile che è stato utilizzato per comprendere le basi molecolari e cellulari di molti importanti processi biologici per oltre un secolo 1. Drosophila è stata ben sfruttata per acquisire conoscenze in base genetica del comportamento mosca.
Abstract
Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, è stato utilizzato per studiare i meccanismi molecolari di una vasta gamma di malattie umane come il cancro, malattie cardiovascolari e le varie malattie neurologiche 1. Abbiamo ottimizzato i test comportamentali semplici e robuste per la determinazione locomozione larvale, la capacità di arrampicata per adulti (test RING), e comportamenti di corteggiamento di Drosophila. Questi test comportamentali sono ampiamente applicabile per studiare il ruolo dei fattori genetici e ambientali sul comportamento fly. Capacità di scansione larvale può essere attendibilmente utilizzato per determinare i cambiamenti nelle fasi iniziali nelle abilità di larve striscianti Drosophila e anche per l'esame effetto di farmaci o geni di malattie umane (in mosche transgeniche) sul loro locomozione. Il saggio scansione larvale diventa più applicabile se l'espressione o la soppressione di un gene provoca mortalità negli stadi pupa o adulto, in quanto queste mosche non riescono a sopravvivere fino all'età adulta, dove altrimenti potrebbero essere valutati. Questo di base unssay può essere utilizzato anche in combinazione con la luce o di stress per esaminare ulteriori risposte comportamentali in larve di Drosophila. Comportamento di corteggiamento è stato ampiamente usato per studiare le basi genetiche del comportamento sessuale, e può essere utilizzato anche per esaminare l'attività e il coordinamento, così come l'apprendimento e la memoria. Corteggiamento Drosophila comporta la sostituzione di diversi stimoli sensoriali tra visivo, uditivo, e segnali chemosensoriali tra maschi e femmine che portano a una complessa serie di comportamenti motori ben caratterizzati che culminano in copula di successo. Saggi di arrampicata per adulti tradizionali (geotassi negativi) sono noiosi, lavoro intensivo, e richiede tempo, con variazioni significative tra i diversi studi 2-4. La rapida iterativo geotassi negativi (RING) saggio 5 ha molti vantaggi rispetto a protocolli più ampiamente impiegati, fornendo un approccio velocità riproducibile, sensibile, e di alta quantificare locomotore adulti e negative geotassi behaviors. Nel saggio RING, genotipi diversi o trattamenti farmacologici possono essere testati contemporaneamente utilizzando gran numero di animali, con l'high-throughput approccio rende più suscettibili per gli esperimenti di screening.
Protocol
A. larvale Crawling Assay
1. Le larve Collection
- Impostare un 8 once bottiglia di mosche (10-15 maschi + femmine 10-15).
- Lasciate che le mosche depongono le uova per 24 ore, poi bottiglia trasparente di mosche. (Trasferire gli adulti in una nuova bottiglia e ripetere se necessario).
- Incubare bottiglia per 3-4 giorni, o fino terzo stadio larve sono visibili.
- Aggiungere 50 - 100 ml di 20% saccarosio alla bottiglia con larve e lasciate riposare per 20 minuti. Le larve saranno a galla.
- Raccogliere le larve con una pipetta 25 ml sierologico con la punta tagliata, e posto in un cesto in rete.
- Lavare larve nel cesto maglia due volte con acqua deionizzata H 2 O. Le larve sono ora pronti per gli esperimenti.
2. Per il trattamento di larve con la droga
- Utilizzare un pennello per trasportare il numero desiderato di larve in un becher 5 ml contenente una soluzione al 5% di saccarosio + farmaco.
- Lasciate che le larve si nutrono per almeno 15 minuti.
- Versare droga trattata con larve in un cesto in rete e risciacquare. Ora sono pronto per l'uso.
3. Assay Locomotore (misurando la distanza totale percorsa o contrazioni parete del corpo)
- Utilizzare un pennello per il trasporto individuale ad una larva:
- 15 centimetri capsula Petri contenente il 2% agarosio (precedentemente versato e lasciato indurire) su carta millimetrata di cm 0,2 2 griglia.
- Contare il numero di linee della griglia incrociate in 1 minuto.
- Beh dissezione di un piatto di vetro contenente una soluzione diluita di pasta di lievito.
- Contare le contrazioni peristalsi (anteriore posteriore completo di movimento = 1 contrazione) in un minuto, osservando al microscopio di dissezione.
- 15 centimetri capsula Petri contenente il 2% agarosio (precedentemente versato e lasciato indurire) su carta millimetrata di cm 0,2 2 griglia.
- Ripetere fino a quando i numeri desiderati delle larve sono stati contati.
B. Rapid iterativo geotassi negativi (RING) Protocol
Questo saggio è stato originariamente disinstallatidescritto dal Gargano et al 5.
- Raccogliere appena emerse le mosche maschio adulto sotto la luce CO 2 anestesia e il luogo di un alimento standard contenente flacone (o cibo + farmaci).
- Mantenere le mosche a temperatura ambiente (in alto panchina. ~ 22 ° C) per 2-3 giorni per consentire il recupero di CO 2 (e l'accumulo di steady-state i livelli di farmaco se del caso).
- Trasferire circa 25 mosche, senza anestesia in fiale polistirolo preparati.
- Assemblare flaconcini con mosche nell'apparecchiatura ANELLO (Figura 1).
- Lasciare mosche di acclimatarsi all'ambiente, indisturbato, per 15-20 minuti.
- Durante questa fotocamera digitale in tempo luogo ~ 1 m di fronte dell'apparecchio (su una piattaforma, se necessario, per allineare il centro della lente a metà altezza del fiale), mettere a fuoco e zoom la fotocamera sulla apparato, e impostare un timer per 3.0 secondi.
- Cura prendere in mano l'apparato ANELLO con la mano sinistra in modo da non disturb le mosche, e tengono il timer con la mano destra.
- Una drastica toccare l'apparecchio verso il basso sulla superficie del banco di tre volte, assicurando che il rubinetto è difficile da abbattere tutte le mosche al fondo dei flaconi.
- Contemporaneamente con il completamento del terzo rubinetto, inizia il conto alla rovescia 3 secondi.
- A tre secondi scatta una foto.
- Ripristinare il timer per 1 minuto e iniziare. Durante questo tempo ripristinare la fotocamera e mettere a fuoco l'apparato, e impostare un altro canale del timer per tre secondi.
- Dopo 1 minuto, ripetere i passaggi da 1,7-1,10
- Dopo un totale di 5-6 prove, caricare le immagini su un computer e utilizzare il vostro preferito visualizzatore di immagini per aprire, e segnare l'altezza media si arrampicò per ogni flacone.
- Effettuare analisi statistiche sui vostri gruppi diversi a confronto l'altezza media salito.
C. corteggiamento e di accoppiamento test
- La prima cosa al mattino, ben chiari che producono bottiglie di FLIES da utilizzare.
- Nel corso della giornata (ogni 3-4 ore), la raccolta di recente è emerso maschi sessualmente ingenui e femmine:
- Mettere i maschi singolarmente in fiale o provette con terreno.
- Mettere 5-6 femmine insieme per flacone / provetta.
- Isolare mosche raccolti a 25 ° C sotto i 12 hr luce / buio per 5 giorni.
- Trasferire uno femmina nella camera di una ruota di accoppiamento.
- Trasferire un maschio nella camera di una ruota di accoppiamento.
- Osservare coppia sotto un microscopio per dissezione i seguenti comportamenti:
- Orientamento (orienta maschio verso la femmina)
- Tapping (il maschio batte la femmina)
- Canzone Wing (il maschio si estende e vibra un'ala)
- Licking (i maschi lecca i genitali femminili)
- Curling (il maschio si arriccia suo addome sotto se stesso)
- L'accoppiamento tentativo (Leggendo l'attività durante il tentativo di montare la femmina)
- Osservare per 10 minuti o fino copulazione successo, rilevando il tempo in cui ogni comportamento si verifica (latenza), il tempo totale impegnata in corteggiamento fino accoppiamento (per calcolare l'indice corteggiamento), nonché il numero di coppie di eseguire correttamente un dato comportamento ( frequenza). 100% delle coppie di tipo selvatico generalmente accoppiano entro 5 minuti.
- Calcolare un indice corteggiamento (CI) dividendo il tempo trascorso in corteggiamento diviso per il tempo totale fino copulazione. Per le coppie di questo tipo selvatico varia di solito tra i 0,6-0,8.
D. Risultati rappresentativi
Crawling test
Normale larva di tipo selvatico vagheranno ~ 3 cm / minuto, e presentano ~~~HEAD=NNS 40-50 contrazioni del corpo a parete in un minuto. Abbiamo recentemente sviluppato un modello Drosophila di FUS / TLS-correlato sclerosi laterale amiotrofica che mostra larvale difetto di scansione, durata di vita ridotta e adulti salendo impairment 6. Avevamo l'obiettivo di espressione of wild type e forme mutanti di FUS / TLS per i motoneuroni (OK-371-GAL4 driver) ed eseguito un test di scansione larvale. Come mostrato di seguito, le larve di tipo selvaggio strisciare fino a 12 cm, mentre l'espressione del FUS di tipo selvatico diminuita la capacità delle larve strisciando a circa 6 cm. Gli animali che esprimono il ALS-R521C causando mutazione FUS / TLS dimostrare un danno molto grave nel loro movimento crawling (Figura 1), la scansione solo circa 1 cm al minuto.
Negative geotassi test ANELLO
Giovani wild-type mosche adulte devono avere un'altezza media salendo di ~ 4-5 cm in hotel 3 secondo periodo di tempo (il tempo può essere regolato da 3 secondi per ospitare diversi ceppi o livelli di attività per definire una determinata altezza media per un dato ceppo / trattamento). Mosche che rimangono sul fondo viene assegnato un valore di 0. Non si consiglia di utilizzare più di 25 mosche per flaconcino, perché allora diventa difficile determinare la posizione di ogni singolo volo per misurare l'altezza. Ndesensibilizzazione o è stata osservata fino alle 6 prove consecutive distanziate 1 minuto a parte che abbiamo impiegato. È critico non riutilizzare i flaconi prova polistirene in questo saggio, dopo gli insiemi iniziali di dati sono raccolti perché le mosche nuovi collocati in fiale utilizzati non salirà nella stessa misura in fiale freschi.
Figura 1. Di installazione per il saggio RING. La fotocamera digitale è posto ~ 1 m di fronte al apparecchi contenenti mosche nelle fiale polistirolo, mettere a fuoco e lo zoom sul dispositivo, e impostare un timer a 3,0 secondi.
Dati rappresentativi Figura 2. Dal saggio di scansione delle larve con la mosca ectopicamente esprimere UAS FUS-WT e UAS-FUS R521C sotto il controllo di un driver motor neuron (OK371-GAL4).
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Discussion
Drosophila comportamento è strettamente regolato da fattori genetici e ambientali. Noi, e altri, hanno già utilizzato i saggi descritti qui per raccogliere i dati per esaminare i geni legati a volare comportamenti e per la salute umana le malattie neurodegenerative modellati in Drosophila 5-19. Per il saggio strisciando, attenta selezione di 3 rd instar larve è un passo fondamentale. Se il trattamento con un farmaco, ci vorranno 10-15 minuti (o più a seconda del tipo e natura del farmaco) per ottenere l'effetto massimo se ha una buona solubilità. Pertanto, si alimentano di routine vola il farmaco per 15 minuti, e poi attendere altri 15 minuti prima del test. È importante, tuttavia, per mantenere concentrazioni di farmaco in soluzione, e tempi di esposizione, tra i gruppi di trattamento per lo stesso confronto preciso. Farmaci attivi sul SNC avrà solitamente un massimo effetto duraturo ~ 45 minuti. Le larve devono essere lavati bene dopo la selezione (o scavato alimentazione) per rimuovere il cibo e la moscapermesso acclimatati per 1 minuto prima di iniziare il test scansione. La piastra di agar deve essere conservato a temperatura ambiente (~ 22 ° C) per un'ora, a bassa temperatura può influenzare la capacità larvale scansione. Anche se il test crawling larvale può fornire importanti informazioni riguardanti i livelli di attività, non è adatto per l'analisi dei deficit di coordinamento sottili. Pertanto, come piattaforma di screening è il più appropriato per un primo passo l'esame di deficit di attività lordi.
Un comportamento adulto che coinvolge coordinazione fine motore è il corteggiamento e l'accoppiamento. Questo comportamento è stato utilizzato per esaminare gli aspetti di comportamenti rilevanti per le malattie umane, e l'elaborazione è sensoriale (olfattivo, visivo, acustico) in aggiunta ad avere un controllo motore 18. Quando un maschio nota una femmina, inizia il rituale di corteggiamento che progredisce in un inizio stereotipo modello di orientamento con il comportamento (volgendosi verso e inseguendo la femmina). Questa è seguita da wingsong, Licking e maschiatura del genetalia femminile, curling dell'addome verso la donna, e culmina in copulazione, che può durare diverse decine di minuti 20-22. Poiché molti degli aspetti del corteggiamento coinvolgono segnali visivi, condizioni di scarsa illuminazione portare ad un degrado delle prestazioni di accoppiamento, e test devono essere eseguiti con la luce sufficiente in modo che vola può vedere l'un l'altro. Di conseguenza, dagli occhi bianchi mosche di solito hanno prestazioni estremamente poveri nel nostro saggio descritto ei lettori sono sconsigliati pianificazione di esperimenti utilizzando con questo protocollo. Se trattando le mosche con un farmaco, il farmaco messo nel terreno le mosche sono isolati su (ad esempio, 1% agarosio saccarosio + 10% + farmaco invece di cibo normale durante il trattamento con farmaco per evitare ogni possibile degradazione del farmaco da parte di microrganismi nella prodotti alimentari). Generalmente le mosche sono isolati in 5 provette ml che hanno 300-500 ml di cibo in essi, collegato con il cotone. NON anestetizzare le mosche per il trasferimento alla ruota di accoppiamento. E is assolutamente cruciale per lavare la ruota di accoppiamento molto bene tra le utilizza per rimuovere eventuali residui di feromoni (acqua calda con una piccola quantità di sapone Alconox durante la notte in agitazione, poi lavata per un minimo di 48 ore in acqua deionizzata in agitazione, e numerosi cambiamenti di acqua) . Un'altra considerazione quando si esegue il test che descriviamo è il tempo. Nelle nostre mosche esperienza non corteggiare se piove o sembra che pioverà. Essi svolgono migliore luminose giornate di sole, a prescindere se il laboratorio dispone di finestre o no. La nostra teoria attuale è che questo fenomeno è legato alla pressione atmosferica, ma non hanno indagato.
Il test tradizionale geotassi negative si basa sulla misurazione quante mosche salire sopra una predeterminata altezza in 10 secondi (descritto in http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). Noi crediamo che il saggio ANELLO presenta alcuni vantaggi rispetto al test tradizionale. Uno è throughput, come sei indipendente repliche possono essere misurati simultaneamente rispetto a quella del saggio standard, e il sistema è generalmente scalabile. Un altro è la sensibilità, perché l'altezza media si arrampicò in un periodo di tempo definito è quantificato, piuttosto che un pass / fail il numero per l'altezza assoluta. Usando questo approccio, i deficit più sottili possono essere osservati. A causa del livello di throughput, il saggio è più adatto agli schermi che il più noioso saggio tradizionale geotassi negativo. Inoltre, Garagano et al. (2005) descrivono un metodo computerizzato punteggio che, se impiegato ulteriormente aumentare la produttività. Gli obiettivi primari di questo test è che è imperativo che le mosche non sono anestetizzati prima della prova, e che le fiale freschi vengono utilizzati dopo un dato insieme di prove prima di un nuovo lotto di mosche vengono testati.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Astha Maltare per generare i dati crawling larvali. Vorremmo ringraziare il Dott. Nicholas Lanson Jr. per dare i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Robert Packard per la SLA presso la Johns Hopkins (a UBP) e la sclerosi laterale amiotrofica Association (UBP) e R01MH083689 dal National Institutes of Mental Health (CDN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
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