Summary
Drosophila melanogaster은 한 세기 이상에서 많은 중요한 생물 학적 과정의 분자 및 세포 기초를 이해하기 위해 사용되었습니다 유전자와 behaviorally 다루기 쉬운 모델 시스템이다. Drosophila 잘 플라이 행동의 유전적 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 악용되었습니다.
Abstract
Drosophila melanogaster, 과일 파리는 등 암, 심혈관 질환 및 각종 신경 질환 1 등 인간 질병의 광범위한 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 애벌레 운동, 성인 등반 능력 (링 분석), 그리고 Drosophila의 구애 행동을 결정하는 간단하고 강력한 행동 assays을 최적화했습니다. 이러한 행동 assays은 즉시 행동에 대한 유전 및 환경 요인의 역할을 연구를위한 광범위하게 적용됩니다. 애벌레 크롤링 능력을 안정적으로 또한 그들의 운동에 약물이나 인간 질병 유전자의 효과를 (유전자 변형 파리에서) 조사를 위해 Drosophila의 애벌레의 크롤링 능력에서 초기 단계의 변화를 결정하기 위해 사용될 수 있습니다. 그들이 달리 평가되어야 어디로 이들 파리가 성체로 생존하지 않는 한 유전자의 표현이나 폐지가 pupal 또는 성인 무대에서 보여 주죠가 발생하면 애벌레의 크롤링 분석 더 적용됩니다. 이것은 기본ssay은 Drosophila의 애벌레에 추가적인 행동 반응을 조사하기 위해 밝은 빛 또는 스트레스와 함께 사용할 수도 있습니다. 구애 널리 성적 행동의 유전적 기초를 조사하기 위해 사용되고, 또한뿐만 아니라 학습과 기억 등, 활동과 조정을 검토하는 데 사용할 수 있습니다. Drosophila의 구애는 시각, 청각, 그리고 chemosensory 신호 등 다양한 감각 자극의 교환을 포함 남성과 성공적인 결합에 culminating 잘 특징 모터 행동의 복잡한 시리즈로 이어질 여성 사이. 전통 성인 등반 assays (부정적 geotaxis)는 서로 다른 시련 2-4 사이에 상당한 편차가있는 지루하고, 집중적인 노동과 시간이 소요입니다. 급속한은 (RING) 분석 5 성인 운동력이있는 사람과 부정적인 geotaxis B를 정할, 재현성 민감한, 높은 처리량 접근 방식을 제공,보다 광범위하게 사용된 프로토콜을 통해 많은 장점을 가지고 부정적인 geotaxis 반복ehaviors. 링 분석에서는 여러 genotypes 또는 약물 치료는 높은 처리량 접근이 선별 실험에 대한 더 의무가 만들어 함께 동시에 동물의 큰 번호를 사용하여 테스트할 수 있습니다.
Protocol
A. 애벌레의 크롤링 분석
1. 애벌레 컬렉션
- 파리 (10-15 10-15 남성 + 여성)의 8온스 병을 설정합니다.
- 파리 그 다음 24 시간 동안 계란, 파리의 명확한 한병을 덮어두고. (새 병으로 성인 전송하고 필요에 따라 반복).
- 3-4일위한 병 품어도, 세번째도 instar의 애벌레가 보일 때까지.
- 애벌레와 병에 20 %의 자당 100 ML하고 20 분 동안 앉아 보자 - 50을 추가합니다. 애벌레는 정상에 떠 있습니다.
- 팁과 25 ML serological 피펫을 사용하여 수집 유충 잘라, 그리고 메쉬 바구니로 곳이 네요.
- 두 번 deionized H 2 O를 함께 메쉬 바구니에 애벌레 씻으십시오 애벌레는 이제 실험을위한 준비가되어 있습니다.
2. 약물과 애벌레를 치료하려면
- 솔루션 5 % 자당 + 약물을 포함하는 5 ML의 비커에 유충의 원하는 숫자를 수송 브러쉬를 사용합니다.
- 적어도 15 분 동안 애벌레 피드 구.
- 메쉬 바구니로 약물 치료 애벌레를 붓고 린스. 그들은 이제 사용할 준비가 된 것입니다.
3. 전위의 분석 (총 거리를 측정하는 여행을하거나 신체 벽의 수축)을
- 개별 유충의 수송을 브러쉬를 사용하여
- 0.2 cm 2 그리드와 그래프 용지 위에 2퍼센트 아가로 오스를 (이전에 부어 및 강화에 허용)이 들어 15cm 배양 접시.
- 일분이 깨지는 그리드 라인의 숫자를 세어보세요.
- 묽은 효모 붙여넣기 솔루션을 포함하는 유리 해부 요리의 음.
- 해부 현미경 하에서 관찰하면서 일분 후에 연동 수축을 (후부 움직임 = 1 수축에 대한 전체 앞부분) 백작.
- 0.2 cm 2 그리드와 그래프 용지 위에 2퍼센트 아가로 오스를 (이전에 부어 및 강화에 허용)이 들어 15cm 배양 접시.
- 애벌레의 원하는 숫자를 계산 때까지 반복합니다.
B. 신속한 마이너스 geotaxis (RING) 프로토콜을 반복
이 분석은 원래 드되었습니다Gargano 외 5에 scribed.
- 표준 유리병이 포함된 식품 (또는 식품 + 약물)에 빛을 CO 2 anesthetization과 장소 하에서 새롭게 등장 성인 남자의 파리를 수집합니다.
- 실온에서 파리를 유지 (벤치 위에. ~ 22 ° C) CO 2로부터 복구 (및 정상 상태 약물 수준의 축적 해당되는 경우)를 허용하기 위해 2-3 일동안은.
- 준비된 폴리스티렌 유리병에 anesthetizing없이 25 파리에 대해 전송합니다.
- 링 장치 (그림 1)에 파리와 튜브를 조립.
- 파리는 15~20분위한 흐트러지지 환경에 적응하도록 허용합니다.
- 이 시간 장소 디지털 카메라 중에 ~기구 앞에서 1m가 (플랫폼 튜브의 중간 높이에서 렌즈의 중심을 정렬하기 위해 필요한 경우에), 집중하며기구를 향해 카메라를 확대, 그리고 타이머를 설정 3.0 초.
- 조심스럽게 dist로 왼손으로 링 장치를 확보하므로 같이하지 받아urb는 파리, 그리고 오른손으로 타이머를 누르고 있습니다.
- 급격히 수돗물은 튜브의 바닥에 모든 파리들을 허물고 어려운 충분 있도록, 벤치의 표면에 세 번 장치를 누릅니다.
- 동시에 세 번째 탭 완성과 함께, 삼초 카운트 다운 타이머를 시작합니다.
- 삼초에서 사진을 찍었어요.
- 1 분 타이머를 재설정하고 시작합니다. 이 시간 동안 장치에 카메라 초점을 재설정하고, 3 초 동안 타이머의 다른 채널을 설정합니다.
- 일분 후, 반복 1.7-1.10 단계를
- 5-6 시련 총 후에, 컴퓨터에 이미지를 업로드하고 여십시오 좋아하는 이미지 뷰어를 사용하며, 평균 높이가 각 유리병에 대해 올랐다 득점.
- 올라왔다는 평균 높이를 비교하여 서로 다른 그룹에 대한 통계 분석을 수행합니다.
C.의 구애와 번식 분석
- 아침 일찍, fli의 명확한 잘 생산 병초밖에 사용할 수 있습니다.
- 하루 코스 (매 3-4시간)이 지남에 새롭게 등장 성적으로 순진한 남성과 여성을 수집합니다 :
- 매체와 튜브 또는 튜브에 개별적으로 남성을 놓습니다.
- 유리병 / 튜브마다 함께 5-6 암컷를 놓습니다.
- 5 일째 어두운 12 시간 조명 / 아래 25 ° C에서 수집된 파리를 분리.
- 교배 바퀴 챔버에 한 명, 여자를 전송합니다.
- 교배 바퀴 챔버로 남자 한을 전송합니다.
- 다음 동작을위한 해부 현미경 하에서 쌍을 관찰 :
- 오리 엔테이션 (여성에 대한 남성 orients)
- (남자가 여자를 도청) 태핑
- 날개의 노래 (수컷은 확장 하나의 날개를 진동)
- (남성 찾고 있는데, 여성 성기) 빠는데
- 컬링 (남성 자체에 따른 복부를 곱슬머리)
- (여성을 마운트하는 동안 활동을 컬링) 결합 시도
- 1 관찰0분 또는 성공적인 결합까지, 각 문제가 발생되는 시간을 지적 (지연), 구애 결합까지 동작 (구애 지수를 계산하는)뿐만 아니라 성공적으로 특정 동작을 수행 쌍 개수에 종사하는 총 시간 ( 주파수). 야생 타입 쌍의 100 %는 일반적으로 5 분 이내에 짝짓기 것입니다.
- 계산 시간을 나누어 구애 지수 (CI)는 결합까지 총 시간으로 나눈 구애에 보냈다. 야생 형 쌍 이것은 보통 0.6-0.8 사이의 범위.
D. 주재원 결과
분석을 크롤링
일반 야생 형 유충은 ~ 3cm / 분, 그리고 전시 ~ 잠시 후에 40-50 바디 벽의 수축을 돌아다니는 것입니다. Google은 최근 애벌레 기어 결함, 낮은 수명과 장애 6 등산 성인을 보여줍니다 FUS / TLS 관련 루게릭병의 Drosophila 모델을 개발했습니다. 우리는 표현 O에게 대상모터 뉴런 (OK-371 gal4 드라이버) 및 F 야생 유형 및 FUS / TLS의 돌연변이 형태는 애벌레 크롤링 분석을 수행. 아래 그림과 같이 야생 형 FUS 표현 약 6cm로 애벌레 크롤링 능력을 감소 반면 야생 형 유충은 최대 12cm까지 크롤 링합니다. FUS / TLS에서 루게릭병 유발 돌연변이의 R521C을 표현하는 동물은 약 1cm / 분을 크롤 링, 그들의 크롤 링 운동에있어서 매우 심각한 장애 (그림 1)을 보여줍니다.
부정적 geotaxis 링 분석
영 야생 형 파리 성충은 3 번째 기간에 ~ 4~5센티미터 (시간이 주어진 동안 주어진 평균 높이를 정의하기 위해 다른 변종이나 활동 수준을 수용할 수있는 3 초에서 조절할 수의 평균 등산 높이가 있어야 / 치료)를 변형. 바닥에 남아있는 파리는 값 0을 할당됩니다. 그것은 그 후 높이를 측정하기위한 각 플라이의 위치를 결정하기 어려워진다 있기 때문에 유리병 당 25 개 이상의 파리를 사용할 것을 권고하지 않습니다. NO의 desensitization는 우리가 고용했다는 떨어져 일분 간격의 6 연속 시련을 올려다 관찰되었습니다. 그것은 사용 튜브에 배치 새로운 파리 신선한 튜브에서와 동일한 범위까지 올라갈하지 않으므로 수집되는 데이터의 초기 집합 후에이 분석의 폴리스티렌 테스트 튜브를 다시 사용할 수없는 중요합니다.
그림 1. 링 분석을위한 설정. 집중 장치를 향해 카메라를 확대; 디지털 카메라는 폴리스티렌 튜브 안에 파리를 포함하는기구 앞에서 ~ 1 미터에 위치 및 3.0 초로 타이머를 설정합니다.
사용 애벌레 크롤링 분석에서 그림 2. 대표 데이터 ectopically UAS-FUS WT을 표현하고, 모터 신경 세포 드라이버 (OK371-gal4)의 통제하에 UAS-FUS의 R521C 버려요.
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Discussion
Drosophila 동작 긴밀 유전과 환경 요인에 의해 규제됩니다. 우리와 다른, 이전 행동과 Drosophila 5-19에서 모델로 인간 neurodegenerative 질병의 비행과 관련된 유전자를 검사하기 위해 데이터를 수집하려면 여기를 설명한 assays를 사용했습니다. 크롤링 분석 내용은 제 3 instar의 애벌레에주의 선택은 중요한 단계입니다. 약물로 치료를하면 그것이 좋은 용해도가있는 경우 최대한의 효과를 얻을 10~15분 (또는 더 많은 약물의 종류와 특성에 따라) 소요됩니다. 따라서 정기적으로 먹이를 15 분 동안 마약을 날아 후 테스트하기 전에 추가로 15 분 기다립니다. 그것은 용액에서 약물 농도를 유지하지만, 중요하고, 치료 그룹 사이의 노출 시간, 정확한 비교를 위해 동일. CNS 활성 약물은 일반적으로 지속되는 최대한의 효과를 ~ 45 분한다. 애벌레가 잘 플라이 음식을 제거하고하는 선택 (또는 수유를 파고) 이후에 세차해야허용 크롤링 분석을 시작하기 전에 1 분 acclimatized. 낮은 온도가 애벌레 크롤링 능력에 영향을 미칠 수 있으므로 한천 플레이트는 시간 동안 상온 (~ 22 ° C)에서 보관해야합니다. 애벌레 크롤링 분석은 활동 수준에 관한 중요한 정보를 제공할 수 있지만, 그것은 미묘한 조정 적자의 분석에 적합하지 않습니다. 따라서 심사 플랫폼으로 그것은 총 활동 적자를 검토 첫 패스에 가장 적합합니다.
미세 모터 조정을 포함 성인 행동은 구애와 짝짓기이다. 이 동작은 인간의 질환과 관련된 행동의 측면을 조사하는 데 사용하고, 미세 모터 제어 18 ~ 이외에 감각 처리 (후각, 시각, 음향)를 포함하고 있습니다. 수컷은 암컷을 발견하면, 그 방향 동작 (방향 선회와 여자를 쫓는)와 스테레오 패턴 처음으로 진행 구애 의식을 시작합니다. 이것은 wingsong, 리크린 뒤에있다G와 여성에 대한 복부의 컬링, 여성 genetalia의 태핑, 분 20-22 여러 수만 지속될 수도 결합에 culminates. 구애의 측면에 많은 시각적 단서를 포함하기 때문에 어두운 조건 짝짓기 성능 저하로 이어질하고, 서로를 볼 수 날아 있도록 assays는 충분한 빛이 함께 수행되어야한다. 따라서 흰 눈이 파리는 보통 우리가 설명한 분석에서 매우 저조한 실적을 가지고 있으며 독자가이 프로토콜을 이용하여 실험을 계획에 대해 권고하고 있습니다. 약물과 함께 파리를 치료하는 것은, 중간에 약을 놓으면 파리가에 격리됩니다 (예 : 1% 아가로 오스 + 10 % 자당 + 약물 대신 표준 식품의 미생물에 의해 약물의 가능성 저하를 피하기 위해 약물로 치료를 음식). 일반적으로 파리는 목화와 연결, 그들의 음식의 300-500 ML이 5 ML 테스트 튜브에 격리됩니다. 짝짓기 휠로 전송하기 위해 파리를 마취하지 마십시오. 그것은 내가의 잘 간의 짝짓기 휠 좀 씻어 절대적 잔여 페로몬을 (당시 흔들어으로 탈이온수에서 최소 48 시간 동안 세차 떨고있는 밤이여 alconox 비누 적은 양의 따뜻한 물, 물과 수많은 변화)를 제거하기 위해 사용 . 우리가 설명하는 분석을 수행하는 또 다른 고려 사항은 날씨입니다. 비가하거나 비가 될 것 같습니다되면 우리의 경험은 빠르다는 법정에서되지 않습니다. 연구실은 창문 여부가있는 경우 그들은 상관없이 밝고 화창한 날이면 최선을 수행합니다. 우리의 현재의 이론은 이러한 현상이 대기압과 관련되어있다는 것입니다,하지만 우리는 이것을 조사하지 않았습니다.
기존의 부정적인 geotaxis 분석은 10 초 (에서 설명에서 미리 정해진 높이 위에 올라가서 파리가 얼마나 있는지 측정에 의존 http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). 우리는 고리 분석은 전통적인 분석 통해 특정 장점을 가지고 있다고 생각합니다. 하나는 t이다hroughput, 여섯로 독립적 표준 분석 중 하나에 비해 동시에 측정할 수 복제, 시스템은 일반적으로 확장 가능합니다. 평균 높이가 정의된 기간에 올라왔다 때문에 또 오히려 패스 / 절대적인 높이에 대한 번호를 실패하는 것보다, 계량되는 감도있다. 이 방법을 사용, 좀 더 정교한 결손이 관찰됩니다. 때문에 처리량 수준, 검정은 더 지루한 기존의 부정적인 geotaxis 분석보다는 화면에 더 적합합니다. 또한, Garagano 외. (2005)가 추가 처리량을 증가 고용하는 경우 컴퓨터 채점 방법을 설명합니다. 이러한 분석에 대한 기본적인 고려 사항은 파리 테스트 전에 anesthetized하지 않습니다, 그리고 신선한 튜브는 파리의 새로운 배치는 테스트되기 전에 재판의 주어진 집합 후 사용하는 것이 첩경이라고합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 애벌레 크롤링 데이터를 생성하기 위해 Astha Maltare 감사드립니다. 우리는 원고에 그의 의견을 주심에 닥터 니콜라스 Lanson 주니어 감사드립니다. 이 작품은 존스 홉킨스에서 루게릭병에 대한 로버트 패커드 센터 (UBP까지)와 루게릭병 협회 (UBP)에 의해 지원되었다, 그리고 정신 건강의 국립 연구소 (CDN)에서 R01MH083689.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
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