Summary
Eine schnelle Methode zur Analyse flüchtiger Verbindungen in Obst wird beschrieben. Die flüchtigen Verbindungen in dem Kopfraum eines Homogenats der Probe schnell getrennt werden und damit mit ultra-schnellen Gaschromatographie (GC) mit einem Oberflächenwellen (SAW)-Sensor gekoppelt ist. Ein Verfahren zur Datenverarbeitung und-analyse wird ebenfalls diskutiert.
Abstract
Zahlreiche und vielfältige physiologische Veränderungen auftreten, während der Fruchtreife, einschließlich der Entwicklung eines spezifischen flüchtigen Mischung, die Fruchtaromen charakterisiert. Reife bei der Ernte ist einer der wichtigsten Einflussfaktoren für den Geschmack Qualität von Obst und Gemüse ein. Die Validierung robuste Methoden, um einer raschen Einschätzung der Fruchtreife und Aroma-Qualität würde eine bessere Bewirtschaftung der fortgeschrittenen Zuchtprogramme, Produktionsverfahren und Ernte Handhabung zu ermöglichen.
In den letzten drei Jahrzehnten hat sich viel Forschung durchgeführt, um so genannte elektronische Nasen, die Geräte in der Lage, schnell zu erkennen Geruchs-und Geschmacksstoffe 2-4 sind zu entwickeln. Derzeit gibt es mehrere kommerziell erhältliche elektronische Nasen in der Lage, flüchtige Analyse, auf unterschiedlichen Technologien basieren durchzuführen. Die elektronische Nase in unsere Arbeit verwendet werden (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), besteht aus ultra-schnellen Gaschromatographie mit einem akustischen Oberflächenwellen-Sensor gekoppelt (UFGC-SAW). Reife und Fäulnis Auswertung in Mango-6;; Diese Technologie wurde bereits für seine Fähigkeit, die Qualität von verschiedenen Rohstoffen, einschließlich der Erkennung von Verschlechterung der Apfel 5 überwachen getestet Aroma Profilierung der Thymus Spezies 7; C 6 flüchtigen Verbindungen in Weintrauben 8; Charakterisierung von Pflanzenöl 9 und Nachweis von Verfälschungen in Virgin Coconut Oil 10.
Dieses System kann die drei wichtigsten Schritte der Aroma-Analyse: Headspace-Probenahme, die Trennung von flüchtigen Verbindungen, und Detektion. In etwa einer Minute wird der Ausgang, ein Chromatogramm, hergestellt und nach einem Spülzyklus, das Instrument für die weitere Analyse. Die mit dem zNose erhaltenen Ergebnisse können mit denen anderer gaschromatographische Systeme durch Berechnung der Kovats-Indizes (KI) verglichen werden. Sobald das Instrument mit einem Alkan Standardlösung abgestimmt wurde, werden die Retentionszeiten automatisch umgewandeltKIS. Jedoch werden kleine Änderungen in der Temperatur und Flussrate das mit der Zeit auftreten, wodurch Retentionszeiten zu treiben. Auch abhängig von der Polarität der Kolonne stationären Phase kann die Reproduzierbarkeit von KI Berechnungen mehrere Index-Einheiten 11 variieren. Eine Reihe von Programmen und grafische Schnittstellen wurden daher entwickelt, um berechnete KIS zwischen den Proben in einem halb-automatisiert zu vergleichen. Diese Programme reduzieren die Zeit für Chromatogramm Analyse großer Datenmengen erforderlich ist und um das Risiko für Fehlinterpretationen der Daten, wenn Chromatogramme nicht perfekt ausgerichtet.
Wir stellen eine Methode zur schnellen Analyse flüchtige Verbindung in Frucht. Probenvorbereitung, Datenaufnahme und Verfahren für den Umgang werden ebenfalls diskutiert.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Ernte-Früchte an den gewünschten Reifegrad. Spülen mit Leitungswasser, um Schmutz und Staub zu entfernen.
- Wählen Sie Früchte für die Analyse auf die Abwesenheit von externen und internen Fehlern und Größe Homogenität basiert.
- Schneiden Sie das Obst der Länge nach in Keile für flüchtige Probenahme verwendet werden. Entfernen Sie gegebenenfalls Haut, Samen, Samenhöhle Gewebe oder Grube. Obst Gewebe Auswahl muss für das gesamte Experiment konsistent und berücksichtigen die Variabilität innerhalb einer einzigen Frucht (dh Probe erhalten gleichermaßen von der äquatorialen, Blüte und Stiel Endteile).
- Kombinieren Sie die ausgewählten Obst Gewebe, mischen Sie es, um es zufällig, und dann abwiegen 200 g in einen Mixer geben.
- In 200 ml gesättigter CaCl 2-Lösung (372,5 g bei 20 ° C, in 500 ml VE-Wasser) und 50 ul einer 100 mM Lösung von 2-Methylbutyl Isovalerat in Methanol. Die CaCl 2 zur Verwendung als Inhibitor der enzymatischen ac handelntivität, die nach dem Schneiden und Homogenisieren der Fruchtfleisch auftreten könnten. 2-Methylbutyl Isovalerat wird als interner Standard zugesetzt, um die mögliche Verluste von flüchtigen Verbindungen während der Homogenisierung zu überwachen.
- Homogenisieren Mischung in einer Labor-Mixer (Waring, USA), für 30 Sekunden bei 18.000 UpM, dann sofort in Glasflasche mit Teflon-Dichtung und Deckel gießen. Halten Sie das Homogenat in der Flasche bei Raumtemperatur, bis alle Proben vorbereitet werden.
- Nach dem Gießen des Homogenat in die Flasche 10 Minuten warten, um die Trennung von dem Schaum aus der Flüssigkeit, dann 5 ml Aliquots der Flüssigkeit zu ermöglichen, ohne Schaum, in 20 ml Braunglasflasche, Fläschchen und versiegeln Sie die Flaschen mit Schraubverschlüssen Stahl mit Teflon ausgerüstet / Silikon-Septen. Dieses Verfahren eignet sich für Melone und Birne Homogenat Vorbereitung. Wenn andere Früchte für die Analyse verwendet werden, könnte ein Zentrifugationsschritt erforderlich sein. Daher nehmen Sie den Schaum und dann zentrifugiert, um die Flüssigkeit Pellet-Teilchen, die möglicherweisebehindern die Pipette. Bereiten Sie mindestens drei Fläschchen pro Probe zu dienen als technische repliziert.
- An diesem Punkt können die Proben sofort analysiert werden oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und gelagert bei extrem niedrigen Temperaturen (-80 ° C) für eine spätere Analyse.
- Für tiefgefrorene Proben ist auf die Analyse Tag entfernen die Proben aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen und vor der Analyse, ersetzen Sie die Kappe der durch eine neue, die eine saubere, trockene Septum hat. Wenn das Septum nicht ersetzt wird, kann Wasser auf dem Septum beim Auftauen kondensiert in das Gerät gezogen werden und es beschädigen.
2. Gaschromatographie-Surface Acoustic Wave (SAW-GC) Set-up-und Datenkommunikation
- Legen Sie das entsprechende Analyse-Methode für das zNose.
Für die Analyse der Ester-reiche flüchtigen Profil von Melone, sind unsere Parameter in der Version 5.44.22 Microsense Software (Newbury Park, CA, USA) wie folgt: Kopfraum Ansaugen in dieEinlass für 20 Sekunden bei 30 ml min -1 über Pumpe; Eintrittstemperatur bei 200 ° C; Tenax-Fallen-Temperatur bei 225 ° C; Trägergas (Helium Reinheit 99,999%) Fließgeschwindigkeit von 2,9 ml min-1; Spalte (DB-5 Spalte 1 m × 0,25 mm ID × 0,25 um Filmdicke) Temperaturprogramm von 45 ° C bis 180 ° C mit einer Geschwindigkeit von 10 ° C s -1; Sensor Temperatur bei 40 ° C, Ventil bei 165 ° C Die gesamte Analyse beträgt 1 Minute pro Probe. - Schließen Sie eine Nadel aus Edelstahl mit Nicht-Kern versehene Spitze der zNose Einlass und spülen Sie das System mehrmals mit Umgebungsluft, bis die Basislinie stabil ist und keine Spitzen mehr als 200 Counts (Ct) werden erkannt.
- Stimmen Sie das Instrument mit einer Lösung von geradkettigen Alkanen (C6-C14). Die Melodie wird mit dem Instrument-Software verwendet, um die Verweilzeit der eluierten Peaks von Zeiteinheiten umwandeln in Kovats-Index (KI) Einheiten. Folglich, nachdem das System eingestellt ist, werden die Verweilzeiten in KI-Einheiten angegeben. Vor der Analyse der Probe zu ermöglichen für 30 min lang sich ausgleichen. Um eines der Probenfläschchen analysieren, legen Sie eine Nadel in die Fläschchenseptum, um den Druck zu entlasten. Dann führen Sie die Nadel an das Instrument angeschlossenen Einlass in die Fläschchenseptum und initiieren Headspace Sampling. Analysieren Sie mindestens drei technischen Replikate pro Probe.
- Manuelles Starten des Gerätes, indem Sie auf "Play" drücken, die Pumpe aktiviert wird und zieht sich die Dämpfe über der Probe zu präsentieren. Am Ende der Analyse, wird ein Chromatogramm auf dem Bildschirm, und der Sensor wird automatisch auf 150 ° C für 10 Sekunden erhitzt, um es zu reinigen. Wenn das System Status-Box-Taste wieder gelb wird, ist das Instrument bereit, eine weitere Probe zu analysieren.
- Um eine stabile Grundlinie und ordnungsgemäße Reinigung des Systems zu gewährleisten, führen Sie mindestens eine leere Luft zwischen jeder Probe. Um auf mögliche flüchtige Verunreinigungen aus dem Fläschchen und Kappe überwachen, analysieren zwei Fläschchen-Rohlinge (leeres Fläschchen mit Kappe), am Anfang und am Ende des Tages. </ Li>
3. Datenexport und-analyse
- Exportieren Sie die Daten in eine Microsoft Excel-Datei nach der Übernahme mit dem "Peak Logging"-Funktion in Microsense Software. Sobald die Daten exportiert werden, fügen Sie Spalten mit Etiketten für Variablen und repliziert.
- Verwandeln Sie das Datenformat für eine einfachere Manipulation mit dem Python (Version 2.6; frei verfügbaren Online-) Skript, das wir entwickelt, mit dem Namen "reform_data.py" (siehe Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für das Datenformat vor und nach mit dem Skript "reform_data. py "). Der Name der Quelldatei (xls-Format) und Blattname für die eingegebenen Daten sowie den gewünschten Dateinamen für die Ausgabe (xls-Format), werden direkt in dem Skript bearbeitet.
- Start "kim_interface.py" (auch in Python 2.6 geschrieben; siehe Abbildung 2), und importieren Sie die Daten aus der Datei im vorigen Schritt generiert. Insbesondere wird die Analyse zum Anzeigen und Analysieren der Anzahl, wie oft jeder KI-Wert festgestellt wurde basierend("KI Hits"). So zeigt das Programm ein Balkendiagramm der KI Treffern für jedes KI-Wert.
- Werten Sie die KI Treffern spezifischer Untergruppen von Proben, die Analyse jede Gruppe von technischen Replikaten zusammen. Dazu analysieren jede Behandlung oder Variable einzeln, indem Sie / Deaktivieren der entsprechenden Felder ein. Siehe Abbildung 2 Beschriftung für detaillierte Beschreibung der grafischen Benutzeroberfläche (GUI)-Funktionen.
- Nach der Identifizierung der Breite der einzelnen KI-Fenster über die GUI, nach dem Zufallsprinzip auszuwählen einige der entsprechenden Chromatogramme in Microsense Software und bewerten überlappenden Peaks unter den technischen Replikaten. Siehe Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für überlagerte Chromatogramme von zwei technischen Replikaten.
- Sobald die KI-Fenster wird individualisiert, verwenden Sie die "Merge"-Funktion finden Sie in der GUI die KIS, die im Fenster fallen, in den am dichtesten bevölkerten KI verschmelzen. Mit Hilfe dieser Funktion werden Peaks mit einer Reihe von KI-Werte beschriftet unter einem KI-Label, allowi konsolidiertng der Behandlung solcher Gipfel als eine einzelne Variable.
Um dies zu tun, zuerst auf dem "Merge"-Taste klicken, um die Funktion zu aktivieren und wählen Sie den am dichtesten bevölkerten KI als die Mitte des Fensters mit der linken Maustaste die entsprechende Leiste. Sobald die Leiste ausgewählt wurde, ändert es seine Farbe und wird grün. Um die KIS, die innerhalb des Fensters lassen sich in dem ausgewählten KI verschmelzen, auf den entsprechenden Balken der rechten Maustaste auf, dies bewirkt, dass die Balken rot werden, während ein blauer Balken der entsprechenden Länge auf der Oberseite des zentralen KI hinzugefügt wird (siehe Abbildung 4 ). Nachdem alle ausgewählten KIS haben in den entsprechenden zentralen KI wurden zusammengelegt, auf der "Merge"-Taste erneut klicken, um die Änderungen zu akzeptieren; dies bewirkt die "Merge"-Taste, um vergilben. Bei Fehlern wird die 'Unmerge "-Taste zur Verfügung. Um unmergen, klicken Sie auf den 'Unmerge' Button in der GUI, dann auf die rote Leiste Sie unmergen rechten Maustaste darauf. Von rot, wird der Balken blau. Klicken Sie auf die 'Unmerge' Taste erneut, um die Änderungen zu übernehmen. - Wenn man versucht, incorrectly verschmelzen zwei Peaks in einer einzigen Probe in einem einzigen KI-Wert, wird eine Fehlermeldung ausgegeben. In einem solchen Fall genau zu prüfen, das Chromatogramm und definieren die KI-Fenster in dieser Region.
- Nachdem alle der fusionierenden Operationen durchgeführt worden sind, speichern Sie die Datei.
- Bevor Sie mit statistischen Auswertung werden die Chromatogramme der Luft und Fläschchen Leerzeichen analysiert, um mögliche Verunreinigungen zu überwachen. Sobald die KI der Spitzen in die Lücken identifiziert worden sind, subtrahiert die Fläche des Peaks in der Luft und / oder Fläschchen-Rohlings aus der Fläche des Peaks in der Probe vorhanden erkannt.
Dann mit statistischer Analyse fortzufahren.
4. Repräsentative Ergebnisse
Die elektronische Nase war in der Lage, Unterschiede in der flüchtigen Profile unter Melonenfrucht an verschiedenen Reifestadien (Abbildung 5) geerntet zu erkennen. Zwanzig KI Fenster wurden in allen Proben identifiziert. Eine Varianzanalyse zeigte, dass 14 Gipfel Detected durch die elektronische Nase deutlich zwischen Reife Stufen variiert. In Abbildung 6 werden die Protokolldateien der mittleren Peakflächen von diesen 14 Komponenten aufgetragen, um Unterschiede in der Peak-Häufigkeiten zwischen zwei Reifestadien, früh reif und voll reifer Früchte zu zeigen.
1. Beispiele für Datenformat Gerätesoftware (A) und nach der Transformation unter Verwendung "reform_data.py" Skript (B). Ausgeführt Um die Datenmanipulation und Analyse zu erleichtern, alle eindeutigen KIS in allen Proben identifiziert werden, dann werden die Daten mit der Probe Informationen in Zeilen und Peakfläche in Spalten, entsprechend einzigartigen KIS neu geordnet werden. Wenn ein Peak nicht für eine KI-Wert in einer Probe nachgewiesen, bleibt die entsprechende Zelle leer.
Abbildung 2. Screen Capture aus der Taschet Datei "kim_interface.py". Das Grundstück in der Mitte zeigt Anzahl der Treffer pro KI gegen KI. "Hit pro KI 'ist die Anzahl der Proben, bei denen ein Peak mit diesem spezifischen KI erkannt wurde. Auf der linken Seite gibt es drei gelben Kästen die Steuerung der ausgewählten Daten. Sie zeigen, um den Parameter-Datensatz (Behandlungen, repliziert, qualitative Variablen, etc.) zu unterteilen. In dieser Abbildung sind sie (von oben nach unten): Variety, Bepflanzung Datum und Reifephase bei der Ernte. Auf dem Boden: mit einem Klick auf den 3 Bars und das Bewegen der blaue Balken nach links oder nach rechts, kann man wählen Sie den minimalen und den maximalen Wert des KI-Bereich und der minimalen Peakfläche ("Threshold"). Auf der rechten Seite: die "Merge"-Taste erlaubt das Zusammenführen von manuell ausgewählten KIS einen Klick auf den Balken in der Handlung. Die 'Unmerge' Button erlaubt es, den Prozess für ausgewählte Fälle rückgängig zu machen.
Abbildung 3. Überlagerte Chromatogramme (in schwarz und rot) von zwei technische Replikate aus Melone flüchtigen Kopfraum, um eine Verschiebung der Retentionszeit zu illustrieren.
Abbildung 4. Beispiel für die Verschmelzung KI Prozedur. In der zentralen Handlung, stellt der grüne Balken (Central KI) das bevölkerungsreichste KI, die als Zentrum der KI-Fenster ausgewählt wurde. KI und KI X Y KIS fallen in das Fenster von Interesse und sie benötigen, um in den zentralen KI zusammengeführt werden. Mit der rechten Maustaste auf KI X-Bar, wird sie rot und, zur gleichen Zeit, wird ein blauer Balken die gleiche Länge von KI X-Bar, auf der Oberseite der grünen. Durch Wiederholen der gleichen Verfahren wie für KI Y, die Länge des blauen Balken (fusioniert KIS) wird der entsprechende Länge zu vergrößern. Sobald alle KIS wurden hinzugefügt, indem Sie auf den grünen "Merge"-Taste, um die Zusammenführung Enden, werden die Änderungen gespeichert, und die Farbe der Schaltfläche wird gelb.
/ Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg "/>
Abbildung 5. Zwei Chromatogramme von Melone Proben bei verschiedenen Reifestadien geerntet, reifen früh (oben) und vollreife (unten), um die Fähigkeit der elektronischen Nase auf Unterschiede in volatilen Häufigkeiten feststellen zu illustrieren.
Abbildung 6. Radar Diagramm, das die Peakfläche von 14 vorhandenen Komponenten in zwei Melone Proben an zwei verschiedenen Reifestadien, früh reif und voll reif. Die Peakflächen werden in Log-Skala gemeldet, um den Vergleich zu visualisieren. Die Zahl am Ende jedes Strahls stellen die entsprechenden Kovats-Indizes.
Discussion
Elektronische Nasen sind eine vielversprechende Methode für die schnelle, objektive Bewertung der Aromaprofile aus Früchten oder volatile-reichen Proben. Allerdings verschiebt sich in Verweildauer stellen eine Herausforderung für die Identifizierung der Peaks und könnte zu Fehlinterpretationen der Daten führen, wenn zwei Chromatogramme nicht perfekt ausgerichtet sind. Visuelle Inspektion der Chromatogramme zeigten, dass die Variabilität der Retentionszeiten unter den Proben häufig verursacht die gleiche Spitze mit leicht unterschiedlichen KI-Werte (etwa ± 10) gekennzeichnet werden. Diese in eine übertriebene Anzahl von einzigartigen KIS erkannt übersetzt. Um die Vorteile der Sachlage treffen, dass (a) verschiedene Verbindungen befinden sich in unterschiedlichen Reifestadien vorhanden und (b) technische Replikate sind annähernd identisch, zwei Computer-basierte Skripte ("kim_merge.py", die die Routinen enthält für das Handling der Daten gewählt ist und "kim_interface.py", die eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) bietet) wurden systematisch entwickeltVergleich von Proben in einem semi-automatisiert, sehr zur Verringerung der Zeit für Chromatogramm Analyse großer Datenmengen benötigt werden. Diese Programme erlauben die Zusammenführung gegebenenfalls von Spitzen mit einer Reihe von KI-Werte unter einem KI Marker markiert ist. Dies dient zwei wichtigen Zwecken: (a) Es ermöglicht eine statistische Analyse auf solche Peaks als eine einzelne Variable zu behandeln, und (b) es ermöglicht Identifizierung der Peaks und Vergleich zu anderen Systemen und veröffentlichten Werten. Hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass Melone Proben basierend auf Reife und Aroma-Profiling mit dem zNose System in Kombination mit angemessener KI Identifizierung konnte nicht benachteiligt werden. Dies stellt eine viel versprechende neue Technologie für die Analyse von flüchtigen Stoffen, die für die Qualitätskontrolle Programme verwendet werden können.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Bill Copes (Harris Moran Seed Company, Davis) zur Bereitstellung von Melone Früchte für diese Analyse. Dieses Projekt wird von der Sonderkulturen Research Initiative Competitive Grants Program unterstützt gewähren keine. 2009-51181-05783 von der USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-Methylbutyl isovalerate | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, natural, FCC |
| Methanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Vial | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Cap | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Laboratory blender | Waring Laboratory | 7009G | 2-speed blender; 1- Liter glass container |
| Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 mL; polypropylene plug-seal |
| Needle | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | Side hole luer |
| Alkanes solution | Electronic Sensor Technology | C6-C14 alkanes solution in methanol | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 GC column | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Freely available on-line | ||
| "reform_data.py" and "kim_interface.py" scripts | Scripts available as supplementary material on JoVE |
References
- Kader, A. A. Flavor quality of fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).
- Persaud, K., Dodd, G. Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose. Nature. 299, 352-355 (1982).
- Gardner, J. W., Bartlett, P. N.
- Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. Electronic nose: Current status and future trends. Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).
- Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose. Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).
- Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection. J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).
- Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species. J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).
- Watkins, P., Wijesundera, C. Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds. Talanta. 70, 595-601 (2006).
- Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose. Food Chem. 89, 507-518 (2005).
- Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein. Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).
- Evans, M. B., Haken, J. K. Recent developments in the gas-chromatographic index scheme. Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).
