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Immunology and Infection

Un système de neurones primaires de la culture pour l'étude de l'herpès simplex virus de latence et de réactivation

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

Le protocole décrit un système de modèle efficace et reproductible pour étudier l'herpès simplex virus type 1 (HSV-1) temps de latence et la réactivation. Le dosage utilise des cultures de neurones sympathiques homogènes et permet pour la dissection moléculaire des virus de neurones interactions en utilisant une variété d'outils, y compris l'interférence ARN et d'expression de protéines recombinantes.

Abstract

Herpes simplex virus de type 1 (HSV-1) établit une infection latente long de la vie dans les neurones périphériques. Ce réservoir latent est la source d'événements récurrents qui réactivation d'assurer la transmission et de contribuer à la maladie clinique. Antiviraux actuels n'ont aucune incidence sur le réservoir latent et il n'existe aucun vaccin. Bien que les détails moléculaires de la réplication lytique sont bien caractérisés, les mécanismes de contrôle de latence dans les neurones restent insaisissables. Notre compréhension actuelle de la latence est dérivé d'études in vivo utilisant des modèles de petits animaux, qui ont été indispensables pour définir les exigences de gènes viraux et le rôle des réponses immunitaires. Cependant, il est impossible de distinguer les effets spécifiques sur la relation virus-neurone à partir des conséquences plus générales de l'infection médiée par les cellules immunitaires de soutien ou de non-neuronale dans les animaux vivants. En outre, l'expérimentation animale est coûteux, chronophage, et limitée en termes d'options disponibles pour la manipulation de l'hôteprocessus. Pour surmonter ces limitations, un système de neurones seule est désespérément nécessaire qui reproduit les caractéristiques de l'in vivo de la latence et la réactivation, mais offre les avantages de la culture de tissus en termes d'homogénéité et de l'accessibilité.

Nous présentons ici les plus un modèle in vitro utilisant cultivées primaires neurones sympathiques de rat ganglions cervicaux supérieurs (SCG) (Figure 1) pour étudier le HSV-1 de latence et la réactivation qui correspond si ce n'est pas tous les critères souhaités. Après avoir éliminé les cellules non neuronales, près homogènes TrkA + de cultures de neurones sont infectés par le HSV-1 en présence d'acyclovir (ACV) pour supprimer la réplication lytique. Après l'enlèvement ACV, non-productives HSV-1 infections qui présentent fidèlement caractéristiques reconnues de latence sont efficacement mis en place. Notamment, les ARNm lytiques, les protéines et de virus infectieux devenir indétectable, même en l'absence de sélection, mais la latence associée à la transcription (LAT) exprimentions persiste dans les noyaux des neurones. Les génomes viraux sont maintenus à un nombre de copies en moyenne de 25 par neurone et peut être amené à répliquer de manière productive en interférant avec la PI3-kinase / AKT signalisation ou le retrait pur et simple du facteur de croissance nerveuse 1. Un EGFP recombinante HSV-1 fusionnée à la codage virale protéine lytique Us11 fournit une fonction, en temps réel marqueur pour la réplication résultant de réactivation qui est facilement quantifié. En plus de traitements chimiques, les méthodes génétiques telles que la livraison interférence ARN ou d'un gène par des vecteurs lentiviraux peut être appliquée avec succès au système permettant d'études mécanistes qui sont très difficiles, voire impossible, chez les animaux. En résumé, la CTB à base de HSV-1 de latence / réactivation du système fournit un outil puissant, nécessaire pour élucider les mécanismes moléculaires contrôlant la latence et la réactivation de HSV1 dans les neurones, un puzzle de longue date en virologie dont la solution peut offrir des perspectives nouvelles dans le développement de nouvelles thérapies qui t cibleil latente réservoir herpèsvirus.

Protocol

1. Isolement et culture des neurones d'embryons de rat CTB

Pour fournir un contexte utile pour la compréhension de ce protocole, et pour une discussion approfondie de la littérature plus tôt que les méthodes établies de CTB neurone culture, y compris la base de la CTB en culture in vitro, la plaque de revêtement des substrats, et les composants de milieux exempts de sérum, la lecteur est renvoyé aux références 2-4.

  1. L'utilisation de rats en tant que source pour les neurones SCG a été menée conformément aux lignes directrices des NIH en vertu d'un protocole actif approuvé par le soin des animaux institutionnel et de l'utilisation du Comité (IACUC).
  2. Avant de commencer la dissection, de préparer le collagène et la laminine enduit 96 et des boîtes de culture de tissus. L'utilisation d'un dispositif de pipetage à canaux multiples, remplir tous les 96 puits avec une solution contenant 0,66 mg / ml collagène de queue de rat. Enlever immédiatement le collagène, ce qui peut être récupéré et utilisé pour un maximum de 8 dissections. Après avoir retiré til collagène, il est très important de laisser sécher les puits sous une hotte à flux laminaire. La quantité de temps qu'il faut pour sécher dépend du nombre de puits dans le plat. Par exemple, il faut généralement environ 5-10 min. pour les puits dans un plat de 96 puits à sec, mais peut prendre jusqu'à 30 à 40 min si un plus grand format de 24 plat bien est utilisé. Le défaut de sécher correctement les résultats des puits dans l'attachement CTB pauvres. Ensuite, répétez la procédure en utilisant une solution de 2 pg / ml de laminine. Incuber la solution la laminine d'au moins 2 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 humidifié jusqu'à ce que vous êtes prêt à plaque de vos neurones (étape 1.14).
  3. Obtenu dans le commerce des rats femelles enceintes sont euthanasiés en utilisant le CO 2. Après la pulvérisation du cadavre avec de l'éthanol 70%, une incision en forme de U est faite autour de l'abdomen. Après enlevant la peau, une seconde en forme de U incision est faite à travers la paroi musculaire abdominale. L'utérus est visible lors de la levée jusqu'à la couche musculaire abdominale. Retirer de l'utérus et le lieu en 15vaisselle cm. Ouvrez soigneusement l'utérus en utilisant un ciseau émoussé pour éviter d'endommager les petits à l'intérieur. Chaque chiot doit être libéré de son sac embryonnaire, le cordon ombilical coupé, et le chiot essuyer avec de l'éthanol 70% et Kimwipes.
  4. Travailler à une hotte de dissection, sacrifier à naître chez le jeune rat E21 par cisaillement de la tête du torse. Visent les ciseaux à la base du cou, juste au-dessus des épaules. Pour exposer les ganglions, la broche en bas de la tête (cou vers le haut) à partir de 23 aiguilles G à trois endroits: i) la moelle épinière; ii) la peau antérieure tiré vers le haut sur le nez et épinglé, et iii) l'œsophage / trachée doit être épinglé l'écart de la base du cou.
  5. Recherchez le * deux CTB positionnés de chaque côté de la bifurcation carotidienne (deux SCGs par embryon). La CTB est situé juste en dessous de la branche. Séparer la CTB à partir des artères en tirant la bifurcation de l'autre. Placez les ganglions dans 12 ml de L15-media (supplémenté avec 0,4% D (+)-glucose) dans 15 ml tube conique sur la glace.

* La CTB est translucide et incolore par rapport à l'opaque, le tissu adipeux jaune qui entoure la bifurcation. Essayez d'enlever autant des vaisseaux et du sang des tissus résiduels adipeux, avant de recueillir les ganglions.

  1. Répétez 1.4 et 1.5 jusqu'à ce que tous SCGs sont récoltées à partir des embryons.
  2. Doucement centrifuger les ganglions pendant 1 min à 600 tours par minute et aspirer les feuilles excédentaires.
  3. Remettre en suspension les ganglions dans 1 ml de trypsine L15-media contenant (0,25%, sans EDTA) et de la collagénase (1 mg / ml). Incuber pendant 30 min à 37 ° C, agiter toutes les 10 min.
  4. Ajouter 10 ml de C-media (1x MEM, 0,4% D (+)-glucose, 2 mM de L-glutamine, FBS 10%) pour inactiver la trypsine et centrifuger pendant 1 min à 600 rpm.
  5. Retirez autant des médias trypsine / collagénase que * possible et lavez-les ganglions avec 10 ml de C-Media. Centrifuger 1 min à 600 rpm. Répétez cette étape une fois.

Collagénase * résiduelle sera interférencesre avec le substrat de collagène nécessaire pour la fixation des cellules sur la plaque de culture.

  1. Retirez le support de lavage et de remettre en suspension les ganglions dans 1 ml de C-médias et triturer en utilisant l'aiguille de calibre 21 attaché à une seringue de 5 ml à dissocier de grosses touffes de cellules *. Terminer triturant avec aiguille de calibre 23 G jusqu'à ce que les amas visibles sont dissociées.

* Soyez prudent de ne pas trop triturer, car cela pourrait endommager les cellules. Si la trypsine et traitement à la collagénase a été un succès, un maximum de quinze de haut en bas des cycles avec l'aiguille de 21 G, et trois cycles avec l'aiguille 23 G devrait être suffisant.

  1. Filtrer les neurones dissociés au moyen d'un filtre à 70 microns en nylon [crépine BD Biosciences cellule] dans un tube conique de 50 ml de se défaire les grumeaux restants.
  2. Retirer une aliquote de 10 pl de la suspension cellulaire filtré et mélanger avec du bleu trypan pour déterminer le nombre de cellules vivantes. Comptez le nombre de cellules qui ont activement horsude le colorant à l'aide d'un hémocytomètre.
  3. Retirer la solution la laminine des 96 plats et d'attente dans l'incubateur à 37 ° C (voir l'étape 1.2). Ne pas laisser sécher la vaisselle, il peut être utilisé immédiatement pour étalement des cellules une fois que la laminine est retiré. Distribuer * Les totaux des cellules vivantes 5000-6000 (50 - 100 ul par puits) dans le collagène et la laminine pré-enduit 96 plat bien la culture de tissus. Inclure 50 ng / ml de facteur de croissance nerveuse (NGF) dans le C-media.

* Il est essentiel d'employer une technique stérile bonne culture de tissus parce que les antibiotiques sont omis dans les milieux de croissance. En outre, il peut y avoir une variabilité importante entre les collagène provenant de fournisseurs différents. Nous avons eu des résultats cohérents à travers les lots à l'aide du collagène de queue de rat de Millipore.

  1. A DIV (jour in vitro) 1, remplacer les C-média utilisé à l'assiette des cellules avec 50 NBM ul (0,4% D (+) - glucose, 2 mM de L-glutamine, B-27 supplément contenant 50 ng / ml de NGF, 5aphidicoline uM et 20 uM de 5-fluoro-uracile [5-fluoro-2'-désoxyuridine]. Incuber les cultures pour 5 jours *. À ce stade, trypsinizing et le comptage des cellules restantes dans plusieurs puits peut déterminer le nombre de neurones survivants le traitement agent anti-mitotique. En règle générale, environ 1.000 neurones restent par puits dans une plaque à 96 puits.

* Problèmes avec la contamination bactérienne ou fongique sont habituellement évidents dans les premières 24 heures de culture. Examinez attentivement chaque puits pour la croissance microbienne avant de remplacer des milieux d'étalement. Si seulement un nombre limité de puits sont affectés, ils peuvent être traités avec une solution eau de Javel diluée, rincé avec du PBS et séchées afin de procéder à l'expérience. Nous recommandons de répéter toute expérience où même un nombre limité de puits avait une contamination microbienne. Si la contamination microbienne importante est observée dans le plat de 96 puits, l'expérience doit être résilié.

2. Infection de la SCG Cultmesures de protection contre le HSV-1 Us11-EGFP et établissement de la latence

Pour des renseignements utiles sur les techniques virologiques, y compris la propagation du virus de base, titre du virus de déterminer, et la multiplicité d'infection (MOI), le lecteur est renvoyé à la référence 5. Pour une discussion de la biologie de l'herpès, le lecteur est renvoyé à la référence 6. Enfin, le lecteur est renvoyé aux références 7-10 pour des exemples antérieurs, d'autres protocoles, et le fond supplémentaire concernant l'alpha-herpèsvirus infection lytique des neurones SCG et pour la comparaison avec les adaptations de notre protocole d'étudier la latence et la réactivation.

  1. A DIV 6, ajouter l'acyclovir (ACV), la concentration finale de 100 uM pour les médias existants dans chaque puits *. Par exemple, si chaque puits contient 50 pi, ajouter 25 ul d'un stock 300 uM ACV. En règle générale, ACV est ajouté dans la nuit avant l'infection, mais peuvent également être ajoutés 6-8 heures avant l'infection.

* Il est exceedingly importante nécessaire pour minimiser la manipulation physique de la neurone en tout temps. Il suffit de retirer et de remplacer les médias ou d'infecter avec des stocks de virus doit être fait très lentement et avec précaution. Sinon, le stress qui en résulte mécanique peut nuire à la viabilité à neurone.

  1. A DIV 7, infecter les cultures CTB avec HSV-1 Us11-EGFP (décrite dans ref 11) à une multiplicité d'infection (MOI) entre le 1 er -2 (voir remarque importante ci-dessous sur la détermination de MOI optimale) *. Ajouter le virus dilué directement aux médias existants dans le puits. Inclure un contrôle maquette infecté et un contrôle de l'infection lytique positif dans les médias qui n'ont pas ACV. Autoriser l'infection se poursuivre pendant 2-3 h à 37 ° C.

* IAM est calculée en utilisant titre de virus déterminé par réalisation d'un essai de plaque dans des cellules Vero 12 et le nombre de cellules vivantes, des plaqués culture par puits dans l'étape 1,14. Ce calcul n'est utile que dans un sens opérationnel,que le nombre total de cellules ensemencées contient neurones avec glie contaminant, et fibroblastes. Comme ces cellules contaminantes division sont tués par un traitement avec des agents anti-mitotiques, l'efficacité MOI pour les neurones survivants est en fait plus. De la quantité initiale de départ de 5.000 - 6.000 cellules vivantes, environ 1.000 neurones restent après le traitement avec des agents anti-mitotiques (telle qu'évaluée par le comptage des cellules trypsinizing et direct). Le MOI optimale à utiliser lors de l'infection des cultures de neurones peut varier quelque peu d'une préparation de la pâte virus à l'autre. Avec tous les préparatifs nouveau virus, nous vous recommandons de tester une gamme limitée de différents MOI de 1 à 2. Le but ici est d'identifier celui qui a le moins d'effets sur la viabilité des neurones et les résultats dans le plus grand nombre d'événements de réactivation inductible (défini à l'article 3). Le virus Us11-EGFP est particulièrement utile dans l'optimisation rapide des conditions, mais on peut aussi utiliser des affichages d'autres tels que dosage de plaque ou de quantitéssentant PCR. Il peut être utile d'utiliser un virus purifié grâce à un coussin de saccharose pour éliminer les impuretés qui réduisent la viabilité des cellules, si ce n'est pas essentiel et pas effectué systématiquement.

  1. Replacez soigneusement les médias d'infection avec NBM frais contenant 50 ng / ml de NGF et 100 * uM ACV.

* Il est extrêmement important d'être extrêmement douce lorsque vous modifiez les médias d'infection. Dirigez la pointe de la pipette à la paroi du puits plutôt que dans le bas du puits, et permettre aux médias de faire glisser doucement vers le bas sur les cellules. Même éjection rapide de support de la pipette peut générer une force suffisante pour détacher les axones à partir du substrat et de provoquer des cellules à dépouiller de généralement comme une feuille de cellules. Si seulement un nombre limité de neurones detach (20-30%), les conséquences sont minimes à condition que les cellules semblent en bonne santé. Les neurones individuelles sont susceptibles de remettre en place au fil du temps, cependant, les axones ne sera plus très bien adressé uned de nouveaux axones repoussent. Bien que n'étant pas optimale, l'expérience peut avoir lieu si seulement un nombre limité de puits sont affectés. Si il ya un détachement extensif de neurones (70-80%), nous ne recommandons pas compris le bien affecté (s) dans l'expérience. Si la majorité des puits contiennent 70-80% des neurones individuelles, nous vous recommandons de terminaison de l'expérience. Bien que les neurones peuvent encore remettre en place, ils feront généralement de grosses touffes. Cela complique l'évaluation correcte des neurones individuels réactivées. Nous recommandons de répéter toute expérience où les puits avec les neurones individuelles ont été observées pour assurer que les taux de réactivation ne sont pas influencés par l'adhésion différentielle des neurones dans les puits.

En outre, il est essentiel de toujours traiter les cultures aussi doucement que possible. Le stress mécanique de mouvements brusques inutiles, y compris (ouverture et fermeture répétée d'une porte de l'incubateur de chambre) ou énergique application multimédia ccompromis ould la capacité des cultures à l'appui de HSV-1 de latence, peut-être traduit par un taux anormalement élevé de réactivation spontanée dans une expérience donnée.

  1. Maintenir les cultures pendant 6 jours, pendant lesquels le virus se mettre en place de latence. Pendant cette période, utiliser un microscope à fluorescence pour surveiller la santé et neurone Us11-EGFP expression en tant qu'indicateur de la réplication lytique. US11-EGFP devrait être détecté uniquement dans les puits de contrôle qui n'ont pas de traitement ACV, indiquant la primo-infection réussie et productive de réplication lytique. Les neurones peuvent montrer des effets cytopathiques même en l'absence de croissance virale productive. Les cultures infectées doivent être étroitement surveillés et par rapport à la maquette infectés neurones.

3. Réactivation et d'évaluation

  1. A DIV 14, replacez soigneusement les médias ACV contenant du milieu frais qui n'ont pas ACV. Le cas échéant, inclure pharmacologiques (ou biologique) des variables à cette époque. Soyez sure à suivre les précautions indiquées à la section 2.3.
  2. Au cours d'une période de 5 à 6 jours, surveiller les cultures vivantes en utilisant un microscope à fluorescence pour détecter les neurones subissent de réactivation. Sinon prélever des échantillons pour d'autres types d'analyses (protéines, acides nucléiques, etc dosage de plaque).
  3. Calculer la fréquence de réactivation en comptant le nombre de puits contenant EGFP-positives expriment cette neurones et en proportion du nombre total de puits d'échantillon. Notez que l'expression EGFP chez un individu ne fait pas de distinction entre bien d'un événement de réactivation primaire et une infection ultérieure en raison de la propagation du virus. Depuis la propagation infectieuse est contenue à une culture unique et bien, un ou plusieurs EGFP-positifs neurones dans un puits est opérationnel défini comme un événement de réactivation dans ces conditions.

* Les événements de réactivation multiples peuvent se produire dans une culture, tel que décrit en 1. Pour distinguer un événement de réactivation primaire à partir de la propagation du virus résultant de réactions vation, l'inhibiteur de l'encapsidation-WAY 150138 peuvent être ajoutés. En bloquant l'encapsidation, le virus infectieux n'est pas produite et la propagation résultant de la réactivation n'est pas possible. Ainsi, le signal détecté EGFP en présence d'WAY-150138 reflète le nombre d'événements indépendants de réactivation dans une culture singe bien 1,13-15. Notez que WAY-150138 n'est efficace que contre l'HSV-1 souche Patton et non disponible dans le commerce. Comme une alternative à WAY-150138, pensez à utiliser une des méthodes suivantes: i) un virus mutant altéré dans sa capacité de se propager aux cellules voisines peuvent être utilisés; ii) un virus journaliste où EGFP est exprimé à partir d'un promoteur IE dans la présence continue de vinaigre de cidre; iii) le traitement par AAP ou ACV pour empêcher l'expression des gènes en retard (et la production de virus infectieux) suivie par immunofluorescence utilisant des anticorps dirigés contre un produit de gène IE.

4. Autres méthodes d'évaluation de réactivation en utilisant le test

ONTENU "> Les résultats d'une personne, une seule expérience devrait être obtenu à partir d'une seule préparation de la SCG. expériences répétées peuvent être réalisées avec des préparations CTB indépendants aussi longtemps que chaque répétition a été réalisée en utilisant un lot unique SCG.

  1. Évaluation de HSV-1 transcriptions lytiques. Recueillir des ARN à des moments souhaités après enlèvement VBC, en présence ou en l'absence de différents inducteurs expérimentales de réactivation. Lors de l'utilisation des plaques à 96 puits de culture, nous recommandons la mise en commun d'au moins 20 puits ainsi que pour chaque échantillon (environ 10 5 cellules par échantillon d'ARN). Alternativement, SCGs peuvent être plaqués dans les grandes puits (par exemple pour une plaque 24 puits, utilisez 4-5 x10 4 cellules / puits). Bien qu'il soit certainement possible de détecter l'ARN de moins de 20 puits, les petits volumes résultat impliqué dans injustifiée échantillon à échantillon variabilité.
  2. La détection de HSV-1 protéines lytiques. Recueillir lysats à une heure après l'induction de la réactivation. Ajouter 7,5 ul de tampon de lyse à chacun des 10 waunes dans une plaque de 96 puits et d'analyser par SDS-PAGE et immunoblot. Alternativement, les protéines virales peuvent être détectées par immunofluorescence indirecte. Le placage initiale doit être fait sur un substrat monté pour l'imagerie comme une lamelle de verre stérile qui a été pré-enduit avec de la poly-D-lysine (0,2 mg / ml, Sigma) avant l'application de collagène et la laminine (voir 1.10) .
  3. La détection de particules infectieuses. Recueillir le surnageant de culture lors de la réactivation. Effectuer un essai de plaque sur des monocouches de cellules Vero utilisant des dilutions successives du surnageant. En outre, les essais de plaque peut être réalisée en utilisant des lysats de congelé-décongelé cultures à inclure des particules associées aux cellules pour déterminer le titre.

5. Les résultats représentatifs

Figure 2A illustre un exemple où 1 trichostatine uM A (TSA), un inducteur connu de la réactivation 16-18, est appliqué à la CTB cultures infectées de façon latente avec le H de type sauvageSV1 souche rapporteur de l'EGFP-Us11. Avec TSA, la réactivation atteint 50% du maximum dans les 2 jours, et par 5 jours de la réactivation de plateaux à environ 60% des puits. Ligne de base («spontané») la réactivation est d'environ 10% dans cette expérience et est généralement comprise entre 10-20% en utilisant ce système in vitro. Niveaux de réactivation maximales varient en fonction de la réactivation inducteur est utilisé. Inducteurs de réactivation Beaucoup peut être appliqué pendant toute la durée de l'expérience car ils n'interfèrent pas avec la réplication virale productive, mais cela doit être déterminé de manière empirique. D'autres inducteurs, y compris n'importe quel réactif qui affecte la viabilité des neurones ou entrave l'achèvement du cycle de vie productive virale, peut exiger une application impulsion transitoire de provoquer la réactivation.

Alors que l'accumulation de la EGFP-Us11 dans chaque puits de l'expérience décrite dans la figure 2A est une indication de la réactivation de la latence, il ne distingue pas si leUs11-EGFP signal dans les neurones individuels est dérivé d'un événement de réactivation indépendante, ou la propagation d'un virus réactivé par la culture. Pour évaluer le nombre de neurones qui subissent les événements de réactivation indépendants dans chaque puits, les cultures ont été pré-traitées avec WAY-150138, un composé qui bloque spécifiquement la propagation du virus en empêchant l'encapsidation de l'ADN viral du génome 13-15. Infectés des cultures de neurones sympathiques ont été traités avec WAY-150138 et la réactivation induite par TSA. Un nombre important de EGFP-neurones positifs ont été détectés seulement dans les puits TSA-traitées, par rapport à des cultures de contrôle DMSO-traités, ce qui démontre qu'un certain nombre d'événements indépendants se produisent par la réactivation de la culture individuelle (figure 2B).

Dans notre test, le journaliste Us11-EGFP est exprimé à partir du promoteur endogène Us11 11. Depuis Us11 est un «vrai-tard" ou γ 2 gène viral lytique, réplication de l'ADN viral est nécessaire pour robuste expressile. Ceci est illustré dans la figure 3, que EGFP-Us11 accumulation est affaiblie par l'ADN polymérase virale acide inhibiteur de phosphonoacétique (AAP) dans les cultures induites de réactiver avec le LY294002 inhibiteur de la PI3-kinase.

Figure 1
Figure 1. Schéma illustrant un protocole typique expérimental utilisant le neurone en culture in vitro pour étudier le système HSV-1 de latence et la réactivation. 1) Après dissection des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) à partir de E21 chez le rat, des neurones dissociés sont étalées dans 96 plats ainsi et traités avec des anti-mitotique des agents pour éliminer les cellules non neuronales. 2) Après 6 jours in vitro (DIV), les cultures sont infectées par le HSV-1 recombinant qui contient EGFP fusionné à la codée par le virus Us11 gène tardif (EGFP-HSV-1) en présence d'acyclovir (ACV), un médicament antiviral qui blocs de réplication lytique. 3) par jour 14 (DIV 14), l'acyclovir est éliminé et EGFP-expressionn'est pas détecté. Les cultures peuvent être maintenues de façon stable de cette manière pendant un mois ou plus, ou une variable de test peuvent être ajoutées afin d'évaluer sa capacité à provoquer la réactivation de la latence. La variable peut être sous la forme d'un inhibiteur chimique petite molécule, un anticorps dirigé contre une neurotrophine soluble ou protéine de surface cellulaire, ou un lentivirus exprimant une shRNA spécifique du gène ou une protéine exprimée ectopiquement. Réactivation est ensuite contrôlée en marquant EGFP-positifs puits en temps réel.

Figure 2
Figure 2. TSA réactive HSV-1 dans les cultures CTB. Cultures CTB ont été infectées de façon latente, comme décrit dans la figure 1. A DIV 14, ACV a été supprimé et remplacé par les médias contenant 1 uM trichostatine A. (TSA) (A) Les cultures ont été visualisées et classé par microscopie à fluorescence chaque jour après un traitement médicamenteux pour une période de 5 jours. Le pourcentage de puits en cours de reactivations au cours de l'expérience est présenté par rapport à un contrôle DMSO-cultures traitées. Pourcentage de la réactivation a été calculé par le nombre de EGFP-positif puits de 20 puits d'une plaque de 96 puits de culture. Les barres d'erreur indiquent l'erreur type de la moyenne. (B) les cultures infectées de façon latente ont été traités avec la TSA et un inhibiteur de l'ADN viral d'encapsidation, WAY-150138 (20 pg / ml). Le nombre de neurones EGFP + a été comparé 48 heures après le traitement avec les médicaments à la commande traitée avec du DMSO et-WAY 150138. Chaque point de données représente le rapport de EGFP + de neurones basées sur 1000 neurones dans une culture de puits. Bar montre le pourcentage moyen de la EGFP + de neurones dans un puits.

Figure 3
Figure 3. Detecion EGFP est dépendante de réplication de l'ADN viral. Cultures CTB ont été infectées de façon latente, puis traités avec 10 uM de LY29004, un inducteur connu de réactivation 1. Réactivation induite par LY (bleu) was par rapport à ceux traités avec un inhibiteur de la synthèse d'ADN viral, l'acide phophonoacetic, AAP (300μg/ml, rouge) et les deux composés ensemble (vert).

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Discussion

Cette culture de neurones primaires et du système d'infection fournit une méthode simple et efficace pour explorer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le HSV-1 de latence et la réactivation. Le système fidèlement récapitule les poinçons acceptées de latence définies dans les deux infections humaines et d'animaux vivants des modèles. Lorsque le virus est latent dans les cultures CTB, des particules virales infectieuses et des produits géniques lytiques ne peut pas être détecté. Le produit du gène viral détecté seulement dans les neurones latente-infectés est la transcription non-codant LAT, qui s'accumule dans les noyaux. Réactivation coïncide avec l'expression de gènes viraux lytiques et culmine dans la production de particules infectieuses. En outre, ce modèle de neurone primaire de culture cellulaire est sensible à des inducteurs de réactivation reconnues, telles que la TSA, ce qui induit efficacement la réplication virale lytique.

Inducteurs chimiques différentes de stimuler la réactivation à des degrés divers et avec une cinétique caractéristiques. Par exemple, la TSA induit la réactivation de manière reproductible dans 60-70% des cultures sur une période d'observation 5 d. Des niveaux similaires de TSA induit la réactivation ont été signalés à l'aide latente infectée, phéochromocytome de rat PC12 différenciées 17 ou murins cultures de neurones du trijumeau 18. La cinétique de réactivation nous observons et l'incapacité de TSA à réactiver à 100% des cultures pourrait refléter l'hétérogénéité de la capacité des génomes latents à déréprimée. Conformément à cette proposition, l'efficacité de la TSA induit une réactivation diminue aurait comme une fonction du temps dans la culture 18. En revanche à la TSA, LY29004 induit une réactivation dans 80-90% des cultures au sein de 2-3 jours. Les différences dans l'établissement de la latence ou MOI ne sont pas susceptibles de tenir compte des différences dans la réactivation inductible entre TSA et LY29004, que nos conditions pour l'établissement de latence reproductible entraîner dans environ 20% des neurones qui expriment le cul de latence codée par le virustranscription ociated LAT 1. Cependant, nous n'avons pas encore mesuré la fraction de génome viral des cellules positives, ce qui soulève la possibilité que LY29004 induit une réactivation dans un plus grand nombre de neurones que la TSA. Bien que les raisons qui sous-tendent la capacité différentielle des TSA et LY20004 à une réactivation restent à déterminer, il est clair agents inducteurs différents peuvent favoriser la réactivation avec des rendements caractéristiques et de la cinétique.

Un des points forts du système est la possibilité d'utiliser de type sauvage des souches de virus ou de journaliste qui se comportent indistinctement à partir d'un virus de type sauvage. Contrairement aux précédents systèmes de culture cellulaire pour étudier le HSV-1 de latence, qui s'appuyait sur ​​des variantes HSV mutantes qui étaient incapables de se répliquer de manière productive 16,18,19, revu en 20, notre système modèle intègre une souche EGFP-reporter qui est indiscernable de type sauvage virus en termes d'efficacité de réplication lytique dans des cellules cultivées 11. L'utilisation d'une v EGFP rapporteurirus permet une évaluation sensible et simple visuel de la latence et la réactivation. Contrairement à d'autres journalistes tels que β-galactosidase, qui nécessite la fixation et la lyse des cellules pour l'analyse, EGFP permet au chercheur de contrôler l'état virale durant tout le cours d'une expérience, fournissant un moyen facile, en temps réel d'évaluation de spontané ou provoqué réactivation. D'autres méthodes, comme la PCR quantitative, peut également être utilisé pour regarder l'expression des gènes viraux qui précèdent EGFP-expression, puisque EGFP est exprimé comme un «vrai-fin" du gène, ou pour les souches de virus qui n'ont pas un gène rapporteur. Alternativement, les virus reporter d'autres où EGFP est fusionnée à immédiats-précoces (IE) ou au début (E) des gènes pourrait être développé. L'avantage d'utiliser le «vrai-fin" EGFP-journaliste décrit est que EGFP-expression est strictement dépendant de synthèse d'ADN viral, ce qui indique que le cycle de vie du virus a procédé dans la phase finale de l'expression des gènes associés à la croissance lytique. IndEED, "vrai-fin" expression de l'EGFP à des niveaux détectables par une inspection visuelle est bien corrélée avec la production de virus infectieux, un indicateur biologique que la réactivation productive s'est produite. Cependant, il reste à voir si chaque neurone qui commence la réactivation, telle que mesurée par cycle de production (lytique) l'expression des gènes, est capable de progresser à travers le programme complet lytique de produire un virus infectieux. Peut-être les virus ont amplement l'occasion d'interrompre le programme lytique et de rétablir la latence. Ainsi, les virus journaliste exprimant l'EGFP fusionné à IE ou des protéines E peut entraîner dans l'affichage des réactivation moins fiables. Dans cette perspective, en comparant l'efficacité de la réactivation mesurée à l'aide EGFP-reporters exprimées à partir d'IE, E, ou des promoteurs tardifs, ou même un journaliste combiné avec différentes protéines rapporteurs fluorescents fusionné à un produit du gène de chaque classe cinétique (IE vs vs E ) à la fin serait utile. En outre, notre système de culture cellulaire neuronale peut également être utilisé avec différents HSV-1 erpluies, indépendamment de leur potentiel neuro-invasive ou la capacité de réguler la réponse immunitaire de l'hôte 21-24. Enfin, le système de culture in vitro décrit ici peut être appliquée à d'autres types de cellules neuronales et ex vivo des cultures ganglions périphériques obtenus à partir d'ordre supérieur espèces, y compris les humains 25-27.

En utilisant une population pure de neurones, des études détaillées des interactions entre HSV1 et son hôte neuronale au niveau moléculaire sont maintenant possibles. De manière significative, ce système évite ainsi de nombreuses questions complexes associées à la latence et la réactivation de l'étude des animaux immunocompétents, où les niveaux supplémentaires de contrôle sont superposées au-dessus de fondamentaux virus neurones interactions. En outre, le travail dans ce système démontre clairement qu'il ya effectivement une relation stable entre le virus et le neurone d'accueil qui peut être établie et maintenue sans l'aide d'une réponse immunitaire acquise. Alors que innée et ADAPTIVl'immunité e clairement jouer un rôle important dans la biologie des infections à HSV latentes, le virus a la capacité intrinsèque i) d'établir une infection non productive qui ressemble à la latence dans les neurones, et ii) de passer à un lytique, le programme de réplication productive en réponse à l'environnement et les indices neuronaux appliqués aux neurones seuls. Surtout, la base moléculaire de cette relation unique entre le HSV et le neurone peut maintenant être disséquée par cellule biologique, pharmacologique silence du gène, et les outils de transfert de gènes 1. Les études de ce genre qui sont axés sur le neurone et le virus de l'isolement ne sont pas possibles dans des modèles animaux où plusieurs types de cellules ganglionnaires occupent le compartiment. Nous espérons que l'aide de ce système modèle, une compréhension globale du circuit complexe moléculaire de régulation HSV-1 de latence dans les neurones peut enfin être réalisé. Chaque fois que possible, des principes glanés à partir de ce système de neurones en culture peuvent ensuite être testées in vivo en utilisant des animaux établie models, illustrant le caractère complémentaire de ces deux approches à l'étude globale de HSV-1 de latence.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les réviseurs pour leurs suggestions qui ont contribué à améliorer ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions à MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) et IM (AI073898, GM056927) du NIH. MK a été soutenu en partie par une subvention du NIH de formation (5T32 AI007180).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

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References

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Immunologie Numéro 62 la culture cellulaire des neurones le virus Herpes simplex (HSV) la biologie moléculaire virologie
Un système de neurones primaires de la culture pour l'étude de l'herpès simplex virus de latence et de réactivation
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Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

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