Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.

Abstract

Herpes simpleks tip 1 (HSV-1) periferik nöronlarda bir ömür boyu gizli bir enfeksiyon oluşturur simpleks virüsü. Bu gizli rezervuar iletimi sağlamak ve klinik hastalığı katkıda tekrarlayan reaktivasyon olayların kaynağıdır. Şu antiviral gizli rezervuar etkisi yoktur ve hiçbir aşılar vardır. Litik replikasyon moleküler ayrıntıları iyi karakterize iken, nöronlarda gecikme kontrol mekanizmaları zor kalır. Gecikme Bizim bugünkü anlayış viral gen gereksinimleri ve immün yanıtın rolü tanımlamak için vazgeçilmez olan küçük hayvan modelleri kullanılarak in vivo çalışmalar türetilmiştir. Bununla birlikte, canlı hayvanlarda bağışıklık veya non-nöronal destek hücreleri tarafından aracılık enfeksiyon daha genel sonuçlarından virüsü-nöron ilişkiyi spesifik etkileri ayırt etmek imkansızdır. Buna ek olarak, hayvan deney ev sahibi manipüle edilmesi için, masraflı zaman alıcı ve seçenekler açısından sınırlıdırsüreçleri. Bu sınırlamaları aşmak için, bir nöron sadece sistem umutsuzca gecikme ve reaktivasyonu in vivo özellikleri üretir ama homojenlik ve erişilebilirlik açısından doku kültürü faydalar sunduğunu gereklidir.

Burada uyan HSV-1 gecikme ve reaktivasyonu okumaya sıçan üstün servikal gangliya (SCG) (Şekil 1) kültürlerinde birincil sempatik nöronlar kullanan bir in vitro model sunmak en değil, istenen tüm kriterleri eğer. Non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırarak sonra, yakın homojen TrkA + nöron kültürleri litik çoğaltma bastırmak için asiklovir varlığı (ACV) HSV-1 ile enfekte olmaktadır. Aşağıdaki ZMA kaldırılması, sadakatle gecikme kabul işaretlerinden verimli kurulan sergilemek üretken olmayan HSV-1 enfeksiyonları. Özellikle, litik mRNA, protein ve bulaşıcı virüsün bile seçimi yokluğunda, farkedilmezler.Örneklerini, ancak gecikme ile ilişkili transkript (LAT) ekspresiyon nöronal çekirdeklerinde devam. Viral genomu nöron başına ortalama 25 kopya sayısında korunur ve verimli PI3-Kinaz / Akt sinyal veya sinir büyüme faktörü 1 basit çekilmesi ile müdahale ederek çoğaltmak için bağlı olabilir. Viral proteini litik Us11 füzyonlu bir rekombinant HSV-1 kodlama EGFP kolaylıkla ölçülür kaynaklanan replikasyon aktive için işlevsel, gerçek zamanlı işaretleyici sağlar. Kimyasal işlemler ek olarak, bu tür lentiviral vektörler aracılığıyla RNA-etkileşim veya gen aktarımının gibi genetik metodolojiler başarılı bir şekilde çok zordur, imkansız olmasa, hayvanlarda olan mekanik çalışmalar izin sistemine uygulanabilir. Özetle, SCG tabanlı HSV-1 gecikme / reaktivasyon sistemi nöronlarda HSV1 gecikme ve reaktivasyonu olan çözüm bu yeni tedavilerin geliştirilmesi taze bakış açısı sunabilir viroloji köklü bir bulmaca kontrol eden moleküler mekanizmalar çözülmeye güçlü, gerekli bir araç sağlar hedef tdiye herpesvirus rezervuar gizli.

Protocol

1. Sıçan Embriyolar gelen SCG Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Bu protokol anlamak için yararlı bir bağlam sağlamak ve daha önce kapsamlı bir literatür tartışması için bu in vitro kültür, plaka kaplama yüzeyler ve serumsuz medya bileşenleri SCG temelini dahil SCG nöron kültürü kurulan yöntemleri, okuyucunun referanslar 2-4 anılır.

  1. SCG nöronlar için bir kaynak olarak sıçanların kullanımı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış etkin bir protokol çerçevesinde NIH esaslara uygun olarak yürütülmüştür.
  2. Diseksiyon başlamadan önce, kollajen ve laminin kaplı 96 doku kültürü yemekleri hazırlamak. Bir çok-kanallı pipetleme cihazı kullanılarak, 0.66 mg / ml fare kuyruk kolajeni içeren bir çözelti ile bütün 96 kuyucuklu doldurun. Hemen kurtarıldı ve 8 diseksiyonlara için kullanılabilir kollajen, kaldırın. T çıkardıktan sonradiye kollajen, bir laminer akış başlık altında kuyu kuruması için çok önemlidir. Kurutmak için gereken zaman miktarı çanak kuyu sayısı bağlıdır. Örneğin, tipik olarak yaklaşık 5-10 dakika alır. kuruması için 96 tabak içinde kuyu, ancak 30 kadar sürebilir - 40 dk daha büyük bir biçimi 24 sıra çanak kullanılırsa. Düzgün yoksul SCG ekinde kuyuları sonuçları kurumaya başarısızlık. Daha sonra 2 mg / ml laminin bir çözüm kullanarak işlemi tekrarlayın. Eğer plaka sizin nöronlar (adım 1.14) hazır olana kadar 37 ° nemlendirilmiş bir CO2 inkübatör C en az 2 saat ve laminin çözümü inkübe edin.
  3. Ticari olarak elde hamile dişi sıçanlarda CO 2 kullanılarak ötenazi edilir. % 70 etanol ile kadavranın püskürtme sonra, U-şeklinde bir kesi karın etrafında yapılır. Cilt geri soyma sonra, ikinci bir U-şekilli bir kesi karın kas duvarı aracılığıyla yapılır. Rahim karın kas tabakası yukarı kaldırarak üzerine görünür. 15 yılında rahim ve yeri kaldırcm çanak. Dikkatle içinde yavrular zarar vermemek için künt makas kullanılarak rahim açın. Her yavru kendi embriyonik kese serbest bırakılmalıdır, göbek kordonu kopmuş ve yavru% 70 etanol ve Kimwipes ile temizledi.
  4. Bir diseksiyon kaput çalışan, gövde gelen kafa kesme tarafından doğmamış E21 sıçan yavrularına kurban. Sadece omuzlar üstünde, boyun dibinde makas yöneltin. Ganglia göstermek için, üç yerde 23 G iğne kullanarak başını (yukarı boyun tarafı) aşağı pin: ii) anterior cilt burun üzerinde yukarı çekti ve tutturulmuş; i) spinal kord ve iii) yemek borusu / trakea uzak tutturulmuş olmalıdır Boynun tabanından.
  5. Karotis arter bifurkasyon (embriyo başına iki SCGs) her iki tarafında konumlandırılmış iki SCG * arayın. SCG sadece dalı altında yer almaktadır. Dışında çatallanma çekerek arterlerden SCG ayırın. L15-ortam buz üzerinde 15 ml konik tüpe (% 0.4 D (+)-glikoz ile desteklenmiş) 12 ml içine gangliya yerleştirin.

* SCG çatallanma çevreleyen opak, sarımsı yağ dokusu göre saydam ve renksiz. Ganglia toplamaya önce, kalan yağ dokusu ve kan damarlarının kadar çıkarmaya çalışın.

  1. Tüm SCGs embriyoların hasat kadar 1.4 ve 1.5 tekrarlayın.
  2. Yavaşça 600 rpm'de 1 dakika santrifüj ganglionlar ve aşırı medya aspire.
  3. L15-ortam ihtiva tripsin (0.25%, EDTA olmadan) ve kolajenaz (1 mg / ml): 1 ml içinde yeniden süspanse gangliya. 37, 30 dakika boyunca inkübe ° C, 10 dak, her ajitasyon.
  4. 600 rpm'de 1 dakika boyunca santrifüj tripsin ile inaktive etmek için C-ortam (1x MEM,% 0.4 D (+)-glikoz, 2 mM L-glutamin,% 10 FBS) 10 ml ilave edilir.
  5. Mümkün * olarak tripsin / kollajenaz medya çıkarın ve C-medya 10ml ile ganglion yıkayın. 600 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin. Bir kez bu adımı yineleyin.

* Artık kollajenaz etkileşimler olacakkültür plaka üzerinde hücre eki için gerekli kollajen tabaka ile yeniden.

  1. Yıkama ortamı çıkarın ve C-media 1 ml yeniden askıya ganglionlar ve hücrelerin * büyük kümeleri ayırmak için bir 5 ml şırınga bağlı 21 G iğne kullanılarak öğütmek. Görünür kümeleri disosiye kadar 23 G iğne ile triturating bitirin.

* Bu hücreler zarar verir gibi değil, aşırı öğütmek için dikkatli olun. Tripsin ve kollajenaz tedavi başarılı olursa, bir onbeş maksimum yukarı ve aşağı 21 G iğne ile döngüleri ve 23 G iğne ile üç kür yeterli olacaktır.

  1. 70 mikron naylon filtre [BD Biosciences hücre süzgecinden] aracılığıyla disosiye nöronlar filtreleme kalan topaklar atılması için 50 ml konik tüp içine.
  2. Filtre hücre süspansiyonu ve canlı hücrelerin sayısını belirlemek için tripan mavi karışımı bir 10 ul tablet çekin. Aktif hariç hücre sayısını hesaplamaBir hemasitometre kullanarak Ude boya.
  3. 37 ° C inkübatör (STEP 1.2) bekleyen 96 yemeklerinden laminin çözüm çıkarın. Laminin çıkarıldıktan sonra çanak kuru etmeyin, kaplama hücreler için hemen kullanılabilir. Kollajen ve laminin önceden kaplanmış 96 doku kültürü kabına - * 5,000-6,000 toplam canlı hücreler (kuyu başına 100 ul 50) dağıtın. C-ortamı içinde 50 ng / ml sinir büyüme faktörü (NGF) içerir.

Antibiyotik büyüme ortamı çıkarılmıştır çünkü * Çok iyi steril doku kültürü tekniği istihdam açısından çok önemlidir. Ayrıca, farklı tedarikçilerden kaynaklı kollajen arasında önemli farklılıklar olabilir. Biz Millipore, sıçan kuyruğu kollajen kullanarak toplu tutarlı sonuçları olmuştur.

  1. Glukoz, 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml NGF içeren B-27 takviyesi, - DIV (in vitro gün) 1 olarak, 50 ul NBM (% 0.4 D (+) ile plakası hücreleri için kullanılan C-ortam yerini 5uM aphidicolin ve 20 uM 5-fluorourasil [5-floro-2'-deoksipsödoüridin]. 5 gün süre ile inkübe kültürler *. Bu noktada, tripsinize ve birkaç kuyu kalan hücre sayımı anti-mitotik ajanı tedavisi kalan nöronların numarasını belirleyebilir. Tipik olarak, yaklaşık 1.000 nöronlar 96 plaka iyi başına kalır.

Mantar veya bakteri kontaminasyonu ile * Sorunları kültürünün ilk 24 saat içinde genellikle belirgindir. Önce kaplama medya değiştirmektir mikrobiyal büyüme için dikkatle de her inceleyin. Kuyuları, sadece sınırlı sayıda etkilenir, bunlar PBS ile yıkanır ve deneyi ile devam etmek üzere kurutulur seyreltilmiş ağartma çözeltisi ile muamele edilebilir. Biz kuyuların bile sınırlı sayıda mikrobiyal kirlenme vardı herhangi bir deney tekrar öneririz. Kapsamlı mikrobiyal kontaminasyonu 96 çanak gözlenmesi durumunda, deney sonlandırılmalıdır.

2. Kült SCG EnfeksiyonGecikme HSV-1 Us11-EGFP ve Kuruluş ile ures

Temel virüs yayılımı, belirleyici virüs titresi, ve enfeksiyon (İB) çokluğu dahil virolojik teknikler hakkında yararlı arka plan için, okuyucu 5 başvurmak anılır. Herpesvirus biyoloji ile ilgili bir tartışma için, okuyucu 6 başvurmak anılır. Son olarak, okuyucunun SCG nöronların alfa-herpesvirus litik enfeksiyonu ile ilgili olarak önceden örnekleri, diğer protokolleri ve ek bir arka plan ve gecikme ve aktive incelemek için bizim protokolü uyarlamaları ile karşılaştırma için 7-10 referansları da adlandırılır.

  1. DIV 6, her iyi * mevcut medya asiklovir (ZMA), son konsantrasyonu 100 uM ekleyin. Her bir kuyunun 50 ul içeriyorsa Örneğin, 300 uM ZMA stoku 25 ul ekleyin. Tipik olarak, ACV enfeksiyondan önce gece ilave edilir, fakat, aynı zamanda enfeksiyonundan önce, 6-8 saat eklenebilir.

* Bu exher zaman nöron gereksiz fiziksel manipülasyonu en aza indirmek için ceedingly önemlidir. Basitçe çıkarmadan ve medya değiştirilmesi veya virüs stokları ile enfekte çok nazik ve yavaş yapılmalıdır. Aksi takdirde, ortaya çıkan mekanik stres olumsuz nöron canlılığı üzerine etkileyebilir.

  1. DIV 7, 1 -2 arasında bir enfeksiyon çokluğu (İB) (optimal MOI belirlenmesinde aşağıda önemli yorumu bakın) HSV-1 Us11-EGFP (ref 11 tarif) ile SCG kültürlerin enfekte *. Doğrudan yanı içerisinde mevcut medya seyreltilmiş virüsü ekleyin. Bir mock-enfekte kontrolü ve ZMA yoksun ortamda bir litik enfeksiyon pozitif kontrol içerir. Enfeksiyonuna 37 az 2-3 saat boyunca ilerlemesine izin ° C.

* İçişleri Bakanlığı Vero hücreleri 12 ve adım 1.14 iyi başına ekilmiş kaplı, canlı hücrelerin sayısında bir plak testi yapılarak belirlenir virüs titresi kullanılarak hesaplanır. Bu hesaplamada, sadece bir işlevsel açıdan yararlıtoplam hücre sayısı gibi tohumlu kirlenmesine glia ve fibroblastlar ile birlikte nöronlar içerir. Bu tehlike bölünen hücreleri anti-mitotik ajanlar ile muamele ile öldürülür olarak, kalan nöronlar için MOI etkili aslında büyüktür. 5000 ilk başlangıç ​​miktarı Nereden - 6,000 canlı hücreler, yaklaşık 1.000 nöronlar anti-mitotik ajanlar (as tripsinize ve doğrudan hücre sayımı ile değerlendirilen) ile tedavi sonrası kalır. Nöronal kültürlerin bulaşmasını kullanmak üzere İçişleri Bakanlığı optimum bir virüs hamur hazırlama diğerine biraz değişebilir. Virüs her yeni hazırlanması ile, farklı MOI Kullanıcı 1 2 sınırlı sayıda test etmenizi öneririz. Burada amaç nöron canlılığı ve indüklenebilir reaktivasyonu olaylar (3. bölümünde tanımlandığı gibi) en fazla sayıda sonuç üzerine en az etkisi olan bir belirlemektir. Us11-EGFP virüs hızla koşullarının optimize özellikle yararlıdır ama aynı zamanda plak testi veya quanti gibi diğer readouts kullanabilirsiniztative PCR. Bu gerekli ve rutin olarak olmasa da, hücre canlılığı azaltmak kirleri ortadan kaldırmak için bir sükroz yastık ile saflaştırılmış virüs kullanmak yardımcı olabilir.

  1. 50 ng / ml NGF ve 100 uM ZMA * içeren taze NBM ile enfeksiyon medyanın dikkatli bir biçimde yerleştirin.

* Bu enfeksiyon ortam değiştirirken ÇOK nazik olmak çok önemlidir. Kuyunun duvarında yerine kuyunun dibinde pipet ucu Amacı ve medya hafifçe hücreleri üzerine aşağı kaydırın sağlar. Pipet medya bile hızlı ejeksiyon substrattan aksonları ayırmak ve hücreler bir yaprak gibi normalde hücrelerin ve kir neden olmak için yeterli gücü oluşturabilir. Nöronlar detach (% 20-30) ve yalnızca sınırlı sayıda olursa, sonuçları hücrelerin sağlıklı görünen kaydıyla en az düzeydedir. Müstakil nöronların zamanla iliştirmeniz muhtemeldir, ancak aksonlardan güzel bir şekilde, artık, bir uzatılırd yeni aksonlar regrow olacaktır. Iyi olmasa da kuyuların sadece sınırlı sayıda etkilenir da, deney devam edebilirsiniz. Nöronların geniş dekolmanı (% 70-80) varsa, biz deneyde etkilenen iyi (ler) de dahil olmak üzere önermiyoruz. Kuyuların çoğunda% 70-80 müstakil nöronlar içeriyorsa, deney sonlandırma öneririz. Nöronlar hala yatıştırıldı karşın, genellikle büyük öbekler şeklinde olacaktır. Bu bireysel yeniden nöronların düzgün bir değerlendirmesini zorlaştırmaktadır. Biz müstakil nöronlar ile kuyu reaktivasyon oranlarının kuyulara nöronların diferansiyel bağlılık etkisi olmadığını sağlamak için gözlenmiştir herhangi bir deney tekrar öneririz.

Buna ek olarak, her zaman yavaşça gibi muhtemel olarak kültürler işlemek için kritiktir. Gereksiz, ani hareketlerden (tekrar açılması dahil olmak üzere ve bir kuluçka odasının kapısının kapatılması) veya güçlü medya uygulama c Mekanik stresould uzlaşma muhtemelen belirli bir deneyde spontan reaktivasyonu kabul edilemeyecek kadar yüksek oranları ile sonuçlanan, HSV-1 gecikme desteklemek için kültürler yeteneği.

  1. Virüs gecikme kuracak ve bu süre içinde 6 gün boyunca kültürleri koruyun. Bu dönemde, litik replikasyon göstergesi olarak nöron sağlık ve Us11-EGFP ifade izlemek için bir floresan mikroskop kullanın. Us11-EGFP başarılı primer enfeksiyon ve üretken litik replikasyon gösteren, SADECE ZMA tedavi eksik kontrol kuyuları tespit edilmelidir. Nöronlar daha verimli bir viral büyüme yokluğunda sitopatik etkiler gösterebilir. Enfekte kültürleri yakından izlenmeli ve mock-enfekte nöronlara göre olmalıdır.

3. Yeniden ve Değerlendirme

  1. DIV 14 yaşında dikkatle ZMA yoksun taze medya ile ACV içeren medya değiştirin. Eğer uygunsa, bu zamanda farmakolojik (veya biyolojik) değişkenleri içerir. Be s2.3 'de belirtilen önlemlerin takip ure.
  2. Bir 5 ila 6 günlük süre içinde, reaktivasyon geçiren nöronlar algılamak için bir floresan mikroskop kullanılarak canlı kültürler izlemek. Alternatif analizler diğer türleri (protein, nükleik asit, plak testi vb) için örnekler toplamak.
  3. EGFP-pozitif nöron içeren kuyu sayısı sayarak reaktivasyonu frekansı hesaplamak ve örnek kuyu sayısı bir oranı olarak bu ifade. Bir kişide EGFP ifadesi de bir ilköğretim reaktivasyon olay ve viral yayılması nedeniyle sonraki enfeksiyonu ayırt etmez unutmayın. Bulaşıcı yayılma de, tek bir kültür bulunmadığı için, çok iyi bir veya daha fazla EGFP-pozitif nöronlar işlevsel olarak bu koşullar altında aktive bir olay olarak tanımlanır.

1 'de tarif edildiği gibi * Çoklu aktive olayları, bir kültür oluşabilir. Reaksiyon kaynaklanan viral yayılma bir birincil reaktivasyon olayı ayırt etmek için tivation, encapsidation inhibitörü WAY-150138 eklenebilir. Encapsidation engelleyerek, bulaşıcı virüsün ürettiği ile aktive kaynaklanan geçmez mümkün değildir. Böylece, WAY-150.138 varlığı tespit EGFP sinyali iyi 1,13-15 bir singe kültürü içinde bağımsız reaktivasyon olayların sayısını yansıtır. WAY-150138, ticari olarak mevcuttur, sadece HSV-1 Patton suşu karşı etkili ve olmadığına dikkat edin. WAY-150138 bir alternatif olarak, aşağıdakilerden herhangi biri kullanılarak göz önüne: i) komşu hücreler yayılmış kabiliyetini bozulmuş bir mutant virüs kullanılabilir; EGFP sürekli varlığında bir IE promotörü ile ifade edilir ii) bir haberci virüsü Bir IE gen ürünü yöneltilmiş immünofloresan kullanarak antikorlar tarafından takip geç gen ekspresyonu (ve bulaşıcı bir virüs üretimi) önlemek için PAA veya ZMA ile iii) tedavi; ZMA'nın.

4. Test kullanarak Yeniden Değerlendirmek için Alternatif Yöntem

Bir birey, tek bir deneyden ontent "> Sonuçlar SCG tek bir preparat elde edilmelidir. her kopyalayan bir tek SCG kesikli kullanılarak gerçekleştirilmiştir olarak Replicate deneyler sürece, bağımsız SCG preparatları ile gerçekleştirilebilir.

  1. HSV-1 litik transkript değerlendirilmesi. Reaktivasyon farklı deneysel indükleyicileri varlığı ya da yokluğu ZMA çıkarıldıktan sonra istenilen zamanlarda RNA toplayın. 96 kültür plakları kullanırken, (RNA numune başına kabaca 10 5 hücreleri) her bir örnek için birlikte en az 20 kuyu havuzu öneririz. Alternatif olarak, SCGs (24 sıra plaka için, / hem 4-5 x10 4 hücrelerin kullanımı gibi) daha büyük kuyu kaplama yapılabilir. Bu az 20 kuyu, küçük hacimlerde yersiz örnek-to-örnek değişkenliği dahil sonucu RNA tespit etmek kesinlikle mümkün olsa da.
  2. HSV-1 litik proteinlerin tespiti. Reaktivasyon indüksiyonundan sonra istediğiniz saatte lizatları toplayın. 10 w her birine lizis tamponu, 7.5 ul eklemebir 96 plaka arşın ve SDS-PAGE ve immunoblotting tarafından analiz. Alternatif olarak, viral protein indirekt immunfloresan mikroskop ile tespit edilebilir. İlk kaplama (1,10 bakınız) gibi Kolajen ve laminin uygulanmasından önce poli-D-lizin (0.2 mg / ml, Sigma) ile önceden kaplanmış oldu steril bir cam coverslip gibi görüntüleme için bir yüzey üzerine monte yapılmalıdır .
  3. Bulaşıcı maddelerin tespiti. Reaktivasyon üzerine kültür süpernatant toplayın. Üstte kalan sıvı kısmın seri seyreltiler kullanılarak Vero hücrelerinin tek katmanlarını bir plak assay gerçekleştirmek. Buna ek olarak, plak deneyleri titresi belirlemek için hücre içerecek şekilde ilgili parçacıkların dondurularak-çözülmüş kültürlerin lizatları kullanılarak gerçekleştirilebilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2A 1 uM trichostatin A (TSA), aktive 16-18 arasında bilinen bir indükleyici, yaban-tip H ile enfekte latent kültürler SCG uygulanan bir örnek gösterilmiştirSV1 EGFP-Us11 muhabiri süzün. TSA ile reaktivasyon 2 gün içerisinde maksimum% 50 ulaşır ve 5 gün kuyuların yaklaşık% 60 az reaktivasyonu platolarla. Baz hattı ('spontan') reaktivasyonu bu deneyde yaklaşık% 10 ve genellikle in vitro sistemde bu kullanarak% 10-20 arasında değişir. Maksimum reaktivasyon seviyeleri reaktivasyonu indükleyici kullanılmaktadır bağlı olarak değişir. Birçok reaktivasyon indükleyicileri üretken viral replikasyon karışmaz gibi deney süresince uygulanan, ancak bu ampirik olarak tespit edilmesi gerekiyor olabilir. Nöronların canlılığını etkiler veya viral üretken yaşam döngüsünün tamamlanması engelleyen herhangi bir reaktif dahil diğer indükleyiciler, geçici bir darbe uygulamasını etkinleştirme provoke etmek isteyebilir.

Şekil 2A tasvir deney her iyi EGFP-Us11 birikimi gecikme gelen reaktivasyon göstergesi iken, ayrım yapmaz mıBireysel nöronlarda Us11-EGFP sinyali, bağımsız bir aktive olay veya kültürü ile bir aktive virüs spread türetilmiştir. Her bir yanı içerisinde bağımsız aktive olaylar geçiren nöronların numarası değerlendirmek için, kültürler WAY-150138, özellikle viral genom DNA 13-15 arasında encapsidation önleyerek engeller viral yayılma bir bileşik ile ön-muamele edilmiştir. Enfekte sempatik nöron kültürleri WAY-150.138 ve TSA ile uyarılan reaktivasyonu ile tedavi edildi. EGFP-pozitif nöron önemli sayıda tek bağımsız reaktivasyon olayların bir numara (Şekil 2B) bireysel kültür başına meydana gösteren, DMSO ile tedavi edilen kontrol kültürleri ile karşılaştırıldığında, TSA-tedavi kuyu tespit edildi.

Bizim deneyde, Us11-EGFP raportör endojen Us11 promotör 11 den ifade edilir. Us11 olduğu bir "gerçek-geç" ya da γ 2 viral litik gen, viral DNA replikasyonu sağlam expressi için gereklidirüzerinde. EGFP-Us11 birikimi PI3-kinaz inhibitör LY294002 ile yeniden üzere uyarılan kültürlerde viral DNA polimeraz inhibitörü phosphonoacetic asit (PAA) tarafından etkilenmektedir olarak, Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1.. HSV-1 ve gecikmeli aktive incelemek için in vitro sisteminde kültüre nöron kullanılarak tipik bir deneysel protokol gösteren şematik. 1) E21 sıçanların üstün servikal gangliya (SCG) kesme sonra, ayrışmış nöronlar 96 tabaklarında kaplanmış olan ve anti-mitotik ile muamele ajanlar nöronal olmayan hücreleri çıkarmak için. 2), in vitro (DIV) içinde 6 gün sonra kültür varlığında asiklovir (ACV), bir antiviral madde in virus-kodlanmış Us11 geç geni (EGFP-HSV-1) ile kaynaşmış EGFP içeren rekombinant HSV-1 ile enfekte olduğu bloklar litik çoğaltma. 3) 14 günlük olarak (DIV 14), asiklovir kaldırılır ve EGFP-ifadesialgılanmaz. Kültürler stably 1 ay veya daha fazla bu şekilde muhafaza edilebilir, veya bir test değişken gecikme ile aktive provoke kabiliyetini değerlendirmek için ilave edilebilir. Değişken ya bir genin spesifik shRNA veya bir ektopik ifade proteini ifade eden bir küçük molekül kimyasal inhibitörü, bir çözünür nörotrofin veya hücre yüzey proteinine karşı bir antikor ya da bir lentivirüs şeklinde olabilir. Yeniden sonra gerçek zamanlı olarak EGFP pozitif kuyuları puanlama tarafından izlenir.

Şekil 2
Şekil 2. TSA SCG kültürlerde HSV-1 reaksiyona. Şekil 1 'de tarif edildiği gibi SCG kültürler latent enfekte edilmiştir. DIV 14 yaşında ZMA medya 1 uM trichostatin içeren kaldırıldı ve yerine A (TSA). (A) kültürleri görüntülendi ve 5 gün süreyle ilaç tedavisinden sonra her gün floresan mikroskobu kullanılarak skorlandı. Tekrar aktif geçiren kuyuların yüzdeDeney boyunca iyon DMSO kontrolü ile tedavi edilen kültür göre gösterilmiştir. Reaktivasyon yüzdesi, bir 96 bölümlü kültür plakasının 20 kuyu dışarı EGFP-pozitif kuyu sayısına göre hesaplanmıştır. Hata çubukları ortalama standart hata belirtir. (B) latent enfekte kültürler TSA ve viral DNA encapsidation bir inhibitörü, WAY-150138 (20 ug / ml) ile muamele edildi. EGFP + nöronların sayısı DMSO ve WAY-150138 ile muamele kontrolü için ilaçlar ile tedaviden sonra 48 saat karşılaştırılmıştır. Her veri noktası iyi bir kültürde 1000 nöronların EGFP + nöronların dışarı oranını temsil eder. Çubuk, iyi EGFP ortalama yüzde + nöronlar gösterir.

Şekil 3
Şekil 3. EGFP detecion viral DNA replikasyonu bağlıdır. SCG kültürler latent sonra LY29004, aktive 1, bilinen bir indükleyici ile 10 uM ile muamele enfekte edilmiştir. LY (mavi) wa tarafından uyarılan Yenidens viral DNA sentezi inhibitörü, phophonoacetic asit, PAA (300μg/ml, kırmızı) ve iki birlikte bileşikler (yeşil) ile tedavi edilenlere göre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu primer nöron kültürü ve enfeksiyon sistemi HSV-1 gecikme ve reaktivasyonu altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar. Sistem sadakatle özetlediği insan enfeksiyonları hem de hem canlı hayvan modellerinde belirlenen gecikme kabul özellikleridir. Virüs SCG kültürlerinde gizli olduğunda, bulaşıcı parçacıklar ve viral litik gen ürünleri tespit edilemez. Latent enfekte nöron tespit sadece viral gen ürünü çekirdeklerin içinde birikir kodlamayan LAT transkript vardır. Reaktivasyon viral litik genlerin ifadesi ile çakışır ve bulaşıcı parçacıklar üretimi ile sonuçlanacak. Ayrıca, bu primer nöron hücre kültürü modeli gibi etkili litik viral replikasyon indükler TSA olarak kabul reaktivasyon indükleyicileri duyarlıdır.

Farklı kimyasal indükleyicileri değişen derecelerde reaktivasyonu teşvik ve karakteristik kinetiği ile. Örneğin, TSA tekrarlanabilir 5 günlük gözlem süresi boyunca kültürlerin% 60-70 oranında reaktivasyonu neden olur. TSA bağlı reaktivasyonu Benzer seviyeleri 18 PC12 17 veya fare trigeminal sinir kültürleri latent enfekte, farklılaşmış sıçan feokromositoma ile bildirilmiştir. Reaktivasyonu kinetiği gözlemlediğimiz ve kültürlerin% 100 yeniden TSA yetersizlik baskılanmayan koşullarına gereken gizli genomların kapasite heterojenite yansıtabilir. Bu teklife ile uyumlu olarak, TSA indüklenen aktive etkinliğini bildirildi kültürün 18 zamanın bir fonksiyonu olarak azalır. TSA aksine, LY29004 2-3 d içinde kültür% 80-90 tekrar aktive indüklemektedir. Gecikme kurulması veya İçişleri Bakanlığı farklılıklar gecikme kurulması için şartlar tekrarlanabilir virüs kodlanmış gecikme ass ifade nöronların yaklaşık% 20 neden olarak, TSA ve LY29004 arasındaki indüklenebilir reaktivasyonu farklılıkları hesaba olası değildirociated transkript LAT 1. Bununla birlikte, henüz LY29004 TSA daha nöronların daha fazla sayıda tekrar aktive uyardığını olasılığını artıran, viral genomun-pozitif hücre fraksiyonu ölçülen değildir. Reaktivasyon uyardığı TSA ve LY20004 ayırıcı kapasitesi altında yatan nedenleri tespit edilmeye devam ederken, farklı ajanlara karakteristik verimliliği ve kinetik ile reaktivasyonu teşvik edebilir açıktır.

Sistemin bir güçlü bir yönü, bir yabani tip virüsü ayırt edilemez bir şekilde davranması yabani tipteki virüs ya da reporter suşları kullanmak yeteneğidir. 20 gözden verimli 16,18,19, çoğaltmak koyamadık mutant HSV varyantları dayanıyordu HSV-1 gecikme, çalışmak için daha önce hücre kültürü sistemlerinin aksine, bizim model sistem wild-tip ayırt edilemez bir EGFP-muhabiri suşu içerir Kültür hücrelerinde 11 litik çoğaltma verimliliği açısından virüs. Bir EGFP reporter v kullanımıirus gecikme ve reaktivasyon hassas ve kolay görsel değerlendirilmesi için izin verir. Bu tür fiksasyon ve analiz için hücrelerin parçalanma gerektirir β-galaktosidaz, diğer gazetecilere aksine, EGFP bir kolay, gerçek zamanlı değerlendirmesi sağlayarak, araştırmacı bir denemenin tüm kurs boyunca viral devlet izlemenizi sağlar spontan ve uyarılmış reaktivasyonu. Diğer yöntemler, kantitatif PCR gibi, aynı zamanda EGFP bir "gerçek-geç" gen veya bir raportör gen eksikliği virüs suşları olarak ifade edilir, çünkü EGFP-ifadenin önündeki viral gen ekspresyonu bakmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, EGFP (IE) hemen-erken veya erken (E) genlerin birleşmesini diğer muhabiri virüsler geliştirilebilir. Tanımlanan "gerçek-geç" EGFP-reporter kullanılarak bir avantajı, bu EGFP-ifade virüsü yaşam çevrimi litik büyümesi ile bağlantılı nihai gen ifadesi fazına ilerlemiştir gösteren, viral DNA sentezi üzerinde sıkı bir şekilde bağlıdır olmasıdır. Indeed, görsel muayene ile tespit edilebilmesine seviyeleri "doğru-geç" EGFP ifade üretken reaktivasyon meydana geldiğini bulaşıcı bir virüs üretimi, biyolojik bir gösterge ile de ilişkilidir. Ancak, bu kadar üretken döngüsü (litik) gen ekspresyonu ile ölçülür reaktivasyonu başlar her bir nöron, bulaşıcı virüs üretmek için tam litik programın ilerleyen yeteneğine sahip olup olmadığını göreceğiz. Belki de virüs iptal etmek litik programı bol bol fırsat var ve gecikme yeniden. Böylece, IE veya E proteinleri için erimiş EGFP ifade muhabiri virüsler daha az güvenilir reaktivasyonu readouts neden olabilir. Bu açıdan bakıldığında, reaktivasyon etkinliğini karşılaştıran IE, D ya da geç rehberleri, hatta her kinetik sınıftan bir gen ürünü için erimiş farklı floresan muhabiri proteinler ile kombine bir muhabiri ifade EGFP-gazetecilere kullanılarak ölçüldü (IE D vs vs geç) yararlı olacaktır. Buna ek olarak, nöronal hücre kültürü sistemi ayrıca farklı HSV-1 st ile birlikte kullanılabiliryağmurları, ne olursa olsun neuroinvasive potansiyel ya da konağın immün yanıtı 21-24 düzenleyen yeteneği. Son olarak, burada açıklanan vitro kültürü sistemindeki insan da dahil olmak üzere 25-27 yüksek dereceden türler, elde edilen başka bir nöronal hücre tipleri ile ex vivo periferal gangliya kültürler uygulanabilir.

Nöronların saf bir nüfus kullanarak, moleküler düzeyde HSV1 ve nöronal konak arasındaki etkileşimleri konusunda detaylı çalışmalar yapmak mümkün. Önemli ölçüde, bu model sistem kontrol ek düzeyleri temel virüs nöron etkileşimleri üstüne katmanlı bağışıklık hayvanlar okuyan gecikme ve reaktivasyonu ile ilişkili birçok karmaşık sorunları önler. Ayrıca, bu sistemde çalışma açıkça virüs ve kurulan ve sonradan kazanılmış bir bağışıklık yanıtı yardımı olmadan korunabilir ana nöron arasında istikrarlı bir ilişki gerçekten var olduğunu göstermektedir. Iken doğal ve Adaptivçevre yanıt olarak litik, üretken çoğaltma programı geçmek için) ve ii, e dokunulmazlığı açıkça latent HSV enfeksiyonu biyoloji önemli rol oynayan, virüs içsel nöronlarda gecikme andıran üretken olmayan enfeksiyon kurma kapasitesi i) sahiptir ve nöronal ipuçları yalnız nöronlar uygulanır. Önemlisi, HSV ve nöron arasındaki bu eşsiz ilişkinin moleküler temeli artık hücre biyolojik, farmakolojik, gen suskunluğu ve gen aktarım araçları kullanarak 1 disseke edilebilir. Izolasyon nöron ve virüs odaklı bu tür çalışmalar çeşitli hücre tiplerini ganglial bölmesi işgal hayvan modellerinde mümkün değildir. Bu model sistemi kullanılarak, karmaşık moleküler devre kapsamlı bir anlayış sonunda elde edilebilir nöronlar HSV-1 gecikme düzenleyen umuyoruz. Mümkün olduğunda, bu kültür nöron sistemi toplanan ilkeler sonra kurulan hayvan mo kullanarak in vivo olarak test edilebilirHSV-1 gecikme genel çalışma için bu iki yaklaşım birbirini tamamlayıcı niteliği gösteren dels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu yazının geliştirmek için yardımcı onların düşünceli önerileriniz için teşekkür değerlendirenler. Bu çalışma NIH MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) ve IM (AI073898, GM056927) hibe ile desteklenmiştir. MK bir NIH eğitim bursu (5T32 AI007180) tarafından kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).

Tags

İmmünoloji Sayı 62 nöron hücre kültürü Herpes Simplex Virus (HSV) moleküler biyoloji viroloji
Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, … More

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter