Summary
एक रेटिना की कोशिकाओं और उनके cDNAs के बाद प्रवर्धन के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन है. एकल सेल transcriptomics एक ऊतक में सेलुलर विजातिता के वर्तमान की डिग्री से पता चलता है और दुर्लभ सेल आबादी के लिए नया मार्कर जीन uncovers. साथ प्रोटोकॉल के लिए कई अलग अलग प्रकार के सेल के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है.
Protocol
1. सेल हदबंदी
- एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा है दिखाया प्रवाह संचित्र चित्रा 1 है. विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों की कुल संख्या के लिए, तालिका 1 के लिए उल्लेख कृपया. एक पीबीएस स्नान में रेटिना काटना. विच्छेदन के दौरान, यह सबसे अच्छा है उनके रेटिना हदबंदी बाधित कर सकते हैं के साथ रखने के बाद से कांच का और लेंस को हटा दें. यह हमेशा महत्वपूर्ण नहीं है रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के सभी हटाने और कुछ मामलों में यह असंभव हो के लिए पूरी तरह से इसे निकाल सकते हैं. हालांकि, photoreceptors के एकल कक्ष की रूपरेखा प्रयोगों के लिए, RPE हटा दिया जाना चाहिए. विफलता के लिए RPE हटाने RPE व्यक्त जीनों के साथ छड़ी सेल प्रोफाइल के संदूषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह संभाव्यतः photoreceptors और RPE के बीच संबंध की वजह से है.
हदबंदी के लिए, पूरे वयस्क murine retinas 37 ° C पर 10 मिनट के लिए एक 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge 20 युक्त ट्यूब में incubated हैंμl सक्रिय papain, 20 μl 25 मिमी में 5 मिमी EDTA, Cysteine, और 360 μl हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) 10 मिमी HEPES के साथ पूरक है. फ़िल्टर इत्तला दे दी विंदुक युक्तियाँ प्रोटोकॉल भर में सभी कदम संभावित संदूषण को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है. papain एकाग्रता और ऊष्मायन के समय उम्र और ऊतक की प्रकृति के अनुसार अलग अलग होंगे. उदाहरण के लिए, विकासशील retinas के प्रसव के बाद का दिन 0 (P0) में अलग अलग कर देना, 10 μl सक्रिय papain, 10 μl 25 मिमी में 5 मिमी EDTA, Cysteine, और 380 μl हांक संतुलित नमक (HbSS) समाधान 10 मिमी HEPES के साथ पूरक में रेटिना सेते हैं 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए विभिन्न प्रजातियों में से retinas भी थोड़ा अलग स्थितियों की आवश्यकता है. चिकन retinas के विकास की सबसे अधिक चरणों में माउस retinas से पतले हैं. 10 μl सक्रिय papain, 10 μl 25 मिमी में 5 मिमी EDTA, Cysteine, और 380 μl हांक संतुलित नमक (HbSS) समाधान 37 पर 5 मिनट के लिए 10 मिमी HEPES के साथ पूरक डिग्री सेल्सियस का उपयोग टी अलग कर देना पर्याप्त हैhese retinas. - धीरे से किसी भी बस कोशिकाओं को जगह देना ट्यूब नल, तो एक P1000 pipettor के साथ 10-20 बार धीरे महीन चुर्ण बनाना. 37 पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस अगर ऊतक के बड़े clumps जारी रहती है और फिर पुन: महीन चुर्ण बनाना 10-20 बार.
- DNase मैं (10 यू / μl) 5 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. एक P1000 pipettor के साथ धीरे महीन चुर्ण बनाना. समय की सही संख्या के अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता है, लेकिन आम तौर पर 10-20 के बीच में पड़ता है.
- 3 मिनट के लिए 3000 rpm पर एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें, नीचे में तरल के 100-200 μl छोड़ने, और गोली जगह देना ट्यूब नल. 1 HbSS की मिलीलीटर जोड़ें और कोमल विचूर्णन साथ गोली resuspend है. दोहन ट्यूब में बस रेटिना की कोशिकाओं के कई lyse साथ गोली resuspending है के रूप में यहाँ महत्वपूर्ण है. यह वयस्क murine retinas के साथ विशेष रूप से सच है.
- 3 मिनट के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र ध्यान पीबीएस के 450 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend हटाने के होते हैंआईएनजी 0.1% BSA. यह महत्वपूर्ण है के रूप में संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के बहुत दूर करने के लिए lysed हदबंदी कि भविष्य प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकता है और कोशिकाओं से किसी भी उत्पाद से mRNAs की उपस्थिति कम से कम.
2. एकल कक्ष कटाई
- दो 6 सेमी पीबीएस की 5 मिलीलीटर 0.1% BSA के साथ पूरक युक्त व्यंजन तैयार करते हैं. प्लेट एक डिश पर अलग कोशिकाओं और कोशिकाओं को कम से कम 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. सेल इस्तेमाल किया घनत्व एकल प्रोफाइल कोशिकाओं जा रहा है की प्रकृति पर बहुत निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, बहुत दुर्लभ एक फ्लोरोसेंट मार्कर एक ऐसी GFP के साथ लेबल की कोशिकाओं के लिए, संपूर्ण अलग retinas के एक एकल 6 सेमी पकवान पर चढ़ाया जाता है. कोशिकाओं है कि कुछ और अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, कम कोशिकाओं को शुरू करने के लिए यह आसान पहली micropipette के साथ एक सेल (या बहुत करीब) फसल के लिए चढ़ाया जाता है.
- एक औंधा माइक्रोस्कोप पर अलग कोशिकाओं की प्लेट रखें. हम ओलिंप से आई एम टी-2 मॉडल का उपयोग करें. Micropipettes है कि इंटरनेट के लिए तैयार किया गया है का उपयोग करनापूर्वोत्तर टिप (भीतरी व्यास 0.5 मिमी, बाहरी व्यास 1.04 मिमी) (चित्रा 2) और एक चूषित्र ट्यूब के साथ एक साथ, एक एकल कोशिका फसल. कोशिकाओं को आसानी से micropipette जब यह पकवान पर उन्हें बंद रखा गया है दर्ज करें. यह महत्वपूर्ण है कि चूषित्र ट्यूब न तो बहुत लंबा और न ही उलटा माइक्रोस्कोप (चूषित्र ट्यूबों हम हमारे उलटा माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग 38.1 सेमी लंबे होते हैं) के साथ जुड़े चरण के लिए दूरी के लिए बहुत छोटा है. यदि ट्यूब बहुत लंबा है, कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक संग्रह ट्यूब से micropipette में नहीं निष्कासित किया जा सकता है. प्राथमिक कारण है कि हम बड़े आई एम टी 2 मॉडल उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग यह है कि हमने पाया है यह हमारे चूषित्र विधानसभा ट्यूबों के लिए मंच के लिए आदर्श दूरी है. Micropipette में प्रवेश करने के बाद, सेल कोशिकाओं (या) एक दूसरे की थाली (धोने थाली) पर निष्कासित कर दिया है करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक और केवल एक सेल जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए काटा जाता है. दूसरी प्लेट पर यह अक्सर आवश्यक है या तो एक नया micropipette साथ बाहरी कोशिकाओं को हटानेया एक अलग स्थान पर ब्याज की सेल को स्थानांतरित करने के लिए सुनिश्चित करें कि केवल एक ही सेल micropipette में प्रवेश करती है.
- जब एक व्यक्ति सेल पूरी तरह से पड़ोसी की कोशिकाओं से अलग है, एक नया micropipette का उपयोग करने के लिए 2.2 खंड में के रूप में ब्याज की सेल महाप्राण (व्यंजन) और उसके बाद यह 0.2 मिलीग्राम पीसीआर 4.5 μl सेल बफर युक्त ट्यूब में सीधे निष्कासित. सेल ट्यूब की ओर पर निष्कासित कर दिया है, सावधान किया जा रहा नहीं तोड़ micropipette के ट्यूब में टिप. नमूने एक बेंच शीर्ष lysis बफर में सेल विसर्जित microcentrifuge में संक्षिप्त काता जा सकता है. यह कताई आमतौर पर हर 5 सेल के बाद तो फिर और lysis बफर में एकल कक्षों युक्त collection.Tubes के अंत में बर्फ पर एकल कक्ष अलगाव की अवधि के लिए रखा जाना चाहिए किया जाता है. इष्टतम परिणामों के लिए, एकल कक्षों के एक दो घंटे बाद हदबंदी खिड़की के भीतर एकत्र कर रहे हैं. के बाद इस समय बीत गया है, यह सबसे अच्छा है करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन कदम के लिए आगे बढ़ना के बाद से अतिरिक्त समय observ किया गया हैएड आरएनए गिरावट की संभावना को बढ़ाने के लिए.
3. ट्रांसक्रिप्शन उल्टा
- संक्षेप में एक benchtop minicentrifuge में नमूने स्पिन करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए सभी एकल कक्षों सेल बफर में डूब रहे हैं. सेल को बढ़ावा देने के लिए, 70 ° C पर 90 सेकंड के लिए नमूना सेते हैं. thermocycler में. तुरंत बर्फ पर वापस ट्यूबों की जगह है.
- बर्फ पर 2 मिनट के लिए छोड़ दो ट्यूबों. सभी अभिकर्मक परिवर्धन के लिए, फिल्टर की नोक विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करने के लिए प्रदूषण को रोकने के लिए. रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करने के लिए, 0.33 μl सुपरस्क्रिप्ट III (यू 200 / μl), 0.05 μl RNase अवरोध करनेवाला (40 यू / μl), और 0.07 μl टी -4 जीन 32 प्रोटीन जोड़ें. 50 में 50 मिनट ° एक thermocycler में सी के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं. 15 और बर्फ पर मिनट जगह के लिए 70 में एंजाइम डिग्री सेल्सियस निष्क्रिय.
- मुक्त प्राइमर को निकालने के लिए, 0.1 μl exonuclease (10X) बफर, 0.8 μl 2 DH 0 (आणविक जीव विज्ञान ग्रेड), और 0.1 μl exonuclease जोड़ने मैं (20 यू μl /). में 30 मिनट के लिए 37 ° C पर सेते हैंएक thermocycler. 80 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए प्रतिक्रिया और फिर incubating के बर्फ पर ट्यूब डाल द्वारा एंजाइम निष्क्रिय.
4. पीछा और एकल सेल पीसीआर
- पीछा प्रतिक्रिया मिश्रण की 6 μl जोड़ें और एक thermocycler उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट, 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए नमूना सेते हैं, और 4 में पकड़ डिग्री सेल्सियस
- पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण पूंछ नमूना के 10 μl जोड़ें और दूसरा किनारा संश्लेषण और पीसीआर प्रवर्धन के बाद स्थितियों का उपयोग करते हैं:
- 95 ° 2 मिनट के लिए सी
- 37 ° 5 मिनट के लिए सी
- 72 ° 16 मिनट के लिए सी
- 93 ° C 40 सेकंड के लिए
- 67 ° 1 मिनट के लिए सी
- 6 मिनट के लिए 72 ° सी, 6 चक्र प्रति सेकंड जोड़ने
- 4 34 बार कदम जाओ
- 72 ° 10 मिनट के लिए सी
- 4 में रुको डिग्री सेल्सियस
5. Affymetrix चिप्स के लिए लेबल
- लेबल सीडीएनए 10-20 μg (प्रवर्धित सीडीएनए परिणाम की एकाग्रताएक एकल कोशिका से आईएनजी आमतौर पर 1 / μg μl ~~ है) के Affymetrix प्रोटीन पर एक मजबूत संकरण प्राप्त. सबसे पहले, टुकड़ा 8 μl एक Phor - सभी और पतला की 1 μl बफर (1X में 1:10 एक Phor सभी बफर) DNaseI 1X एक μl 80 में एकल कक्ष सीडीएनए 10-20 μl जोड़कर सीडीएनए प्रतिक्रिया. 37 पर 13 मिनट के लिए एक thermocycler में सेते हैं डिग्री सेल्सियस 100 डिग्री सेल्सियस और बर्फ पर जगह पर 15 मिनट के लिए DNase मैं निष्क्रिय.
- 20 μl 5X TdT बफर, 2.5 μl N6 ddATP एंज़ो बायोसाइंसेज बायोटिन, और 1 μl TdT के (TDT बफर में 01:08 पतला) जोड़ें.
- 37 ° सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए सेते हैं, तो 5 मिनट में 65 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान या तुरंत एक Affymetrix माइक्रोएरे संकरण. संकरण मानक Affymetrix प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
सीडीएनए, सीडीएनए नमूना के 10 μl की गुणवत्ता का आकलन एक 1% agarose जेल पर लोड किया गया था. सीडीएनए मुख्य रूप से आकार सीमा से माना जाता है (500-2,000 बीपी)सीडीएनए धब्बा की तीव्रता और (चित्रा 1 चित्रा 3a). चित्र 1 में दर्शाया जेल में, हर दूसरे लेन से पता चलता है कि रेटिना की कोशिकाओं से एक सीडीएनए धब्बा E16.5 अलग. गलियों के बीच में जिसके परिणामस्वरूप स्मीयरों दिखाने के लिए जब केवल मीडिया सुई में aspirated होता है और पीसीआर ट्यूब में जमा है. इन गलियों को पूरी तरह से रहित, एक बेहोश धब्बा कभी नहीं कर रहे हैं, लेकिन वे कोई परिणाम प्रदर्शित नहीं जब जीन विशेष पीसीआर प्राइमरों उनमें से जीन बढ़ाना उपयोग किया जाता है. इसके अतिरिक्त, सीडीएनए धब्बा की तीव्रता कुछ भिन्न (1 चित्रा और चित्रा 3a की तुलना कर सकते हैं). चित्रा 3a गलियों में, च, छ, और घंटे मजबूत सीडीएनए स्मीयरों होते हैं जबकि गलियों बी, सी, डी, ई और काफी कम मजबूत कर रहे हैं.
जीन विशेष पीसीआर सीडीएनए की गुणवत्ता के एक एकल कोशिका से एक माध्यमिक स्क्रीन के रूप में प्रयोग किया जाता है. चित्रा 3 में cDNAs फ्लोरोसेंट रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से अलग थे और वे teste में थेरेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल मार्कर Brn3b और Pax6 के लिए पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर. इस परख के लिए, 1 सीडीएनए की μl 30 चक्र के लिए पीसीआर के अधीन था. वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर बेहतर परख होगा, लेकिन यह बेहद महंगा हो सकता है और केवल सीडीएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए आवश्यक नहीं है. सभी एकल कक्षों के 8 Brn3b और 6 के लिए सकारात्मक Pax6 (3b चित्र) के लिए 8 बाहर का परीक्षण किया. सीडीएनए स्मीयरों भी है कि कम मजबूत थे उत्पादन बैंड Brn3b और Pax6 के लिए. इन पीसीआर परिणामों के बावजूद, यह हमारा अनुभव है कि गलियों ख, ग, घ, और ई में उन लोगों के रूप में सीडीएनए स्मीयरों मजबूत hybridizations Affymetrix arrays पर नहीं उपज नहीं कर रहे हैं और आम तौर पर परहेज है. फोटोरिसेप्टर मार्कर CRX के लिए जीन विशिष्ट पीसीआर एकल कक्ष cDNAs (3b चित्रा) में संदूषण का स्तर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक फोटोरिसेप्टर मार्कर चुना गया था क्योंकि इन कोशिकाओं रेटिना के बहुमत (70 ~%) बनाने के लिए और, इसलिए, किसी भी सेल हुआ संभावना सबसे छड़ी photore के शामिल होगाceptors. वहाँ केवल CRX वर्तमान के एक बेहोश राशि पीसीआर के 30 चक्रों के बाद भी इन सीडीएनए की तैयारी में है. अंत में, इस स्क्रीन पीसीआर आधारित निर्धारित करने के लिए एक विशेष सेल प्रकार का सबसेट जो cDNAs उन्हें एक पूर्ण माइक्रोएरे रूपरेखा subjecting से पहले से प्राप्त किए गए शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कोशिकाओं है कि profiled, के रूप में इस प्रक्रिया में सबसे महंगी कदम है को प्राथमिकता में मदद कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, हम उन्हें जीन Tachykinin1 (3b चित्रा) की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग से रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के सबसेट की पहचान की है.
छोटे परदे पीसीआर आधारित से, विशेष रूप से एकल कक्षों का चयन कर रहे हैं और उनके cDNAs एक Affymetrix माइक्रोएरे संकरित. माइक्रोएरे डेटा की तुलना में और पैटर्न मानक क्लस्टरिंग एल्गोरिदम का उपयोग करते हुए खोज की जा सकती है. चित्रा 4 में जैसे heatmaps, रेखांकन से डेटा का प्रतिनिधित्व करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. वहाँ दो मुख्य चित्रा में एकल कक्ष की रूपरेखा डेटा के बारे में निष्कर्ष हैं4. सबसे पहले, विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त जीनों लगभग विशेष रूप से उन प्रकार की कोशिकाओं में पाया जाता है के बाद एकल कक्ष प्रोटोकॉल किया जाता है. ज्यादातर मामलों में जहां एक सेल प्रकार के जीन मार्कर अवलोकन के रूप में एक दूसरे सेल प्रकार, कि द्विध्रुवी कोशिकाओं को निचले स्तर पर कुछ "छड़ी" जीन व्यक्त दूसरी कोशिका प्रकार में यह अभिव्यक्ति बगल में आसानी से या तो द्वारा की पुष्टि की है में भी पाए जाते हैं संकरण या एंटीबॉडी धुंधला. दूसरा, और अधिक विविध लंबे प्रबर्धों से रहित और नाड़ीग्रन्थि सेल प्रोफाइल के भीतर, जीन अभिव्यक्ति की विविधता तुरंत स्पष्ट है. Pou4f1 केवल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के विकास के बारे में 1/4 में व्यक्त किया है, जबकि Nr4a2 और Scube2 अलग लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं में विभिन्नतापूर्वक व्यक्त जीनों के दो उदाहरण हैं. वास्तव में, heatmap में दिखाया जीन सिर्फ एक छोटा सा नमूना के रूप में कई सौ जीन की पहचान की गई है और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के विकास के मार्कर के रूप में या लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं 2,4 के विभिन्न आबादी के मार्कर के रूप में पुष्टि की.
आकृति 1. एकल कक्ष की रूपरेखा विधि का फ़्लोचार्ट पहले retinas के अलग और व्यक्तिगत papain का उपयोग कर कक्षों में अलग हैं. दूसरा, एकल कक्षों के एक खींच लिया गिलास सुई के साथ harvested रहे हैं और पीसीआर ट्यूबों में जमा है. कोशिकाओं lysed और सीडीएनए रिवर्स पीसीआर द्वारा पीछा प्रतिलेखन का उपयोग प्रवर्धित. परिणामस्वरूप सीडीएनए गुणवत्ता के रूप में दिखाया गया है एक agarose जेल पर मूल्यांकन किया है. पहली गली में डीएनए सीढ़ी के बाद, गलियों एकल कोशिकाओं लाल कोष्ठक ने संकेत दिया है मीडिया पर नियंत्रण के से प्रवर्धन उत्पादों के साथ बारी से सीडीएनए स्मीयरों दिखा. इस गुणवत्ता की स्मीयरों (लाल कोष्ठक) को Affymetrix प्रोटीन संकरित कर रहे हैं.
चित्रा 2. सुई और चूषित्र ट्यूब विधानसभा की तस्वीरें एकल कक्षों के केशिका कार्रवाई का उपयोग कर अलग कर रहे हैंकांच micropipette (भीतरी व्यास 0.5 मिमी, बाहरी व्यास 1.04 मिमी) खींच लिया और हवा खींचने की मशीन में उड़ाने के दबाव के द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं. यह महत्वपूर्ण है कि चूषित्र ट्यूब दोनों लंबे समय के लिए आसानी से हेरफेर के लिए पर्याप्त और पर्याप्त मज़बूती से व्यक्ति की कोशिकाओं का निर्वहन कम है. एक सुई में खींच लिया केशिका ट्यूब की एक क्लोज़ - अप दृश्य बी में दिखाया गया है
चित्रा 3. एकल कक्ष सीडीएनए स्मीयरों और जीन विशिष्ट PCRs के प्रतिनिधि उदाहरण के प्रवर्धन के बाद एकल कक्ष सीडीएनए की गुणवत्ता निर्धारित करने, प्रत्येक एकल सेल नमूना के 10 μl एक 1% agarose जेल पर एक नकारात्मक नियंत्रण (ए) के साथ चलाए जा रहे थे. 500-2000 बीपी के बीच एक धब्बा दिखाई देनी चाहिए. विशेष जीन के लिए अतिरिक्त पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग की पहचान / पृथक किया गया है कि सेल के प्रकार और नमूना में संदूषण वर्तमान की राशि (बी) की पुष्टि करने के लिए मदद कर सकते हैं. रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के लिए विशिष्ट प्राइमरों Brn3b मार्करोंऔर Pax6 इन कोशिकाओं (1 पंक्तियाँ और 2) की पहचान की पुष्टि करने के लिए परीक्षण किया गया. तैयारी में फोटोरिसेप्टर संदूषण की राशि का आकलन करने के लिए, फोटोरिसेप्टर मार्कर CRX के लिए विशिष्ट प्राइमरों (पंक्ति 3) का इस्तेमाल किया गया. नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं का उपसमुच्चय भी Tachykinin1 (4 पंक्ति) के रूप में मार्करों के लिए स्क्रीनिंग के माध्यम से पहचान की जा सकता है.
चित्रा 4. मार्कर जीन की एकल कोशिका अभिव्यक्ति. चयनित 22 अलग एकल कक्षों में व्यक्त जीनों के लिए माइक्रोएरे परिणाम एक heatmap स्वरूप में दिखाया जाता है. माइक्रोएरे संकेतों से तीव्रता के लिए लाल रंग की तीव्रता के साथ अनुरूप करने के लिए उन्नत किया गया. काले माइक्रोएरे पर संकेत के अभाव को इंगित करता है. रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) दिखाया व्यापारियों भ्रूण समय अंक से अलग थे, जबकि अन्य कोशिकाओं वयस्क retinas से अलग थे.
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Discussion
अध्ययन की एक कभी विस्तार की संख्या आबादी है कि उनके जीन अभिव्यक्ति 6,8 के संबंध में अधिक सजातीय होना माना गया में मजबूत परिवर्तनशीलता सेल के लिए सेल का खुलासा कर रहे हैं. कम से कम एक उदाहरण में, इस जीन की अभिव्यक्ति "शोर" के लिए एक महत्वपूर्ण जैविक समारोह 13 खेलने के लिए दिखाया गया है. व्यक्ति की कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति मतभेद पारंपरिक पूरे ऊतक तरीकों का उपयोग कर छिप कर रहे हैं. इन प्रयोगों एक "औसत" सेल है, जो 14 प्रतिनिधि नहीं हो सकता है की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल उत्पन्न करते हैं. यहाँ हम अलगाव और एक रेटिना की कोशिकाओं से जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. व्यक्ति की कोशिकाओं के अध्ययन शोधकर्ताओं सेलुलर परिसर ऊतकों अंतर्निहित विविधता है, जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है की जांच करने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, एकल कोशिका अलगाव जीन indiv की गतिविधि ड्राइविंग कार्यक्रमों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैंविकास भर में समय अंक में idual कोशिकाओं. हालांकि विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र, जहां जटिल सेलुलर नेटवर्क के कामकाज दुर्लभ कोशिका प्रकार के अद्वितीय जीन अभिव्यक्ति पर निर्भर कर सकते हैं का अध्ययन करने में उपयोगी, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न ऊतकों से व्यक्ति की कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
जल्दी से विकसित murine रेटिना में, नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, क्षैतिज कोशिकाओं, कोन फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं कोशिकाओं और लंबे प्रबर्धों से रहित सभी 15 समय के एक अतिव्यापी विंडो में उत्पन्न कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक कोशिका है कि सेल चक्र से बाहर निकल गया है परिपक्वता का एक अलग चरण में है और इस तथ्य केवल विकासशील रेटिना की जटिलता कहते हैं. अंत में, रेटिना न्यूरॉन्स के कुछ प्रकार के लिए, परिपक्व 16 रेटिना में कई अलग अलग morphologies (30 ~ लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं के मामले में) मौजूद हैं. चूंकि रेटिना सेल प्रकार, माइक्रोएरे और जीन अभिव्यक्ति के सीरियल विश्लेषण (ऋषि) के अध्ययन पर आधारित 17-19 के इस तरह के एक मिश्रण कि homogeniz पर भरोसा हैपूरे रेटिना के व्यावहारिक मार्करों दुर्लभ उपप्रकारों और गतिशील जीन अभिव्यक्ति सेल प्रकार के बीच मतभेदों को सुलझाने में असमर्थ में व्यक्त जीनों के विकास के दौरान विशेष रूप से, को उजागर करने में असमर्थ हैं. दोनों वयस्क रेटिना और रेटिना के विकास के दौरान विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की जटिलता को समझने के लिए शुरू, एक ~~ कई अलग अलग समय बिंदुओं से 200 व्यक्ति की कोशिकाओं के सेल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल 2-5,8 विश्लेषण किया गया है. परिणामी डेटा व्यक्तिगत सेल प्रकार के लिए नई मार्करों का एक मेजबान प्रदान की गई है और विकास समय है कि पहले से अगोचर थे में महत्वपूर्ण बदलाव में एक खिड़की प्रदान की.
एकल कक्ष अभिव्यक्ति प्रोफाइल लंबे प्रबर्धों से रहित 4 कोशिकाओं, जहां यह उम्मीद थी में जीन अभिव्यक्ति में काफी विविधता है पता चला है, और मुलर glia कोशिकाओं, जहां यह 5 अप्रत्याशित था. जबकि एक लंबे प्रबर्धों से रहित सेल डेटा की एक परीक्षा है कि लंबे प्रबर्धों से रहित में व्यक्त किया गया 450 से अधिक जीन का पता चलाकोशिकाओं और अन्य रेटिनल प्रकार के सेल से बाहर रखा, इन जीनों में से कोई भी सभी लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं 4 में व्यक्त किया गया. इन परिणामों सबसे अधिक संभावना यह है कि लंबे प्रबर्धों से रहित सेल वर्ग अत्यंत विविध है और अंतर्निहित विविधता है इन कोशिकाओं के विशिष्ट कार्यों का एक प्रतिबिंब है से उत्पन्न होती हैं. इन निष्कर्षों संभव नहीं पूरे ऊतक आधारित दृष्टिकोण का उपयोग होगा. अंत में, साइकिल रेटिनल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (RPCs) रेटिना सेल 8 प्रोफाइल प्रकार के किसी भी जीन अभिव्यक्ति में विविधता के सर्वोच्च डिग्री का प्रदर्शन किया. प्रतिलेखन कारक जीन के वर्ग पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के बीच विविधता के सर्वोच्च डिग्री के साथ थे, सुझाव है कि गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न अलग रेटिना सेल 8 प्रकार के विकास में एक प्रमुख भूमिका निभा सकता है. फिर, इन परिणामों एकल सेल जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा तकनीक के उपयोग के बिना संभव नहीं होता है.
एकल कक्ष transcriptome की पढ़ाईभी रोग तंत्र में जानकारी पाने के लिए उपयोग किया जा सकता है. रेटिना अपक्षयी रोगों सहित कई neurodegenerative रोगों, में, कुछ न्यूरॉन्स मर जबकि पड़ोसी न्यूरॉन्स 20 जीवित रहने के. समझ क्यों कुछ कोशिकाओं apoptosis गुजरना जीन या जीन प्रोग्राम है कि व्यक्ति की कोशिकाओं में इन रोग मॉडल में बदल रहे हैं की पहचान की आवश्यकता है. पूरे ऊतक मॉडल फिर से संभावित कोशिकाओं के बाद से परिवर्तन अक्सर नहीं एक ही समय में मर जाते हैं और, इसलिए, किसी भी समय में ऊतक मर रहा है और जीवित कोशिकाओं के एक मिश्रण है अस्पष्ट है. इसके अतिरिक्त, कई तरह के कैंसर के लिए मूल के सेल एक खुला प्रश्न है. यह बचपन आंख ट्यूमर के retinoblastoma के साथ विशेष रूप से मामला है. हाल ही में एकल कक्ष की रूपरेखा यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग कर, यह दिखाया गया कि retinoblastomas से व्यक्ति की कोशिकाओं के कई सेल के 21 प्रकार के जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के अधिकारी. ऐसा लगता है कि इन कोशिकाओं undifferentiated पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और 2 न्यूरॉन्स संकर हैं1. इन प्रयोगों एकल कोशिका के स्तर पर विश्लेषण और आवश्यक नहीं होता पूरे ऊतकों दृष्टिकोण के साथ संभव है.
वैकल्पिक तरीकों
रैखिक प्रवर्धन पीसीआर आधारित प्रवर्धन यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक विकल्प है. जबकि पीसीआर आधारित प्रवर्धन बहुतायत रिश्तों की एक skewing में परिणाम माना जाता है, रैखिक प्रवर्धन इन रिश्तों 22 को बनाए रखने के लिए सोचा है. रैखिक प्रवर्धन की तकनीक के लिए कई neuronal प्रकार के 23 प्रोफ़ाइल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, दो तरीकों के बीच प्रत्यक्ष तुलना संकेत दिया है कि रैखिक प्रवर्धन तकनीक एक उच्च झूठी नकारात्मक 24,25 दर के साथ जुड़ा हो सकता है. हम दो कारणों के लिए पीसीआर आधारित इस रिपोर्ट में विस्तृत विधि एहसान. सबसे पहले, हम हमारे प्रयोगों में कोशिकाओं के बीच मजबूत अभिव्यक्ति अंतर के साथ जीन पर ध्यान केंद्रित. दूसरा, हम हमारे एकल कक्ष माइक्रोएरे समर्थक के बीच एक बहुत अच्छा संबंध पाया गया हैप्रयोगों दाखिल करने और एक ही जीनों के लिए स्वस्थानी संकरण अध्ययन में. वास्तव में, तिथि करने के लिए हम जीनों के सैकड़ों के लिए स्वस्थानी hybridizations में प्रदर्शन किया है और कम से कम 75% प्रोटीन से भविष्यवाणी पैटर्न मैच है मनाया. यह सबसे अधिक संभावना एक रूढ़िवादी अनुमान है के बाद से एक विसंगति के लिए सबसे आम कारण से स्वस्थानी जांच में संकेत की कमी है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
References
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