Summary
Un rotante sistema di coltura cellulare che consente alle cellule epiteliali di crescere in condizioni fisiologiche con conseguente 3-D formazione di aggregati cellulare viene descritto. Gli aggregati di visualizzazione generato
Abstract
Cellule e tessuti in condizioni di sperimentare il corpo ambientali che influenzano la loro architettura, le comunicazioni intercellulari e le funzioni generali. Per i modelli cellulari in coltura in vitro per simulare con precisione il tessuto di interesse, l'ambiente di crescita della cultura è un aspetto critico da considerare. Comunemente utilizzati convenzionali sistemi di coltura cellulare propagano cellule epiteliali su superfici piane bidimensionali (2-D) impermeabili. Sebbene molto sia stato appreso dai sistemi convenzionali di coltura cellulare, molti risultati non sono riproducibili in studi clinici umani o espianti di tessuto, potenzialmente a causa della mancanza di un microambiente fisiologicamente rilevante.
Qui, si descrive un sistema di coltura che supera molti dei confini delle condizioni di coltura di 2-D colture cellulari, utilizzando l'innovativo rotante parete del vaso (RWV) tecnologia bioreattore. Noi e altri hanno mostrato che organotipiche RWV derivati i modelli possono ricapitolare Structure, la funzione e autentiche risposte umane a stimoli esterni in modo simile ai tessuti umani espianti 1-6. Il bioreattore RWV è un sistema di coltura in sospensione che consente la crescita di cellule epiteliali in condizioni fisiologiche bassa fluido di taglio. I bioreattori sono disponibili in due diversi formati, ad alta aspetto recipiente rotante (Harv) o una lenta rotazione vaso laterale (STLV), in cui si distinguono per la loro fonte aerazione. Le cellule epiteliali vengono aggiunti al bioreattore di scelta in combinazione con porosi, collagene perle rivestite microveicolo (Figura 1A). Le cellule utilizzano le perline come una crescita ponteggio durante la caduta libera costante nel bioreattore (figura 1B). Il microambiente fornito dal bioreattore permette alle cellule di formare aggregati tridimensionali (3-D) mostrano in vivo caratteristiche simili spesso non osservata sotto standard 2-D condizioni di coltura (Figura 1D). Queste caratteristiche includono giunzioni strette, MUCCi produzione, apicale / basale orientamento, nella localizzazione delle proteine vivo, e ulteriori cellule epiteliali di tipo proprietà specifiche.
La progressione da un monostrato di cellule epiteliali completamente differenziate 3-D aggregato varia in base al tipo di cellula 1, 7-13. Campionamento periodico dal bioreattore consente il monitoraggio del epiteliale formazione di aggregati, marcatori di differenziazione cellulare e vitalità (Figura 1D). Una volta che la differenziazione cellulare e formazione di aggregati è stabilito, le cellule sono raccolte dal bioreattore, e simili saggi eseguiti su cellule 2-D possono essere applicati agli aggregati 3-D con alcune considerazioni (Figura 1E-G). In questo lavoro, si descrive la procedura dettagliata di come la cultura in 3-D aggregati di cellule epiteliali del sistema di bioreattore RWV e una varietà di potenziali saggi e analisi che possono essere eseguiti con le 3-D aggregati. Queste analisi includono, ma non sono limitati a, strutturale / mAnalisi orphological (confocale, scansione e microscopia elettronica a trasmissione), di citochine / chemochine e la secrezione di segnalazione cellulare (mediante citometria a matrice tallone e Western blot), le analisi di espressione genica (real-time PCR), tossicologiche / droga analisi e interazioni ospite-patogeno. L'utilizzo di questi test creato le basi per studi più approfonditi ed espansivo come metabolomica, trascrittomica, proteomica e di altre applicazioni basate su array. Il nostro obiettivo è quello di presentare una non convenzionali mezzi di coltura di cellule epiteliali umane per produrre organotipiche modelli 3-D che ricapitolano l'essere umano nel tessuto vivo, in un sistema facile e robusto per essere utilizzato da ricercatori con diversi interessi scientifici.
Protocol
Tutte le procedure devono essere effettuate sotto BSL-2 condizioni di una cappa a flusso laminare.
1. Preparazione del bioreattore STLV
- Assemblare il bioreattore STLV secondo il protocollo del produttore ed eseguire protocollo di disintossicazione per garantire la sterilità del bioreattore. Coprire le porte aperte con tappi luer e riempire il STLV con il 95% di etanolo per 24 ore.
- Rimuovere etanolo e riempire la STLV con acqua distillata sterilizzata per 24 h.
- Ripetere il passaggio 1.2 con acqua distillata sterilizzata.
- Con lo strumento fornito dal venditore, allentare tutte le viti, tappi e spina centrale dai STLV e autoclave a 110 ° C per 20 minuti in un sacchetto di sterilizzazione.
- Una volta che il STLV viene raffreddato, stringere le viti e ripetere i passi 1.1-1.4 per garantire la sterilità e la disintossicazione completa.
- Serrare le viti di raffreddamento del STLV e vite pre-sterilizzati a senso unico rubinetti a ciascuna porta.
- Rubinetto aperto posizionando le manopole in senso verticale.
- Rimuovere gli stantuffi da un mL 10 mL e 5 siringa luer-lock e ri-maniche pistoni indietro nel wrapper per mantenere la sterilità. Avvitare siringhe su rubinetti (siringhe Luer-Lock punta sono necessari per questo passaggio).
- Aggiungere di Dulbecco phosphate-buffered saline (DPBS) per la siringa da 10 ml fino STLV è pieno e inizia a riempire la siringa da 5 ml.
- Sostituire gli stantuffi sterili in ogni siringa e rimuovere le bolle residue presenti nel bioreattore alternando tra la guida stantuffi delle siringhe.
- Lasciare le siringhe attaccate al bioreattore dopo la rimozione di tutte le bolle. Chiudere rubinetti e collegare il STLV alla piattaforma rotante verticale e ruotare per un minimo di 24 h per monitorare la presenza di perdite.
2. Preparazione Beads microveicolo
- Aggiungere 15 ml di DPBS ~ 250 mg cytodex microveicolo perline in una provetta da 50 ml e autoclave sotto stesse STLV (1,4).
- Dopo il raffreddamento, rimuovere DPBS, aggiungere supporti utilizzati per crescere epithelial cellulare di interesse, e tubo agitare per risospendere le sfere.
- Ripetere il lavaggio passi con i media altre due volte. Dopo il lavaggio finale aggiungere 15 ml di terreno di coltura perle.
3. Semina cellule epiteliali e Perline nel bioreattore STLV
- Crescere le cellule epiteliali di interesse come monostrati in fiasche di coltura tissutale fino ad ottenere età ≥ 1x10 7 cellule. Rimuovere le cellule del pallone (trypinsization cioè EDTA), contare le celle per stabilire la concentrazione cellulare, e determinare la vitalità cellulare mediante colorazione esclusione trypan blue 1.
- Per il tubo conico contenente microsfere di preparati (vedi punto 2.3), aggiungere concentrazione desiderata di cellule (2x10 5-1x10 7 cellule epiteliali) 2, 8, a seconda del tipo di cellula epiteliale di intenti (Figura 1A). Assicurarsi che tutte le cellule sono trasferite dal risciacquo del tubo conico.
- Rimuovere DPBS e siringhe dal STLV.
- Staccare la spina dalla porta centrale e aggiungere il epiteliale cell / sospensione tallone nel STLV utilizzando 10 mL pipetta sierologica. Risciacquare tubo conico a garantire tutte le celle anali sono trasferiti al STLV e sostituire tappo porta centro.
- Rimuovere pistoni da un 5 e 10 ml siringhe e ri-maniche stantuffi indietro nel wrapper per mantenere la sterilità. Avvitare siringhe nei porti con rubinetti aperti. Riempire il STLV con i media, sostituire pistoni e rubinetti vicini.
- Posizionare il STLV appena seminato in un incubatore a 37 ° C per 30 minuti senza rotazione.
- Rubinetti aperti, rimuovere le bolle con pistoni, rubinetti di arresto e poi chiudono.
- Posizionare il STLV a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato rotante a 20 rpm (figura 1B). Culture deve essere ruotato in continuo 24 ore al giorno tranne quando campionamento, i media che cambiano, o aggregati di raccolta (vedere la sezione successiva).
4. Coltura, di campionamento, e documentazione fotografica delle Culture
- Dopo una prima 96-120 h di coltura di cellule in bioreactor, media cambiamento inclinando il STLV e consentendo alle cellule anali di stabilirsi. Rimuovere siringhe, aprire entrambi i rubinetti d'arresto, e versare off ~ 75% dei mezzi di comunicazione dalla porta laterale (Figura 1C). Sulla base del metabolismo cellulare dei media, cambia i media ogni giorno o ogni altro giorno dopo la semina iniziale e 96-120 periodo di coltura h.
- Avvitare il 5 e 10 ml siringhe vuoto di stantuffi e di seguire il protocollo refeeding come descritto in precedenza (1,7-1,11), quindi riavvitare chiuso sul retro STLV in luogo piattaforma rotante.
- Monitorare la crescita e la vitalità degli aggregati ogni 5-7 giorni dopo la semina in STLV rimuovendo con cura una piccola quantità di aggregati (~ 200 pl) dal centro porta in due provette da 1,5 ml. Per evitare taglio complessivo, per tutti i trasferimenti di aggregazione utilizzare una punta di 1.000 ul pipetta che è stato tagliato ~ 2 cm dal punto e sterilizzato.
- Sostituire il connettore centrale, scambio con siringhe nuove, aggiungere mezzi freschi al STLV come descritto in precedenza (1,7-1,11), e posizionare la parte posteriore STLV nelincubatore con rotazione (vedi 3.8).
- Per monitorare la vitalità cellulare, utilizzare uno dei due aggregati 1,5 mL tubo aliquotati in fase 4,3, e rimuovere le cellule dal sfere nello stesso modo vengono rimosse le cellule epiteliali fiaschette per coltura tissutale (tripsinizzazione ie). Monitorare la redditività per esclusione trypan colorazione blu 1.
- Per gli aggregati di imaging cellulare, aggiungere 0,5-1 mL di supporto alla seconda aliquota 1,5 mL di aggregazione e trasferirlo in una piccola scatola di Petri con un cut-off 1000 punta ul pipetta. Aggregati immagine utilizzando un microscopio invertito luce (Figura 1D).
5. Trasferimento e raccolta Aggregati
- Per alcuni modelli di cellule epiteliali è necessario trasferire gli aggregati a un Harv monouso per aumentare aerazione cultura 2. Circa una settimana prima della raccolta aggregati per l'analisi, rimuovere le siringhe e rubinetti dal STLV e versare off ~ 50% dei mezzi di comunicazione dalla porta laterale.
- Remuovere spina centro STLV e accuratamente versare tutto il contenuto in un tubo di 50 ml dal centro di porto (Figura 1E). Sciacquare i STLV due volte con 5 ml e si combinano i media lavare con il resto degli aggregati.
- Continuare con il trasferimento degli aggregati come descritto in 5.2, ma aggregati di trasferimento dal tubo di 50 ml al Harv.
- Attentamente aggregati raccolto dal Harv dopo ~ 1 settimana o dal STLV (in base al tipo cellulare) come è stata effettuata in precedenza (5.2). Vedi sotto per formati di saggio potenziali, saggi e analisi successivi alla raccolta aggregata.
6. Analisi potenziale, applicazioni e saggi condotti con aggregati
- Aggregati seeding per vari formati sperimentali. La quantità desiderata di inerti dal tubo di 50 ml in una provetta da 1,5 ml, 24 pozzetti, o piastra a 96 pozzetti utilizzando un cut-off sterilizzati 1000 punta ul pipetta (Figura 1F).
- Lavaggio e prepaIng aggregati per l'analisi. Rimuovere i supporti dopo aggregati si sono stabiliti. Dispensare DPBS direttamente al centro della provetta o del pozzetto in modo che tutti gli aggregati sono fomentato. Una volta aggregati si sono stabiliti a fondo, togliere DPBS e ripetere tante volte quante sono necessarie.
- Aggregati di spedizione per off-site di sperimentazione e di analisi. Aggiungi quantità desiderata di aggregati in una provetta da 50 mL e lavare aggregati come in 6.2. Riempire completamente tubo da 50 ml con i media, berretto, e parafilm intorno al tappo per evitare perdite. Spedire in modo sicuro aggregati nella posizione desiderata per tutta la notte a temperatura ambiente.
- Aggregati di fissaggio per microscopia elettronica (Figura 2). Scanning, trasmissione o immuno-microscopia elettronica può essere effettuata mediante il trasferimento di 150-300 ul aggregati in una provetta da 1,5 ml e lavaggio inerti 3 volte con DPBS (6.2). Aggiungere 200 pl di applicazione specifica (SEM, TEM, immuno-EM, ecc) fissativo microscopia elettronica per il periodo di incubazione desiderato. Rimuovere fissaggio, lavaggio AggregatES 2 volte con DPBS e procedere come descritto nella Hjelm et al. 2010 per la scansione e microscopia elettronica a trasmissione 2.
- Microscopia immagini immunofluorescenza (Figura 3). Transfer ~ 100 microlitri aggregati ad un tubo di 1,5 ml e aggregati di lavaggio (6.2). Fissare e aggregati di etichette con anticorpo in condizioni analoghe a quelle con monostrati, tranne che in una provetta da 1,5 ml. Per montare, mettere 1 goccia di mezzo di montaggio su vetrino da microscopio, trasferire aggregati marcate sulla parte superiore del supporto di montaggio con un cut-off 1000 punta della pipetta pl, coprioggetto nell'arco di aggregati, sigillare il coprioggetto con smalto, e far scorrere secco per una notte 2.
- Misurare la vitalità cellulare / proliferazione mediante saggio MTT (Figura 4). Aggregati di trasferimento ad una piastra a 24 pozzetti e sostituire il supporto con 625 microlitri di fenolo mezzi rossi liberi. Aggiungere 62,5 pl di 5 mg / mL tiazolile blu tetrazolio bromuro (MTT) a ciascun pozzetto ed incubare per 4 ore a 37 ° C. Aggiungere 625 pl di 100 mg / mL SDS-0,01M HCl a ciascun pozzetto ed incubare durante la notte. Leggere l'assorbanza a 570 nm e ottenere la vitalità delle cellule% usando l'equazione:
- Gli studi tossicologici. Trasferimento aggregati a 24 pozzetti ed eseguire l'esclusione blu trypan sul ≥ 2 pozzi per la vitalità delle cellule iniziale / concentrazione. Aggiungere al composto di prova che varia concentrazioni nei pozzetti duplicati. Per vitalità cellulare (figura 5A), lavare aggregati ed eseguire trypan blue esclusione dopo il trattamento. Per TC 50 (Figura 5B), prendere la vitalità cellulare dei pozzetti in duplicato per ciascuna concentrazione nel tempo e di utilizzare Reed Muench metodo per determinare la concentrazione tossica 50% 2, 15.
- Mediante citometria a matrice tallone (CBA) o ELISA. Surnatanti cellulari possono essere prese dopo la semina delle cellule in ogni format sperimentale diagramma. Stimolare aggregati semi come con cellule coltivate comemonostrati, raccogliere supernatanti (≥ 120 mL), e conservare a -80 ° C per l'analisi mediante ELISA o CBA (Figura 6).
- Analisi di RNA. Di trasferimento ≥ 500 microlitri di aggregati a 1,5 ml e tubo di lavaggio inerti con DPBS. Continuare l'estrazione utilizzando il kit Qiagen RNAeasy e il protocollo per le cellule animali, con omogeneizzazione del lisato utilizzando 20-gauge. Assicurati di lasciare perle si depositano sul fondo del tubo, prima di trasferire il surnatante, e NON trasferire perle vuote alla colonna di rotazione (perline intasare membrana colonna con conseguente bassa resa RNA) (Figura 7).
- L'analisi delle proteine. Aggregati raccolta sotto gli stessi metodi con monostrati utilizzando un tubo di 1,5 mL o più format sperimentale. Tuttavia, dopo lisi degli aggregati, consentono di regolare le perline e trasferire lisato in un tubo separato prima di eseguire un gel proteina o altra forma di analisi proteica (Figura 8).
- Infezionestudi. aggregati di semi in formato desiderato sperimentali. Utilizzare almeno due pozzetti / campioni per trypsinizing celle da perline per enumerare il numero di cellule e quantificare la vitalità cellulare. Infect aggregati con patogeno di interesse selezionato molteplicità di infezione, effettuata con cellule cresciute in monostrati (Figura 9). Fasi di lavaggio deve essere effettuata come in 6,2.
- Citometria a flusso: aggregati seme in tubo da 50 ml, aggregati di lavaggio (6.2), e aggiungere 2 mM EDTA per 5-10 min a 37 ° C. Aggiungi supporti ml 5-10 cellule e passare le cellule attraverso un colino cella. Aliquote 1x10 6 cellule in una provetta di polipropilene e cellule lavaggio a freddo con soluzione bloccante (1% FBS in PBS). Risospendere le cellule con anticorpi e incubare in base al produttore. Lavare le cellule per centrifugazione, risospendere in PBS, e trasferire le cellule per filtrare provetta per analisi (Figura 10).
7. Risultati rappresentativi
Un esempio diuno differenziato aggregato epiteliale umana coltivate nel sistema di bioreattore STLV può essere visto in Figura 2. Le immagini SEM e TEM vengono raccolti da cellule vaginali umane coltivate in STLV per 39 giorni, in cui microridges, le invaginazioni, vescicole secretorie intracellulari, e microvilli sulla superficie apicale si possono osservare. Ulteriore dimostrazione in vivo caratteristiche simili di cellule epiteliali coltivate nel bioreattore può essere osservato da immagini di microscopia confocale immunofluorescenza (Figura 3) di 3-D cellule esprimenti vaginali mucina (MUC1) e marcatori specifici per le cellule epiteliali (SEC) e differenziazione terminale (involucrina, INV).
Come si vede, 3-D aggregati presentano caratteristiche ultrastrutturali simili ai tessuti, comunque i loro fenotipi più fisiologicamente rilevanti anche servire come una piattaforma eccellente per valutare la tossicità dei composti. Il saggio MTT, un saggio comunemente usato per misurare la vitalità cellulare, metabolismo o proliferazione, può essere usato per misurare la tossicità ai vari prodotti chimici e composti (Figura 4). Triton X-100, un detergente che distrugge le membrane cellulari, è stato utilizzato come controllo positivo per la validazione del saggio MTT. Un ulteriore metodo per misurare la tossicità dopo il trattamento con composti di prova è trypan blue esclusione (Figura 5). Dopo trattamento con il nonoxynol-9 (N-9), gli aggregati vaginali dimostrato una risposta tossicità simile a quella dei modelli espianti cervicali, ma un profilo diverso rispetto a monostrati 2, 16.
Ulteriori studi che dimostrano la capacità delle cellule epiteliali, cresciute nel bioreattore, e segnalare un funzionamento simile a tessuti in vivo, si può osservare in figura 6. Dopo la stimolazione con le molecole derivate da microbi che sono riconosciuti dalle recettori Toll-like (TLR), gli aggregati di rispondere e secernere citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6 1.Espressione del recettore del progesterone (PR), un recettore che risponde alla stimolazione ormonale, può anche essere osservato nelle cellule vaginali sia a RNA e proteine (Figura 7 e 8, rispettivamente). Le 3-D aggregati non solo hanno la capacità di rispondere a molecole patogeni e l'ormone, ma sono anche in grado di supportare funzionalmente un herpes simplex virus di tipo 2 (HSV-2) l'infezione. Un'immagine microscopia confocale di HSV-2 infettate aggregati 3-D vaginale (Figura 9) illustra infezione. Parallele 2-D vaginale colture di cellule epiteliali non sono mostrati in conseguenza della distruzione grave cellulare causata da infezione da HSV-2. RWV di derivati 3-D aggregati sono stati usati per quantificare replicazione batterica e virale attraverso curve di crescita intracellulari e saggi placca, rispettivamente 8, 9. Infine, le proprietà fisiche e funzionali di cellule individuali all'interno degli aggregati possono anche essere quantificato mediante citometria di flusso. Per example, abbiamo impiegato un saggio di citometria a flusso per misurare la MUC1 espressione di superficie su singole cellule vaginali (Figura 10). Vaginali aggregati in 3-D ha espresso una percentuale inferiore di MUC1 (27,7%) rispetto ai monostrati (67,2%). La percentuale inferiore di MUC1 sul 3-D superficie aggregati rispetto a monostrati può essere un risultato della maggioranza di MUC1 essere secreto dalle cellule come osservato nella vaginale tratto 17, 18.
Figura 1. Schema coltura per le cellule epiteliali umane in RWV e le potenziali applicazioni utilizzando RWV derivati aggregati. A) cellule epiteliali vengono inizialmente coltivate come monostrati in un pallone da coltura tissutale. Una volta confluenti, le cellule vengono rimosse dal pallone e combinati con perline microveicolo nel bioreattore STLV. Bar Scala:. Um 80 B) Il STLV ruota su una piattaforma per creare un ambiente costante caduta libera di f bassaLUID taglio, permettendo alle cellule per collegare e crescere su perline formando così visibili aggregati cellulari. C) Dopo 96 h, i media nel STLV deve essere modificato per accogliere per il metabolismo cellulare. Il supporto viene versato su una porta laterale, mezzi freschi è sostituito collegando una siringa da 10 ml (stantuffo rimosse), e stantuffi siringa vengono sostituiti e utilizzati per estrudere bolle. D) dopo ~ 5 giorni (d) gli aggregati cominciano a formarsi . Gli aggregati sono campionati ogni 7 giorni e ripreso al microscopio ottico per monitorare la loro progressione evolutiva (20x in 3-D cellule epiteliali vaginali). E) Una volta completata la formazione di aggregati e la differenziazione cellulare si è verificato, gli aggregati vengono raccolte dal bioreattore e trasferiti in una provetta da 50 ml. F) Gli aggregati possono essere seminate in un tubo di 1,5 ml o un multi-formato di piastra e di effettuare analisi sperimentale e saggi. G) Schema di pote ntial saggi e analisi che possono essere condotti sugli aggregati. Questo elenco rappresentativo di analisi non vuole essere un catalogo esauriente di tutte le potenziali applicazioni a valle.
Figura 2. Esaminando caratteristiche morfologiche e strutturali di 3-D aggregati di cellule epiteliali tramite microscopia elettronica. (A) microscopio elettronico a scansione (SEM) di una 3-D aggregato cellule epiteliali umane vaginale. Barre di scala: 200 micron (100X), 100 micron (200x), 50 micron (500x). Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) immagine di un 3-D di aggregazione umana delle cellule epiteliali della vagina con frecce che puntano a (B) vescicole secretorie intracellulari e microvilli o (c) "processi citoplasmatici". Barre di scala: 2 pm (modificato da Hjelm et al 2010). 2.
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Figura 3. Microscopia confocale immunofluorescenza usato per identificare e differenziazione giunzionale marcatori proteici in 3-D aggregati di cellule epiteliali. Cellule umane 3-D vaginali raccolte dal bioreattore dopo 32 giorni, fissi, e colorate con (A) anticorpo mucina MUC1, (B) anticorpo specifico per cellule epiteliali, l'ESA, o (C) anti-involucrina (INV) anticorpo che riconosce cellule epiteliali differenziate. Aggregati sono state indirettamente etichettati con Alexa 488 anticorpo secondario (verde). Barra della scala: 60 pm (modificato da Hjelm et al 2010). 2.
Figura 4. Saggio MTT viene utilizzato per misurare la vitalità cellulare. Umani aggregati 3-D vaginali sono state seminate in una piastra a 24 pozzetti e trattati con mezzi sola (non trattata) o 0,01%, 0,1% o 1,0% Triton X-100 detergente per 1 ora a 37 ° C. Followin g trattamento, mezzo è stato rimosso e il saggio MTT è stato eseguito per misurare la vitalità cellulare. Rappresenta ** p <0,001; una coda di Student t-test confrontando Triton X-100 cellule trattate al controllo non trattato.
Figura 5. Utilizzando 3-D aggregati di cellule epiteliali di tossicità schermo composto. (A) Nonoxynol-9 (N-9) curva dose-dipendente redditività 24 h post-trattamento di 3-D umano modello vaginale cellule epiteliali (linea rossa / bar) rispetto stesso tipo di cellula coltivati come monostrati confluenti (linea nera / bar). (B) N-9 TC 50 livelli di vaginale colture cellulari epiteliali (A) a 1,5 h, 4 h, 8 h, e 24 h dopo il trattamento. * Rappresenta p <0,05; una coda di Student t-test di confronto monostrati di cellule 3-D in ogni tempo di esposizione. (Modificato da Hjelm et al. 2010) 2.
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Figura 6. Analisi della produzione di citochine in cellule epiteliali 3-D in risposta a toll-like receptor (TLR) la stimolazione agonista. Cellule umane Three-D vaginali sono state stimolate con FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , e CL097 (TLR7 / 8) per 24 ore e citochine secrete sono stati misurati mediante citometria a matrice tallone. IL-6 viene mostrato come una citochina proinfiammatoria rappresentante prodotta e misurata. * Rappresenta p <0,05; una coda di Student t-test di confronto campioni stimolati a PBS gruppo. (Modificato da Hjelm et al. 2010) 2.
Figura 7. Monitoraggio espressione genica in cellule epiteliali 3-D. Semi-quantitativa RT-PCR del recettore del progesterone (PR) espressione in monostrato (ML) o 3-D cellule dell'epitelio vaginale. GAPDH viene mostrato come un controllo del carico. Prodotti di amplificazionemostrato sono il risultato di un'espressione verbale che si verifica dopo 30 cicli di PCR. Arrow teste punto di bande di PR che si verificano solo in 3-D del campione.
Figura 8. Analisi di espressione delle proteine di 3-D cellule epiteliali. Analisi Western blot di monostrato e 3-D umani dell'epitelio vaginale lisati cellulari di cellule intere (30 mg) sondati con un anti-recettore del progesterone (PR) anticorpo. β-tubulina è stato usato come sonda per controllare il caricamento.
Figura 9. Three-D modello umano cellule epiteliali supporta una infezione produttiva virale. Microscopia confocale immagine immunofluorescenza di 3-D umano aggregato vaginale cellule epiteliali infettati con HSV-2. Le cellule sono state infettate ad una MOI di 1,0 per due ore, lavato, fisso 24 ore dall'infezione (4% PFA) e colorate con HSV-2 specifica VP5 capsid anticorpo (verde) e il nucleare macchia DAPI (blu). Scale bar: 50 micron.
Figura 10. Cella di analisi individuale in 3-D modello umano cellule epiteliali mediante citometria a flusso. (A) monostrato o (B) 3-D umani aggregati dell'epitelio vaginale sono state dissociate con EDTA, marcato con un anticorpo MUC1 coniugato con FITC (blu), un controllo isotipo (verde), o PBS (rosso), e l'espressione FITC è stata quantificata citometria a flusso. I numeri rappresentano la percentuale di cellule colorate positivamente per anticorpo mucina che rimanevano dopo Soppressione fluorescenza di fondo dalle cellule di controllo dell'isotipo macchiati. Non uniformi picchi sono il risultato della moltitudine di modelli glycosolation e vari livelli di MUC1 sulla superficie di queste cellule.
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Discussion
L'utilizzo della tecnologia bioreattore RWV qui presentato può fornire ai ricercatori la possibilità di avanzare la loro attuale sistema di coltura cellulare per un modello più fisiologicamente rilevanti organotipica coltura cellulare. Il sistema di bioreattore RWV coltura cellulare fornisce un microambiente shear a bassa che permette alle cellule di formare aggregati cellulari 3-D in vivo, con caratteristiche simili, comprese le giunzioni strette, la produzione di mucina, processi extracellulari (es. microvilli) e polarità cellulare. La maggior parte dei dati e gli esempi presentati qui usi vaginale cellule epiteliali coltivate nel sistema RWV, tuttavia il sistema RWV è stato usato anche per altri tipi di coltura di cellule epiteliali tra intestino tenue e crasso, polmone, della vescica, del fegato, e le cellule epiteliali tonsille per formare modelli organotipiche 3-D 1, 7-13, 18. Inoltre, questo sistema è stato utilizzato per tipi cellulari diversi coltura delle cellule epiteliali, e attualmente il complesso di sviluppo, pluricellulariextracellulari modelli di coltura organotipiche sono in corso 2, 18.
I protocolli qui descritto sono destinati a servire da guida, e può essere necessario modificare in base al tipo di cellula di interesse. I più comuni modifiche al protocollo per coltura di cellule epiteliali del sistema RWV includono la lunghezza di tempo vengono coltivate le cellule nella STLV, decisione e tempi di trasferimento aggregato dal STLV al Harv, e il rapporto cellulare / tallone per il primo semina in STLV. Una modifica più specializzata che può essere considerata di successo per la formazione di aggregati sono le proprietà del tallone microveicolo o impalcatura, come superficie, diametro, forma, rivestimenti superficiali, densità, di carica, materiale del nucleo, e porosità. Inoltre, adattamenti al mezzo di coltura di base, formulazione, o integratori, può essere necessario ottimizzare le condizioni di coltura e massimizzare la formazione di aggregati. Le regolazioni possono essere apportate al sistema di bioreattore e dei suoi componenti, inche comprende la dimensione della nave bioreattore e la velocità di rotazione. Per una migliore valutazione del microambiente all'interno del bioreattore, un sistema di coltura perfuso è anche disponibile che consente il monitoraggio continuo dei livelli di pH, ossigeno e glucosio all'interno del recipiente di coltura assicurare un ambiente prolifico per formazione di aggregati. Il tempo potenzialmente lungo per ottimizzare le condizioni di coltura, la formazione di aggregati, la differenziazione cellulare e per caratterizzare ogni nuovo sistema modello, così come il costo iniziale del sistema di bioreattore, sono notevoli svantaggi di questo sistema. Tuttavia, un sistema di coltura nuovo implementato in un laboratorio avrà inconvenienti simili.
Noi e altri hanno mostrato che RWV derivate da modelli che utilizzano cellule umane possono essere un valido strumento per predire la, la tossicità e la farmacocinetica efficacia dei vaccini, microbicidi, prodotti biologici e farmaceutici, in un modo che è rilevante per l'uomo 1, 2, 18. Con il successo di maggioè la cultura del sistema bioreattore per produrre autentiche risposte umane, combinata con la sua flessibilità, le applicazioni del sistema di bioreattore RWV è attualmente in fase di espansione in settori quali la modellistica del tumore, la medicina rigenerativa e ingegneria dei tessuti 2, 18-23. Per far avanzare i nostri modelli della mucosa RWV generati stiamo lavorando per creare un sistema più complesso multicellulare che replica sia la struttura e la funzione del tessuto umano della mucosa. Tuttavia, gli autori riconoscono che potrebbe essere necessario utilizzare o integrare diversi sistemi modello per riprodurre le complesse interazioni che i farmaci o vaccini umani hanno con sistemi fisiologici. Nel complesso, il nostro obiettivo di utilizzare il bioreattore RWV e le sue applicazioni sperimentali è quello di comprendere meglio la biologia del tessuto delle mucose e le risposte cellulari agli insulti ambientali in modelli umani organotipiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Brooke Hjelm per la sua competenza tecnica e Andrew Larsen per la sua analisi delle proteine. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Development Alternatives Research Foundation (MMHK) Grant e il NIH NIAID infezioni sessualmente trasmesse e microbicidi topici Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Riconosciamo con gratitudine Biology of Reproduction per il riutilizzo dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
