Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kültüre ve Duvar Gemi Biyoreaktör Döner Uygulamaları 3D Epitel Hücre Modelleri Türetilmiş

Published: April 3, 2012 doi: 10.3791/3868
Automatic Translation
1, 1
1Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine - Phoenix

Summary

Epitel hücreleri 3-D hücre toplam oluşumu ile sonuçlanarak, fizyolojik koşullar altında büyüyebilir olanak sağlayan bir döner hücre kültürü sistemi tarif edilmektedir. Agregalar ekran üretilen

Abstract

Hücreler ve beden deneyim kendi mimari etkileyen çevre koşulları, hücreler arası iletişim, ve genel fonksiyonları doku. In vitro hücre kültür modelleri doğru ilgi doku taklit etmek için, kültürün büyüme ortamı göz önünde kritik bir yönüdür. Yaygın olarak kullanılan geleneksel bir hücre kültüründe düz (2-D) iki boyutlu bir geçirimsiz yüzeyler üzerinde epitel hücreler yayar. Çok konvansiyonel sistemlerin hücre kültürü öğrenilebilir olmasına rağmen, birçok bulgular, potansiyel olarak, fizyolojik olarak ilgili mikro eksikliği bir sonucu olarak, insan klinik denemeler ya da doku eksplantlarında tekrarlanabilir değildir.

Burada, yenilikçi döner duvar damar (RWV) çoğaltıldığı teknolojiyi kullanarak, 2-B hücre kültürlerinin kültür durumu sınırları çok aşan bir kültür sistemi tanımlar. Biz ve diğerleri organotipik RWV kaynaklı modeller structur recapitulate göstermiştire, fonksiyon ve benzer insan eksplant dokuları 1-6, dış uyaranlara otantik insan yanıtları. RWV biyoreaktör düşük fizyolojik koşullar altında sıvı kayma epitel hücre büyümesi için izin veren bir süspansiyon kültürü sistemidir. Biyoreaktörler iki farklı formatta, yüksek boy dönen damar (HARV) veya onların havalandırma kaynağına göre farklılık gösteren bir yavaş dönüm yanal damar (STLV) gelir. Epitel hücreleri gözenekli, kolajen-kaplı boncukların microcarrier (Şekil 1A) ile kombinasyon halinde tercih biyoreaktör eklenir. Hücreler biyoreaktör içinde sürekli serbest düşme (Şekil 1B) sırasında bir büyüme iskelesi olarak boncuk kullanıyoruz. Biyoreaktör tarafından sağlanan mikro hücrelerinin çoğu zaman, standart 2-D kültürü koşulları (Şekil 1B) altında gözlenmez vivo benzeri özellikleri gösteren (3-D) üç boyutlu bir agregatlar oluşturması için olanak sağlar. Bu özellikler sıkı kavşaklar, muc dahilin vivo protein lokalizasyonu, ve ek epitel hücre türüne özgü özelliklerini bize üretim, bazal / apikal yönlendirme,.

Tamamen farklılaşmış 3-D agrega için epitel hücrelerinin bir tek tabaka gelen ilerleme hücre tipi 1, 7-13 göre değişir. Biyoreaktör gelen Periyodik örnekleme epitel agregat oluşumunu, hücresel farklılaşma işaretleri ve canlılık (Şekil 1D) izlenmesine olanak sağlar. Bir kez hücre farklılaşması ve toplam oluşumu kurulduğunda, hücreler hasat biyoreaktör, ve benzer deneyler 2-D hücreleri üzerinde gerçekleştirilen bir kaç hususlar (Şekil 1E-G) ile 3-D agregalar uygulanabilir edilir. Bu çalışmada, biz nasıl kültür RWV biyoreaktör sisteminde 3-D epitel hücre agrega ve 3-D agrega ile yürütülebilecek bu potansiyeli testleri ve analizleri çeşitli. Ayrıntılı adımlar tarif Bu analizler, bunlarla m / yapısal, bunlarla sınırlı değildirorphological analizi (konfokal, tarama ve transmisyon elektron mikroskobu), sitokin / kemokin sekresyon ve hücre sinyal (sitometrik boncuk dizisi ve Western blot analizi), gen ekspresyon analizi (real-time PCR), ilaç / toksikolojik analiz ve konak-patojen. Bu testlerin kullanımı gibi metabolomik, transkriptomik, proteomik ve diğer dizi tabanlı uygulamalar gibi daha derin ve geniş çalışmalar için temel ayarlayın. Amacımız çeşitli bilimsel çıkarları ile araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere, basit bir ve sağlam bir sistem, in vivo doku insan recapitulate organotipik 3-D modeller üretmek için kültür, insan epitel hücrelerinin bir konvansiyonel olmayan yollarla sunmaktır.

Protocol

Tüm adımlar Laminar akış kaputu BSL-2 şartlarda yapılmalıdır.

1. STLV Biyoreaktör hazırlanması

  1. Üretici protokolüne göre STLV biyoreaktör kurma ve biyoreaktör sterilite sağlamak için detoksifikasyon protokolü gerçekleştirin. Luer kapaklar ile açık portları kapsar ve 24 saat süreyle% 95 etanol ile STLV doldurun.
  2. Etanol çıkarın ve 24 saat için steril saf su ile STLV doldurun.
  3. Sadece steril distile su ile 1.2 adımı yineleyin.
  4. Satıcı tarafından sağlanan araç ile, bir sterilizasyon kese içinde 20 dakika süreyle 110 ° C'de tüm vidaları, kapaklar ve merkezi fiş STLV gelen ve otoklav gevşetin.
  5. STLV soğutulur sonra sıkın ve sterilite ve tam detoksifikasyon sağlamak için gerekli adımları 1,1-1,4 tekrarlayın.
  6. Her bir port için önceden sterilize edilmiş tek yönlü stopcocks üzerine STLV ve vida soğutmalı vidalarını sıkın.
  7. Dikey topuzlar konumlandırarak Açık musluk.
  8. Geri sarma sterilite korumak için 10 ml ve 5 ml Luer-lock şırınga ve yeniden kol itici gelen pistonları çıkarın. Stopcocks üzerine şırınga (Luer-lock şırınga ucu bu adım için gereklidir) vidalayın.
  9. Dulbecco ekleme fosfat-tamponlu salin (DPBS) 10 mL şırıngaya STLV dolu olduğunda ve 5 ml doldurmak için şırınga başlayana kadar.
  10. Her enjektörün içine steril Plenserleri değiştirin ve şırınga pistonları sürüş arasında değişen tarafından biyoreaktör meydana gelen kalıntı kabarcıklarını çıkarmak.
  11. Tüm kabarcıklar çıkardıktan sonra biyoreaktör bağlı şırınga bırakın. Kapat stopcocks ve dönen dikey platformuna STLV takın ve sızıntı olup olmadığını izlemek için 24 saat en az döndürün.

2. Microcarrier Boncuk hazırlanması

  1. STLV (1,4) ile aynı koşullar altında bir 50 mL konik bir boru ve otoklavda ~ 250 mg Cytodex microcarrier boncuklara 15 mL DPBS ekleyin.
  2. Soğuduktan sonra, DPBS kaldırmak epitheli büyümek için kullanılan medya ekleyinal ilgi hücre ve girdap tüp boncuk yeniden süspanse etmek.
  3. Medya iki kez yıkayın adımları tekrarlayın. Son yıkama boncuk, 15 ml büyüme ortamı ekledikten sonra.

3. STLV Biyoreaktör içine Hücrelerine ve Boncuk tohumlama

  1. Eğer ≥ 1x10 7 hücre elde edene kadar doku kültürü şişelerinde monotabaka gibi ilgi epitel hücreleri büyümek. Balonun (yani trypinsization, EDTA) hücreleri çıkarın, hücresel konsantrasyonu kurmak hücreleri saymak ve trypan mavisiyle boyama boyama 1 hücresel canlılığı belirler.
  2. Hazırlanan boncuk (2.3) içeren konik tüp için, niyet sizin epitel hücre tipi (Şekil 1A) bağlı olarak, hücre istenen konsantrasyon (2x10 5-1x10 7 epitel hücreleri) 2, 8 ekleyin. Tüm hücreler konik tüp durulayarak transfer olduğundan emin olun.
  3. STLV gelen DPBS ve şırıngalar çıkarın.
  4. Merkezi liman prizden çıkarın ve epitel c ekleyinell / 10 ml serolojik pipet kullanarak STLV içine boncuk süspansiyonu. Tüm hücreler / boncuk STLV aktarılır sağlamak ve merkezi liman fiş yerine konik tüp durulayın.
  5. Sterilite korumak için geri sarma bir 5 ve 10 ml şırınga ve yeniden kol itici gelen pistonları çıkarın. Açık stopcocks ile liman içine şırınga vidalayın. Pistonları, ve yakın stopcocks yerine, medya ile STLV doldurun.
  6. Herhangi bir döndürme ile 30 dk için bir 37 ° C inkübatörde yeni ekildi STLV yerleştirin.
  7. Açık stopcocks, pistonları kullanarak kabarcıkları kaldırmak ve daha sonra yakın stopcocks.
  8. 20 rpm (Şekil 1B) bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş dönen STLV yerleştirin. Kültürler örnekleme, değişen medya, ya da hasat agrega (sonraki bölüme bakın) dışında 24 ha gün sürekli döndürülmüş olmalıdır.

4. Kültürler ekimi ise, Örnekleme ve Foto Dokümantasyon

  1. Bi içinde kültürlenmesi hücrelerin bir başlangıç ​​96-120 saat sonraeğerek STLV ve hücre / boncuk yerleşmek için izin vererek oreactor, değişim medya. , Şırıngalar çıkarın hem stopcocks açın ve yan port (Şekil 1C) ortamların ~ 75% off dökün. Medya hücresel metabolizma dayanarak, medya ilk tohumlama ve 96-120 saat kültürü süre sonra her gün veya günaşırı değiştirin.
  2. 5 ve pistonu 10 ml şırınga geçersiz vidalayın ve yukarıda açıklandığı gibi doyurulmanın protokolü (1,7-1,11) izleyin, sonra vidalı bir platform üzerinde dönen STLV yerine geri kapattı.
  3. Her 5-7 günde iki dikkatle 1.5 mL tüpler içine merkezinde bağlantı noktasından agregatların küçük bir miktarda (~ 200 uL) çıkarılması ile STLV ekiyoruz sonra agregatların büyümesi ve canlılığı izleyebilir. Toplam kesme önlemek için, tüm toplu transferler için noktadan ~ 2 cm kesilmiş ve sterilize edilmiştir 1000 uL pipet kullanın.
  4. , Merkezi fiş, yeni şırınga ile döviz değiştirin yukarıda açıklandığı gibi STLV (1,7-1,11) taze medya ekleyin ve STLV geri yerleştirmekrotasyon ile inkübatör (3.8).
  5. Hücresel canlılığı izlenmesi için, adım 4.3 'bölünüp iki adet 1.5 ml tüp agregaların birini kullanın ve epitel hücrelerinin doku kültürü şişeleri (yani tripsinizasyon) kaldırılır aynı şekilde boncuklar hücreleri çıkarmak. 1 boyama tripan blue exclusion canlılığı izleyin.
  6. Görüntüleme hücresel agrega için, ikinci bir 1.5 mL toplam tablet ve bir cut-off 1000 uL pipet kullanarak küçük bir petri transfer için medyanın 0,5-1 ml ekleyin. Bir ters ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü agrega (Şekil 1D).

5.. Agrega aktarma ve Hasat

  1. Bazı epitel hücre kültürü modeli için bir havalandırma 2 arttırmak için, bir tek HARV için agregalar aktarmak için gereklidir. Yaklaşık önceden analiz için agrega hasat bir hafta, STLV gelen şırıngalar ve stopcocks kaldırmak ve yan limanından medya ~ 50% off dökün.
  2. RemSTLV merkezi fiş ove ve dikkatli merkezi liman (Şekil 1E) bir 50 mL konik tüp içine tüm içeriğini dökün. 5 ml medya ile STLV iki kez durulayın ve agrega geri kalanı ile yıkayın birleştirir.
  3. 5.2 'de tarif edildiği gibi agregalar aktarılması ile devam eder, ancak 50 mL konik bir tüpten HARV transfer agregalar.
  4. Gibi ~ 1 hafta sonra ya STLV gelen HARV dikkatle hasat agregalar (hücre türüne göre) (5,2) yukarıda yapıldı. Toplam hasat sonrası potansiyel test biçimleri, yazı ve analiz için aşağıya bakın.

6. Agrega ile yürütülen Potansiyel Analizi, Uygulamaları ve Tahliller

  1. Çeşitli deneysel formatları için tohumlama toplar. 1.5 ml tüp, 24 de plaka veya sterilize kesme 1000 uL pipet ucu (Şekil 1F) kullanarak 96 plaka için 50 ml konik tüp agrega istenilen miktarda aktarın.
  2. Yıkama ve hazırlanmışanalizi için agrega ing. Agrega yapıldıktan sonra ortamı çıkarın. Tüp merkezine doğrudan DPBS dağıtın ya da bu nedenle tüm agrega kadar karıştırılır. Bir kez agrega altına yerleşmiş, DPBS kaldırmak ve gerektiğinde birçok kez tekrarlayın.
  3. Off-site deney ve analiz için Kargo toplar. 50 ml tüp için agrega istenilen miktar ekleyin ve 6.2 olarak agrega yıkayın. Tamamen kaçağı önlemek için kapağı etrafında medya, kap ve parafilm ile 50 ml tüp doldurun. Güvenli bir şekilde ortam sıcaklığında gece boyunca istenilen konuma agregalar gönderir.
  4. Elektron mikroskobu için bağlantı agrega (Şekil 2). Tarama, iletim veya immüno-elektron mikroskobu, bir 1.5 ml tüp 150-300 uL agrega aktarma ve DPBS (6.2) ile agrega 3 kez yıkanarak yapılabilir. İstenen kuluçka dönemi için uygulamaya özgü (SEM, TEM, immüno-EM, vb) elektron mikroskobu sabitleştirici 200 uL ekleyin. Kaldır aggregat yıkayın, düzeltmekes 2 DPBS ile kat ve ilerlerken Hjelm ark özetlenen. 2010 tarama ve transmisyon elektron mikroskobu 2 için.
  5. İmmünofloresan mikroskobu görüntüleme (Şekil 3). Transferi ~ 1.5 mL tüp ve yıkama agrega (6.2) 100 mcL agrega. 1.5 ml tüp hariç, tek katmanlarda olduğu gibi benzer koşullar altında Fix ve antikor etiket agrega. , Monte mikroskop lamı üzerine yarığına 1 damla yerleştirmek için, bir kesme agrega 1000 uL pipet, yer coverslip, tırnak cilası ile mühür coverslip ve gece kuru slayt 2 yarığına üstüne etiketli agrega aktarın.
  6. Hücresel canlılığı / MTT (Şekil 4) kullanılarak proliferasyon ölçülmesi. 24 de plaka Transfer agrega ve 625 uL fenol kırmızısı özgür medya ile medya değiştirin. Her oyuğa 5 mg / mL Tiazolil Blue Tetrazolium bromür (MTT) 62.5 uL ekleyin ve 37 de 4 saat süre ile inkübe edilir ° C. 100 mg / mL SDS-625 uL, 0.01 eklemeM, her kuyuya HCl ve gece inkübe edin. 570 nm 'okuyun ve denklem kullanılarak% hücre canlılığı edinin:

Denklem 1

  1. Toksikoloji çalışmaları. 24 de plaka agrega aktarın ve ilk hücre canlılığı / konsantrasyon ≥ 2 kuyular tripan mavi dışlama gerçekleştirin. Kuyu çoğaltmak için konsantrasyonları arasında değişen test bileşiği ekleyin. Hücre canlılığı için (Şekil 5A), agrega yıkayın ve tedavi sonrası tripan mavi dışlama gerçekleştirin. TC 50 için (Şekil 5B), zaman içinde her bir konsantrasyon için yinelenen kuyuların hücresel canlılığı alır ve toksik konsantrasyonu% 50 2, 15 belirlemek için Reed Muench yöntemini kullanın.
  2. Sitometrik boncuk dizisi (CBA) veya ELISA. Hücresel süpernatantlar diyagramlanabilmiştir herhangi bir deneysel formatında hücreleri tohumlama sonra alınabilir. Olarak yetiştirilen hücreler gibi seribaşı agrega Canlandıracakmonotabaka, ELISA veya CBA (Şekil 6) tarafından analiz için -80 ° C'de süpernatantlar (≥ 120 uL), ve mağaza toplamak.
  3. RNA analiz. 1.5 mL tüp ve DPBS ile yıkama agrega için agrega ≥ 500 uL aktarın. 20 gauge iğne ile lizat homojenizasyon ile hayvan hücreleri için Qiagen RNAeasy kiti ve protokol kullanılarak ekstraksiyon devam edin. Boncuk önce Süpernatant aktarılması için, tüpün dibe çöktüğünden ve spin kolon (boncuk düşük RNA verim elde sütun membran yapışmasına neden olur) (Şekil 7) boş boncuk aktarmak ETMEYİN izin emin olun.
  4. Protein analizleri. 1.5 ml tüp ya da daha büyük deneysel biçimini kullanarak monotabaka ile aynı yöntemleri altında Hasat agrega. Ancak, agrega Parçalama işleminden sonra, boncuklar bir protein jel veya protein analizi diğer formu (Şekil 8) çalıştırmadan önce ayrı bir tüpe lizat yerleşmek ve aktarılmasına olanak tanıyor.
  5. Enfeksiyonçalışmaları. istenilen deneysel formatına Tohum agrega. Hücre sayısı numaralandırmak ve hücre canlılığı ölçmek için boncuk hücrelerin tripsinize için en az iki kuyu / örnekleri kullanın. Mono tabakaları (Şekil 9) olarak yetiştirilen hücreler ile yapılan gibi enfeksiyon seçilen çokluğu da ilgi patojen ile agrega bulaştırmak. Yıkama adımları 6,2 olarak gerçekleştirilmesi gerekir.
  6. Flow sitometri: 50 ml tüp, yıkama agrega (6.2) ve 37 5-10 dakika 2mm EDTA ekle ° C. Tohum agrega Hücrelere 5-10 ml medya ekleyin ve bir hücre süzgecinden hücreleri geçmektedir. Soğuk çözelti bloke edici bir polipropilen tüpü ve yıkama hücrelerine alikotu 1x10 6 hücreleri (% 1 PBS içinde FBS). Antikor ve üreticiye göre inkübe hücreleri yeniden süspanse edin. Analizi (Şekil 10) için tüp filtre PBS ile tekrar süspansiyon santrifüj hücre ve hücre transferi yıkayın.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Bir örneğiSTLV biyoreaktör sistemi yetiştirilen farklılaşmış bir insan epitel toplam Şekil 2'de görülebilir. SEM ve TEM görüntüleri microridges, invajinasyonları, hücre içi sekretuar veziküller ve apikal yüzeyinde mikrovilluslar görülebilir 39 gün STLV yetiştirilen insan vajinal hücreler toplanır. Biyoreaktör yetiştirilen epitel hücrelerinin in vivo benzeri özellikleri daha da gösteri müsin (MUC1) ifade 3-D vajinal hücrelerin konfokal immünfloresan mikroskopi görüntüleri (Şekil 3) ve epitel hücreleri için spesifik marker (ESA) ve terminal farklılaşma tarafından görülebilir (involukrin; INV).

Görüldüğü gibi, 3-D agregalar, daha fizyolojik ilgili fenotipleri de bileşiklerin toksisite değerlendirilmesi için mükemmel bir platform olarak hizmet Ancak, dokulara benzer ultrastrüktürel özelliklerini göstermektedirler. MTT yöntemi, hücre canlılığı, metabolizma veya proliferasyonu ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir testTION, çeşitli kimyasal bileşikler ve (Şekil 4) toksisite ölçmek için kullanılabilir. Triton X-100, hücre zarının yok eden bir deterjan MTT doğrulanması için, bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Test bileşikleri ile tedaviyi takiben toksisite ölçmek için bir başka yöntemde tripan mavisiyle çıkarma (Şekil 5) 'dir. Nonoxynol-9 (N-9) ile tedaviyi takiben, vajinal agregalar servikal eksplant modelleri ile benzer bir toksisite tepki gösterdiği, fakat farklı bir profil mono tabakalar 2, 16 ile karşılaştırıldığında.

In vivo dokulara işlev ve benzer şekilde sinyallemek için biyoreaktör yetiştirilen epitel hücreleri yeteneği, göstermektedir ek çalışmalar, Şekil 6'da görülebilir. Toll benzeri reseptörler (TLR) tarafından tanınan mikroplardan elde edilen molekülleri ile uyarılması üzerine, agrega cevap ve IL-6 1 de dahil olmak üzere pro-inflamatuvar, salgılarlar.Progesteron reseptörü (PR), hormon stimülasyonu yanıt veren bir reseptörü, bir salgılama ayrıca her iki RNA ve protein seviyeleri (Şekil 7, Şekil 8, sırasıyla) azından vajinal hücrelerinde görülebilir. 3-D agrega sadece patojen ve hormon molekülleri yanıt yeteneğine sahip, ama aynı zamanda işlevsel bir herpes virüsü tip 2 (HSV-2) simpleks enfeksiyonu desteklemek mümkün değildir. HSV-2 enfekte 3-D vajinal agrega (Şekil 9) A konfokal mikroskopi görüntü enfeksiyonu gösterir. Paralel 2-D vajinal epitel hücre kültürleri HSV-2 enfeksiyonunun yol açtığı ağır hücresel tahribat bir sonucu olarak gösterilmemiştir. RWV kaynaklı 3-D toplamları da sırasıyla, hücre içi büyüme eğrileri ve plak deneyleri ile 8, 9 bakteriyel ve viral replikasyon ölçmek için kullanılmaktadır. Son olarak, agrega içindeki bireysel hücrelerin fiziksel ve fonksiyonel özellikleri de flow sitometri ile ölçülebilir. Examp içinle, bireysel vajinal hücreler (Şekil 10) MUC1 yüzey ekspresyonu ölçmek için bir akım sitometri testi kullanılmıştır. Vajinal 3-D agrega monotabaka (% 67.2) ile karşılaştırıldığında MUC1 daha düşük bir yüzdesi (% 27.7) dile getirdi. Mono tabakalara göre 3-D agregalar yüzeyinde MUC1 daha düşük oranda vajinal yolu 17, 18 görüldüğü gibi, hücrelerden salgılanan edilen MUC1 çoğunluğu bir sonucu olabilir.

Şekil 1
Şekil 1.. RWV kökenli agregalar kullanılarak kültür RWV insan epitel hücreleri ve potansiyel uygulamaları için şematik. A) Epitel hücreleri başlangıçta bir doku kültür şişelerinde monotabaka olarak yetiştirilir. Bir kez birleşmiş, hücre şişesi kaldırılır ve STLV biyoreaktör içinde microcarrier boncuklar ile birleştirilir. Ölçek çubuğu:. 80 mikron B) STLV düşük f sabit bir serbest düşüş ortamı yaratmak için bir platform üzerinde döndüğündenhücreleri STLV içinde, 96 saat sonra) böylece görünür hücresel agrega. C oluşturan boncuklar üzerinde medya takın ve büyümesine izin verir luid kesme, hücresel metabolizma için yerleştirmek için değiştirilmesi gerekir. Ortam bir yan port dışarı boşaltılır, taze ortam ekli bir 10 mL şırınganın (piston kaldırılır) ile değiştirilir, ve şırınga pistonunu değiştirilir ve a'ya kabarcıkları için kullanılır. GE) ~ 5 gün sonra (d) agregatlar oluşturması için başlar . Agregalar 7 gün her örneklenen ve tamamlandığında toplam oluşumu ve hücresel farklılaşma meydana gelmiştir gelişim ilerlemesi (3-D insan epitel vajinal hücrelerin 20x büyütme). E) izlemek için ışık mikroskobu ile görüntülenmiş olan, agrega ve biyoreaktör harmanlamadır Pote bir 50 ml konik tüp içine aktarılır. F) Büyüklükleri 1.5 ml tüp veya deneysel analiz ve testleri yürütmek için çok iyi plaka formatı içine ekilmiş olabilir. G) Anahat agregalar üzerinde yapılan edilebilir ntial testleri ve analizleri. Analizlerin Bu temsilci listesi tüm potansiyel aşağı uygulamaların kapsamlı bir katalog olarak hazırlanmamıştır.

Şekil 2
Şekil 2. Elektron mikroskopi kullanılarak 3-D epitel hücre agrega morfolojik ve yapısal özelliklerinin incelenmesi. (A) elektron mikroskobu (SEM) bir 3-D insan epitel hücreli vajinal agrega görüntü tarama. Ölçek çubukları: 200 mikron (100x), 100 mikron (200x), 50 mikron (500x). Ok (B) intrasellüler sekretuar veziküller ve mikrovilluslar veya (C) "sitoplazmik süreçleri" işaret eden bir 3-D insan epitel hücreli vajinal agrega transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntü. Ölçek çubukları: 2 mikron (Hjelm ark modifiye 2010.) 2.

g3.jpg "/>
Şekil 3. Konfokal immünfloresan mikroskopi 3-D epitel hücre agregalarda kavşak farklılaşma ve protein belirteçleri tanımlamak için kullanılır. (A) müsin antikor MUC1 ile sabit ve lekeli 32 gün sonra biyoreaktör hasat İnsan 3-D vajinal hücreler, özel (B) antikor epitel hücreler, ESA, ya da terminal farklılaşmış epitel hücreleri tanır (C), anti-involukrin (INV) antikoru. Agregalar dolaylı Alexa 488 sekonder antikor (yeşil) ile işaretlendi. Ölçek çubuğu: 60 mikron (Hjelm ark modifiye 2010.) 2.

Şekil 4
Şekil 4. MTT hücre canlılığı ölçmek için kullanılır. İnsan 3-D vajinal agregalar bir 24 kuyulu plakanın tohumlanmış ve 37 azından tek başına ortam (tedavi edilmemiş) ya da% 0.01,% 0.1 veya 1.0% 1 saat için Triton X-100 deterjan ile muamele edildi ° C. Followin g tedavisi, ortam çıkarıldı ve MTT hücre canlılığı ölçmek için gerçekleştirildi. ** P <0.001 temsil eder; tek kuyruklu Öğrenci t testi tedavi edilmemiş kontrol etmek Triton X-100 hücreleri muamele karşılaştırarak.

Şekil 5,
Şekil 5. Ekran bileşik toksisitesine 3-D epitel hücre agrega kullanılması. (A) Nonoxynol-9 (N-9) doza bağımlı canlılık eğrisi 24 saat 3-Ge insan vajinal epitel hücre modeli (kırmızı çizgi / bar) tedavi sonrası ile karşılaştırıldığında Aynı hücre tipi konfluent mono tabakalar (siyah hattı / çubuklar) ve yetiştirilir. (B) N-9 TC (A) 'da 1.5 saat, 4 H, 8 saat ve 24 saat sonrası tedavisinde vajinal epitel hücre kültürlerinin 50 seviyeleri. * P <0.05 temsil eder; tek kuyruklu Student t-testi her poz anda 3-D hücreleri monotabaka karşılaştırarak. (Hjelm ark Modifiye. 2010) 2.

/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
6 Şekil. Toll-benzeri reseptör (TLR) agonist uyarılara yanıt olarak 3-D epitel hücrelerinde sitokin üretiminin analizi. Üç-Ge insan vajinal hücreler FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), BAYRAK (TLR5) ile uyarıldı ve 24 saat ve salgılanan sitokinler için CL097 (TLR7 / 8) sitometrik boncuk dizisi ile ölçüldü. IL-6 üretilen ve ölçülen bir temsilcisi proinflamatuvar sitokin olarak gösterilir. * P <0.05 temsil eder; tek kuyruklu Student t-testi PBS grubuna uyarılan örnekleri karşılaştırarak. (Hjelm ark Modifiye. 2010) 2.

Şekil 7
Şekil 7. 3-D epitelyal hücreleri izleme gen ifadesi. Progesteron reseptörü (PR) tek tabaka olarak ifade (ML) ya da 3-D, insan epitel hücre vajinal Yarı-kantitatif RT-PCR analizi. GAPDH bir yükleme kontrol olarak gösterilmiştir. Amplifikasyon ürünlerigösterilen 30 PCR döngüsünden sonra ortaya çıkan transkript ifade bir sonucudur. Ok, sadece 3-D numune meydana PR bantları gelin gitti.

Şekil 8
Şekil 8. 3-D epitel hücrelerinin protein ekspresyon analizi. Tek tabakalı ve 3-Ge insan vajinal epitel hücre tam hücre lizatları (30μg) Western blot analizi bir anti-progesteron reseptörü (PR) antikoru ile probed. β-tübülin kontrolü yüklenmesi için bir sonda olarak kullanıldı.

Şekil 9
Şekil 9. Üç-Ge insan epitel hücre modeli üretken bir viral enfeksiyon destekler. HSV-2 ile enfekte 3-Ge insan vajinal epitel hücre agrega Konfokal immünfloresan mikroskobu görüntüsü. Hücreler iki saat, yıkanmış, sabit 24 saat sonrası enfeksiyon (% 4 PFA), bir İçişleri Bakanlığı 1.0 de bulaşmış ve HSV-2 spesifik VP5 c ile boyandıapsid antikor (yeşil) ve nükleer leke DAPI (mavi). Ölçek çubuğu: 50 mikron.

Şekil 10
10 Şekil. Flow sitometri ile 3-Ge insan epitel hücre modelinde bireysel hücre analizi. (A) Monolayer veya (B) 3-Ge insan vajinal epitel agrega bir FITC konjuge MUC1 antikor (mavi), bir izotip kontrolü (yeşil) veya PBS (kırmızı) ile etiketlenmiş, EDTA ile disosiye vardı ve FITC ifadesi ile ölçüldü akım sitometri. Sayılar izotip kontrolü boyanan hücrelerin arka plan floresan dışarı yolluk sonra kalan müsin antikor için pozitif boyanan hücrelerin yüzdesi temsil eder. Tekdüze olmayan zirveleri bu hücrelerin yüzey üzerinde glycosolation kalıpları ve MUC1 farklı düzeylerde çokluğunun bir sonucu vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan RWV biyoreaktör teknoloji kullanımı daha fizyolojik ilgili organotipik hücre kültürü modeli mevcut hücre kültürü sistemini ilerletmek için yeteneği ile araştırmacılar sağlayabilir. RWV biyoreaktör hücre kültür sistemi sıkı kavşaklar, müsin üretimi, hücre dışı işlemler (yani mikrovilluslar) ve hücresel polarite dahil in vivo benzeri özellikleri de olan 3-D hücresel agregatlar oluşturması için hücreler sağlar düşük kayma mikro sağlar. Burada sunulan veri ve örneklerin çoğunluğu RWV sisteminde yetiştirilen vajinal epitel hücreleri kullanan, ancak RWV sistemi de ince ve kalın bağırsak, akciğer, mesane, karaciğer ve bademcik epitel hücreleri içeren bir kültür diğer epitel hücre tipleri için kullanılır olmuştur 3-D organotipik modelleri 1, 7-13, 18 oluşturur. Ayrıca, bu sistem epitel hücreleri dışındaki kültürü hücre tipleri için kullanılmıştır, ve kompleks, multicel halen geliştirilmesilular organotipik kültür modellerinde devam 2, 18 vardır.

Protokolleri bir rehber olarak hizmet etmek içindir burada özetlenen ve faiz hücre türüne göre değişiklik gerekebilir. RWV sisteminde kültürleme epitelyal hücreleri için protokole en yaygın modifikasyonlar başlangıç ​​için hücreler STLV kültürlenmiştir süre, karar ve STLV gelen HARV için toplama transfer zamanlama ve hücre / boncuk oranı sayılabilir STLV tohum takviyesinde. Başarılı agrega oluşumu için kabul edilebilir bir daha özel modifikasyon gibi yüzey alanı, çap, şekil, yüzey kaplamaları, yoğunluk, yük, çekirdek malzeme ve gözeneklilik gibi microcarrier boncuk veya iskele özellikleri vardır. Buna ek olarak, taban kültür ortamı, formülasyon, veya takviye ayarlamalar, kültürü koşulları optimize etmek ve toplam oluşumu maksimize etmek için gerekli olabilir. Ayarlamalar ayrıca, biyoreaktör sistemi ve bileşenlerinin yapılabilirbiyoreaktör kabın boyutu ve dönme hızı cluding. Biyoreaktör içindeki mikro geliştirilmiş bir değerlendirme için, perfüze kültür sistemi agrega oluşumu için verimli bir ortam sağlanması kültürü damar içindeki pH, oksijen ve glikoz seviyelerinin sürekli izlenmesi için izin verdiği de mevcuttur. Kültürü koşulları, toplam oluşumu, hücresel farklılaşmadan optimize etmek ve her yeni model, sistem, aynı zamanda biyoreaktör sisteminin ilk gider, karakterize etmek için potansiyel olarak uzun zaman, bu sistemde önemli dezavantajları vardır. Bununla birlikte, bir laboratuvar uygulanan herhangi bir yeni bir kültür sistemi benzer bir dezavantajı vardır.

Biz ve diğerleri, insan hücreleri kullanarak RWV kaynaklı modeller etkinlik, toksisite ve insanlarda 1, 2, 18 ile ilgili bir şekilde aşılar, mikrobisitler, biyolojik ve ilaç farmakokinetiği öngörmek için değerli bir araç olabileceğini göstermiştir. Th başarı ileesnekliği ile birlikte otantik insan yanıtları üretmek için biyoreaktör kültür sistemi, yani RWV biyoreaktör sistemi uygulamaları şu anda tümör modelleme, rejeneratif tıp ve doku mühendisliği 2, 18-23 gibi alanlara genişletilmiş ediliyor. Biz insan mukoza dokusunun yapısı ve fonksiyonu hem de çoğaltır daha karmaşık çok hücreli sistemi oluşturmak için çalışıyoruz bizim RWV oluşturulan mukozal modelleri geliştirmek. Ancak yazarlar bu ilaçlar ya da aşı insan fizyolojik sistemler olduğunu karmaşık etkileşimlerin çoğaltmak için birden fazla model sistemler kullanmak veya bütünleştirmek için gerekli olabileceğini kabul edersiniz. Genel olarak, RWV biyoreaktör ve deneysel uygulamaları kullanarak hedefimize daha iyi bir mukoza dokusu biyoloji ve insan organotipik modellerinde çevre hakaretlere hücresel yanıtları anlamaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar onun protein analizi için onu teknik uzmanlık ve Andrew Larsen için Brooke Hjelm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Alternatifleri Araştırma Geliştirme Vakfı (MMHK) Grant ve NIH NIAID Cinsel Yolla Bulaşan Enfeksiyonlar ve Topikal mikrobisitler Kooperatif Araştırma Merkezi IU19 AI062150-01 (MMHK) tarafından kısmen finanse edildi. Biz minnetle rakamlar yeniden kullanım için Üremenin Biyolojisi kabul etmiş sayılırsınız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21131 Used at 1:500 dilution
FACSDiva BD Biosciences Flow cytometer
β-tublin antibody Calbiochem 654162 Used at 1:5000 dilution
Bio-Plex 2000 Bio-Rad 171-000205 v5 software
Bioreactor and components Synthecon RCCS-4
Cell strainer BD Biosciences 352340 40μm pore size
Conical tube (50mL) Corning 5-538-60
Coverslips VWR international 48366067
Cytokine bead array kits Bio-Rad Custom human kit
Cytodex beads Sigma-Aldrich C3275
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
EDTA Sigma-Aldrich ED-500G Ethylenediaminetetraacetic acid
Epithelial specific antibody (ESA) Chemicon International CBL251 Used at 1:50 dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10438 Heat inactivated
HARV (Disposable) Synthecon D-405
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 37%
Involucrin antibody Sigma-Aldrich I 9018
Microscope slides VWR international 16004-368
MTT reagent MP Biomedicals 194592 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide
MUC1 antibody (microscopy) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-7313 Used at 1:50 dilution
MUC1 antibody (flow cytometry) BD Biosciences 559774 Also called CD227, use 20μL per test
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4% in DPBS
Petri dish (small) BD Biosciences 353002
Polystyrene tube with filter BD Biosciences 352235
Polystyrene flow tube BD Biosciences 352058
PR antibody Dako M3569 Used at 1:100 dilution
ProLong Gold Invitrogen P36931 Mounting media with DAPI
RNeasy Mini Kit Qiagen 74903
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71725
Sterilization pouch VWR international 11213-035
Stopcocks (one-way) MedexSupply MX5061L
Syringe (10mL) BD Biosciences 309604 Luer-lock tip
Syringe (5mL) BD Biosciences 309603 Luer-lock tip
Trypan Blue Invitrogen T10282
Vp5 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-13525 HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
  2. Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
  3. Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
  4. Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
  5. Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
  6. Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
  7. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  8. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
  9. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
  10. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
  11. Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
  12. Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
  13. Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
  14. Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
  15. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  16. Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
  17. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
  18. Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
  19. Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
  20. Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
  21. Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
  22. Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
  23. Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
  24. Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 62 Döner duvar damar biyoreaktör kadın üreme sistemi insan epitel hücreleri üç boyutlu organotipik mukozal modelleri vajinal epitel hücreleri mikrobisid herpes simpleks virüsü toksikoloji konak-patojen ilişkileri hormon reseptörleri
Kültüre ve Duvar Gemi Biyoreaktör Döner Uygulamaları 3D Epitel Hücre Modelleri Türetilmiş
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M.… More

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. J. Vis. Exp. (62), e3868, doi:10.3791/3868 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter