Summary
El ensayo de depuración mesotelial se describe aquí se aprovecha de las células de la etiqueta fluorescente y time-lapse microscopía de vídeo para visualizar y medir cuantitativamente las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales. Este ensayo permite simular las primeras etapas de la metástasis del cáncer de ovario.
Abstract
El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos 1. A pesar de una respuesta inicial positiva a las terapias, del 70 al 90 por ciento de las mujeres con cáncer de ovario desarrollan metástasis a los nuevos, y la recurrencia es a menudo fatal 2. Es, por tanto, necesaria para entender cómo surgen metástasis secundarias con el fin de desarrollar mejores tratamientos para el cáncer de ovario en etapa intermedia y tardía. La metástasis del cáncer de ovario ocurre cuando las células malignas se desprenden de la localización del tumor primario y difundir toda la cavidad peritoneal. Las células diseminadas pueden formar grupos multicelulares, o esferoides, que o bien permanecerá sin conectar, o implantes en órganos dentro de la cavidad peritoneal 3 (Figura 1, la película 1).
Todos los órganos dentro de la cavidad peritoneal se revisten con una sola capa continua, de las células mesoteliales 4-6 (Figura 2). Sin embargo, las células mesoteliales están ausentes de debajolas masas tumorales peritoneales, como lo revelan los estudios de microscopio electrónico de secciones de tejidos humanos extirpados tumores 3,5-7 (Figura 2). Esto sugiere que las células mesoteliales se excluyen de debajo de la masa tumoral por un proceso desconocido.
Anterior en experimentos in vitro han demostrado que las células primarias de cáncer de ovario adjuntar más eficientemente a la matriz extracelular que a las células mesoteliales 8, y los estudios más recientes demostraron que las células primarias mesoteliales peritoneales realmente proporcionar una barrera para la adhesión celular de cáncer de ovario y la invasión (en comparación con la adhesión y la invasión sobre soportes que no fueron cubiertas con células mesoteliales) 9,10. Esto sugeriría que las células mesoteliales actuar como una barrera contra la metástasis de cáncer de ovario. Los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las células de cáncer de ovario incumplan esta barrera, y no incluyen el mesotelio, hasta hace poco, sigue siendo desconocido.
A continuación se describe ºmetodología e para un ensayo in vitro que los modelos de la interacción entre los esferoides de ovario de células cancerosas y las células mesoteliales in vivo (Figura 3, la película 2). Nuestro protocolo es una adaptación de los métodos descritos anteriormente para el análisis de las interacciones de células de tumor de ovario con monocapas mesoteliales 8-16, y fue descrito por primera vez en un informe que muestra que las células tumorales de ovario utilizar una activación de la integrina-dependiente de la miosina y la fuerza de tracción para promover la exclusión de la las células mesoteliales de debajo de un esferoide del tumor 17. Este modelo toma ventaja de la microscopia de fluorescencia de lapso de tiempo para controlar las poblaciones de células de dos en tiempo real, proporcionando la información espacial y temporal de la interacción. Las células de cáncer de ovario expresan la proteína fluorescente roja (RFP), mientras que las células mesoteliales expresan la proteína verde fluorescente (GFP). RFP-expresando ovario esferoides celulares de cáncer de adjuntar a la monocapa mesotelial que expresan GFP. La difusión esferoides, invadir yforzar a las células mesoteliales lado creando un agujero en la monocapa. Este agujero se visualiza como el espacio negativo (negro) en la imagen de las buenas prácticas agrarias. El área del agujero se puede medir a analizar cuantitativamente diferencias en la actividad holgura entre el control y las poblaciones experimentales de cáncer de ovario y / o células mesoteliales. Este ensayo requiere sólo un pequeño número de células de cáncer de ovario (100 células por esferoides X 20-30 esferoides por condición), por lo que es factible realizar este ensayo utilizando preciosas muestras primarios de células tumorales. Además, este ensayo se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.
Protocol
1. Cáncer de ovario de la célula Esferoide Formación
- PP-expresando las células de cáncer de ovario se cultivan en medio de base 10% (un medio de cultivo celular personalizada que contiene una mezcla 50:50 de 199 y MCDB105, 10% suero bovino fetal inactivado y 1% de lápiz estreptococo). Para expresar RFP en las células de cáncer de ovario no etiquetados, transfectar las células con un plásmido que contiene solicitud de propuestas y seleccionar las células que expresan RFP. Alternativamente, los vectores virales pueden ser utilizados para expresar transitoriamente proteínas fluorescentes, o las células pueden ser pre-incuban con un color rojo fluorescente de células seguidor colorante (Invitrogen).
- Antes de formar esferoides de cáncer de ovario, es necesario preparar baja adherencia 96 platos de fondo redondo de cultivo así. Para producir las placas de cultivo de baja adherencia, 30μl poli-HEMA (6mg polihidroxietilmetacrilato en 1 ml de EtOH al 95%) solución se añade a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos Corning celular. Las placas de 96 pocillos se incuban en un 37 ° C no incubador humidificado para evaporar el etanol, leaving una película de poli-HEMA en cada pocillo. Esta película de poli-HEMA evita que las células se adhieran a la parte inferior del pozo, forzando a las células para crecer en suspensión 18. [Alternativamente, ultra-bajo placas de cultivo de fijación (Corning) puede utilizarse en lugar de poli-HEMA platos recubiertos.]
- Después de las placas de baja adhesión de cultivo se preparan, trypsinize una placa de células de cáncer de ovario, pellet de las células en una centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RCF durante 3 minutos, Aspirar el sobrenadante y resuspender en medio de base 10%.
- Cuenta las células utilizando un hemocitómetro.
- Ajustar la concentración de tales células que hay 100 células por 50 l de medio de base 10%.
- Añadir 50 l de la suspensión de células uniformemente suspendido diluido a cada pocillo de la placa 96 así poli-HEMA cultura revestido.
- Se incuba la placa de 96 pocillos en un 37 ° C incubadora de cultivo celular durante 16 horas (esta cantidad de tiempo debe aumentarse o disminuirse dependiendo de la cantidad de tiempo que tardauna línea celular particular para formar esferoides multicelulares o deseadas condiciones experimentales) para permitir que las células de cáncer de ovario a agruparse entre sí, formando un esferoide sola multicelular en cada pocillo. Algunas células del tumor pueden someterse a la apoptosis durante este período, por lo que es importante elegir una hora antes de la inducción de la apoptosis.
2. Monocapa de células mesoteliales Formación
- En una campana de cultivo celular, pre-capa de los pocillos de un 6 bien de fondo de vidrio plato MatTek con fibronectina mediante la adición de 2 mL de una fibronectina 5μg / ml de solución de PBS a cada pocillo de la placa y la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La calidad óptica de los fondos de vidrio en los platos Mattek permiten imágenes de alta resolución microscópica.
- GFP-células que expresan mesoteliales se cultivan en medio de base 10%. Trypsinize una placa de células mesoteliales, la desaceleración en una centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 rpm durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante, y vuelva a suspender en el medio de base del 10%. Lacélulas mesoteliales utilizados aquí fueron ya expresando GFP cuando se obtuvieron, pero sin marcar las células mesoteliales pueden ser producidos por transfección con un plásmido GFP ADNc que contiene, o preincubating las células en un verde fluorescente de células seguidor colorante (Invitrogen).
- Después de la incubación de fibronectina de 30 minutos (en el paso 2.1), lavar los pocillos de la placa MatTek con 2 mL de PBS.
- Aspirar el PBS y placa de 6 x 10 5 células mesoteliales por pocillo en cada pocillo de la placa de 6 pocillos MatTek. Incubar el plato MatTek en un 37 ° C de cultivo celular durante la noche para permitir que las células mesoteliales para insertarse en el plato y forman una monocapa incubadora.
3. Ensayo de células mesoteliales Liquidación
- Utilizar una pipeta para recoger los esferoides de cáncer de ovario del 96 bien poli-HEMA placa revestida.
- Aspirar el medio de un pozo de la placa de MatTek 6 y que contiene una monocapa de células mesoteliales. Lavar una vez con 2 ml de PBS. Agregue todos los esferoides de la 96 y ptarde a un pocillo de la placa MatTek (~ 3 veces el número de esferoides que van a ser fotografiada para dar cuenta de aterrizaje esferoides en la parte del plato que no se pueden obtener imágenes).
- Coloque el plato MatTek en la etapa de un microscopio invertido campo amplio de fluorescencia capaz de realizar de lapso de tiempo de imágenes para la duración de al menos 8 horas. Utilice una platina motorizada de posiciones de la imagen múltiple en el plato, con múltiples eventos de intercalación esferoide, en un solo experimento. Usamos una cámara Nikon Ti-E invertido motorizado de fluorescencia de campo amplio lapso de tiempo microscopio con sistema integrado de enfoque perfecto y baja [20x-0.75 apertura numérica (NA)] Aumentos / NA de contraste de interferencia diferencial (DIC), la óptica, un transiluminador de halógeno Nikon con 0.52 NA de larga distancia de trabajo (LWD) condensador, Nikon rápida (<100 milisegundos de tiempo de conmutación) filtros de excitación y emisión de las buenas prácticas agrarias (ex 480/40, Em 525/50, PP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rápida transmisión Apagar la luz y de epifluorescencia ruta inteligentetros, una Nikon lineal codificado etapa motorizada, un Hamamatsu ORCA-AG se enfrió dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara microscopio hecha a la medida de la incubación con temperatura y el CO 2 de control, Nikon NIS-Elements AR software de la versión 3, y un TMC aislamiento de vibraciones mesa.
- Los esferoides de cáncer de ovario de células se depositan en el fondo de un molde y se unen a la monocapa de células mesoteliales. Recopilar las buenas prácticas agrarias, RFP y las imágenes de fase de 20 + esferoide / monocapa interacciones, cada 10 minutos, durante 8 horas.
- En el PP-que expresan las células de cáncer de ovario esferoides va a invadir a la monocapa de células que expresan GFP mesotelial la creación de un agujero en la monocapa. Después de 8 horas, medir las dimensiones de los orificios mediante el trazado de los agujeros negros en las imágenes GFP utilizando software de Elementos (u otro software adecuado tal como J imagen). Normalizar el tamaño del agujero al tamaño esferoide inicial dividiendo el tamaño del agujero de 8 horas por el tamaño del esferoide en la correspondiente imagen RFP en el tiempo cero. En este exejemplo, el tamaño del agujero se midió una sola vez, pero se puede medir varias veces durante todo el experimento de ocho horas para comprender mejor la dinámica de la intercalación.
4. Los resultados representativos
En este ejemplo, se comparó la capacidad de depuración mesotelial de esferoides celulares OVCA433 de cáncer de ovario que tienen expresión atenuada de talina-1 para controlar OVCA433 esferoides. OVCA433 esferoides de cada grupo se añadieron a un plato MatTek contiene ZT monocapas de células mesoteliales. Seis esferoides de cada grupo se obtuvieron imágenes cada 10 minutos durante ocho horas (Figura 4, 3 Película, Película 4). Los agujeros producidos en la monocapa por los esferoides de propagación se midieron y seis posiciones de cada grupo se promediaron. La Figura 4 muestra que la zona de aclaramiento promedio creado por esferoides Talin desmontables 1 fue significativamente menor que el área media creado por esferoides de control, lo que sugiere que se requiere para talina aclaramiento mesotelial por OVCA433 esferoides de cáncer de ovario.
Figura 1. La metástasis del cáncer del ovario. Los tumores primarios de ovario desarrollan ya sea desde el epitelio superficial del ovario o trompas de Falopio. Las células tumorales o grupos se desprenden del tumor primario y se acumulan en la cavidad peritoneal. Las células tumorales a continuación, pueden agregarse para formar esferoides multicelulares. Esferoides continuación, se adhieren a las monocapas de células mesoteliales que recubren la cavidad peritoneal. Las células mesoteliales están excluidos de debajo del esferoide de cáncer de ovario adjunto, permitiendo que los esferoides para obtener acceso a la membrana basal subyacente.
Película 1. La metástasis del cáncer de ovario. Haga clic aquí para ver la película .
Figura 2.
Figura 3. Ensayo de Liquidación mesoteliales. Esferoides de cáncer de ovario se forman mediante la incubación de 100 RFP-células que expresan el cáncer de ovario por pocillo en un poli-HEMA revestida 96 placa inferior la cultura y todo a 37 ° C durante 16 horas. Poli-HEMA evita que las células se adhieran a la placa de cultivo, permitiendo que las células permanezcan en suspensión y se adhieren entre sí para formar un solo grupo por pocillo. Monocapas de células mesoteliales se preparan mediante siembra de 6x10 5 células mesoteliales por pocillo en una fibronectina recubierto 6 así plato MatTek e incubando la placa a 37 ° C durante 16 horas. Los esferoides se transfieren luego al plato MatTek con la monocapa mesotelial y las dos poblaciones de células se visualizan cada 10 minutos durante 8 horas utilizando una Nikon Ti-EX Inverted motorizado de fluorescencia de campo amplio lapso de tiempo microscopio y software de los elementos.
Película 2. Ensayo de Liquidación mesoteliales. Haga clic aquí para ver la película .
Atenuación de la Figura 4. Talina de una expresión en OVCA433 esferoides disminuye la capacidad de depuración mesotelial. OVCA433 esferoides (rojo) con y sin expresión atenuada de una talina se permite adjuntar a e invadir en una monocapa mesotelial ZT (verde). Las dos poblaciones de células se obtuvieron imágenes cada 10 minutos durante 8 horas utilizando una Nikon Ti-E invertido motorizado de fluorescencia de campo amplio lapso de tiempo microscopio y software de los elementos. El gráfico muestra que talina una atenuación dedisminuye significativamente el aclaramiento de células mesoteliales (parcela Quantile con barras verdes en el medio).
Película 3. Control de OVCA433 esferoides (rojo) invadiendo en una monocapa mesotelial (verde). Haga clic aquí para ver la película .
Atenuación de la película 4. De talina una expresión en OVCA433 esferoides (rojo) disminuye mesotelial (verde) la capacidad de depuración. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
El "Ensayo de Liquidación mesoteliales" que aquí se presenta utiliza lapso de tiempo de microscopía para controlar las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales, con gran detalle espacial y temporal. Anteriormente, varios grupos de 8-14 había utilizado los ensayos de punto final para demostrar que las células de cáncer de ovario y de adherirse a invadir en monocapas de células mesoteliales. Este ensayo es único en que utiliza células marcadas fluorescentemente para distinguir las células tumorales de las células mesoteliales, de modo que la dinámica de estas dos poblaciones celulares pueden ser controlados durante el ensayo. El proceso de intercalación se puede visualizar en tiempo real y la tasa de aclaramiento mesotelial puede ser medida cuantitativamente con el tiempo. El uso de la microscopía timelapse permite seguir de cerca la dinámica de la interacción entre las dos poblaciones de células en diferentes condiciones experimentales. Adicionalmente, un porcentaje pequeño de cualquiera de las células mesoteliales o el cáncer de ovario ceLLS puede marcarse con un marcador fluorescente tercero para controlar la dinámica de las células individuales dentro de la población. Mediante el seguimiento de las células individuales en el tiempo, la direccionalidad y la tasa de migración se puede calcular. Para realizar mayores análisis resolución de aclaramiento mesotelial, de reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía puede ser utilizado. Si las adhesiones focales están etiquetados en las células mesoteliales, la disociación de las adherencias mesoteliales de las extensiones de protrusión de las células del tumor se puede controlar, como se describe en nuestra publicación anterior 17.
Este ensayo se puede utilizar para comparar la capacidad de invasión de esferoides de células de cáncer de ovario que han sido genéticamente modificados o farmacológicamente para aclarar los mecanismos moleculares por los cuales ovario esferoides celulares de cáncer de despejar la monocapa mesotelial o para identificar inhibidores de moléculas pequeñas del proceso. Además, el ensayo requiere un número muy pequeño de células de cáncer de ovario, de modo primario Tumor células de exudado de fluido se puede utilizar (ver limitaciones más adelante) si la etiqueta por preincubación de las células con colorantes cytotracker (Invitrogen). El ensayo es también susceptible de análisis de alto rendimiento. Para llevar a cabo estudios genéticos de alto rendimiento o farmacológica, las células de cáncer de ovario puede ser transfectadas con vectores diferentes siRNA o tratados con diferentes inhibidores farmacológicos en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Monocapas de células mesoteliales puede ser chapada en 96 platos de cultivo de fondo de vidrio, y los esferoides pueden ser transferidos 01:01 de las placas recubiertas de poli-HEMA a las placas que contienen monocapa. Todos estos pasos puede ser optimizado para el uso con los robots de detección de modo que cientos de siRNAs o inhibidores pueden proyectada en un tiempo.
Una de las ventajas de este ensayo es ser capaz de modelar la intercalación fuerza dependiente de las células de cáncer de ovario en la monocapa mesotelial. Nuestro laboratorio utilizó la microscopía de fuerza de tracción (TFM) para determinar si mecánica foICE regula despacho mesotelial 17. Hemos encontrado que la sobreexpresión de la integrina α5 aumentó la contractilidad de las células chapada en un sustrato recubierto con fibronectina, mientras RNAi mediada desmontables de talina, o II miosina disminución de la contractilidad de la célula 17. Desde regulación a la baja de la integrina α5, talina, o II miosina en los esferoides celulares de cáncer de ovario también la disminución del aclaramiento mesotelial, nuestras mediciones TFM apoyan la idea de que el despacho de mesotelial en un evento depende de celulares fuerzas de contracción, en el que las células con mayores fuerzas de contracción causado mayor mesotelial despacho. Por lo tanto, el ensayo de aclaramiento mesotelial se puede utilizar para entender mejor los eventos de intercalación, asociados con la metástasis ovárica esferoide, que son dependientes de las fuerzas mecánicas.
Este ensayo tiene algunas limitaciones a tener en cuenta. En primer lugar, con el fin de formar los esferoides multicelulares, las células deben ser cultivadas en suspensión por lo menos 6 horas. Silas células son incapaces de sobrevivir sin la matriz de ponerse en contacto con su capacidad de depuración se verá comprometida. En segundo lugar, es ventajoso utilizar células de cáncer de ovario que forman esferoides uniformes, multicelulares compactos. Si las células de cáncer de ovario sólo se forman grupos sueltos, que pueden romperse en la transferencia de la placa de poliHEMA recubierto a la cápsula que contiene la monocapa mesotelial, la creación de esferoides de diferentes formas y tamaños que se sumarán la variabilidad de los datos. En tercer lugar, si las células utilizadas son heterogéneas, esto añadirá variabilidad adicional a los tamaños de agujeros creados en la monocapa. Es importante utilizar múltiples pozos replicar (10-20/sample) debido a la variabilidad en la medida de intercalación después de ocho horas. En los ensayos descritos aquí, bien establecido del cáncer de ovario (OVCA433) y mesoteliales (ZT) se utilizaron las líneas celulares. Para realizar este ensayo más clínicamente relevantes, células primarias de cáncer de ovario, desde el líquido ascítico de los pacientes, se pueden utilizar. Sería interesante para determmente si in vitro la capacidad de remoción de células mesoteliales se correlaciona con el resultado clínico. Las limitaciones anteriores son particularmente importantes a considerar cuando se utiliza muestras primarias, como el número de células disponibles primarios es un factor limitante. Adicionalmente, es importante comprobar la integridad de la monocapa mesotelial antes de realizar este ensayo. La monocapa mesotelial se puede fijar y teñir para proteínas de unión célula-célula para asegurar que las uniones de células mesoteliales están intactos.
Finalmente, el ensayo de aclaramiento mesotelial puede ser fácilmente modificado para responder a las preguntas específicas experimentales. Aquí, hemos utilizado fibronectina como el componente de ECM que permite que las células de ovario y mesotelial a adherirse a las placas de cultivo de fondo de vidrio, sin embargo, otros componentes de ECM se puede utilizar como el colágeno y laminina. Además, otros tipos de células que se encuentran bajo la membrana basal, incluyendo fibroblastos, se puede añadir a este sistema experimental, para evaluar el papelde estos tipos de células mesoteliales en el despacho de 9,19,20. Por último, las interacciones de otros tipos de células tumorales (por ejemplo, páncreas, mama, etc) con células mesoteliales también puede ser modelado utilizando este ensayo. Y es factible para estudiar las interacciones entre las células cancerosas y una monocapa endotelial, utilizando este ensayo, para imitar intravasación o extravasación (ensayos similares han sido descritos en: 15,16,21-27).
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a la Nikon Imaging Center de la Harvard Medical School, en concreto las aguas de Jennifer, Lara Petrak y Salmón Wendy, para la formación y el uso de microscopios sus timelapse. También nos gustaría dar las gracias a Rosa Ng y Besser Achim valiosa para los debates. Este trabajo fue apoyado por el NIH Grant 5695837 (a M. Iwanicki) y GM064346 de ACC, por una beca de la Dra. Miriam y Sheldon G. Adelson Fundación de Investigación Médica (con ACC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 10082 | |
| Pen-Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15070 | |
| 96 well plates | Corning | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus Instruments | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek Corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Microscope | Nikon Instruments | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon Instruments | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon Instruments | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma Technology Corp. | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter Instrument Co. | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon Instruments | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | Custom Made | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon Instruments | Version 3 |
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