Summary
血吸虫卵是强有力的刺激T辅助2型（Th2细胞）的免疫反应，寄生虫感染的特点，哮喘和过敏性炎症。该协议利用S。血吸虫卵注射产生的CD4 Th2细胞因子诱导的炎症反应在肺，肺肉芽肿形成的特点，各地的鸡蛋，嗜酸性粒细胞和巨噬细胞替代激活。
Abstract
血吸虫寄生虫血吸虫感染估计有200万人，全世界1。在血吸虫 ，严重的病理，包括肝纤维化和脾肿大，慢性感染引起的免疫反应，而不是寄生虫本身2寄生虫卵。寄生虫卵诱导Th2反应特点是生产的IL-4，IL-5和IL-13，替代激活的巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的招聘。在这里，我们描述了一个模型来研究特定的寄生虫在Th2细胞因子反应和肺淋巴结，形成肺肉芽肿周围的蛋，呼吸道炎症注射血吸虫卵。
腹腔宣传和静脉的挑战， 与血吸虫卵被运送到肺，通过他们被困在肺实质的肺动脉由淋巴细胞，嗜酸性粒细胞和另外激活的巨噬细胞3-6组成的肉芽肿。与肉芽肿形成，在炎症的支气管肺泡空间关联的，扩大的淋巴结和CD4 T细胞活化可以观察到。这里我们详细介绍了协议隔离（从7修改）感染的肝血吸虫卵，敏感和具有挑战性的老鼠，和恢复分析机关（支气管肺泡灌洗（BAL），肺和淋巴结）。我们也有代表性的组织学和免疫学数据和其他免疫分析的建议。
总体而言，这种方法提供了在体内模型，以探讨在肺寄生虫引起的免疫反应，这是广泛适用于Th2细胞的炎症性疾病，包括寄生虫感染，纤维化疾病，过敏性炎症和哮喘的研究。这种模式的优势，为典型研究E 2的肺部发炎，包括一个强有力的Th2细胞在肺部的炎症反应和淋巴结的重复性，便于鸡蛋周围的肉芽肿病理检查炎症的评估，和潜在的长期存储的寄生虫鸡蛋。
Protocol
1。净化血吸虫卵
- 瑞士韦伯斯特小鼠感染血吸虫尾蚴，感染血吸虫生命周期8阶段。另外，获得NIAID的血吸虫病资源中心（血吸虫感染小鼠http://www.schisto-resource.org/~~V ）。离开小鼠感染后6-7周，时间点，鸡蛋是在肝脏中，可以恢复如下所述（ 见图1）。
- 安乐死与CO 2的小鼠，并用70％乙醇湿。将鼠标背面。使用钝钳和剪刀切去皮肤和基础腹膜。海关肝脏，胸腔和膈肌下方。
- 精细肉末，肝及添加20毫升，每消化混合物肝，胶原酶/ Dispase酶（0.5毫克/毫升），青霉素（100 U / ml的）和链霉素（100微克/毫升）在PBS组成。把mixt余吕杏茜在50毫升猎鹰管，并在37℃摇床孵育过夜。
- 离心混合物在400 XG / 3分钟/ 20℃轻轻倒出多余的液体，用PBS填充管。离心再次重复PBS洗涤。继去年离心，重悬沉淀在25毫升PBS。
- 通过一个标准的厨房金属过滤器（使用50毫升注射器柱塞，通过把一个玻璃烧杯捣碎肝片），其次是通过细筛的混合物（用10毫升注射器推混合物通过细筛，应变再悬浮颗粒进入第二个玻璃烧杯）。
- 紧张的混合物放入50毫升猎鹰管。离心机在400 XG / 5分钟/ 20°C。小心地倒出球不失上清。于3 mL PBS重悬沉淀。
- 叠加混合到20％的Percoll轻轻，40毫升的Percoll 8毫升和32毫升0.25M蔗糖（FW = 342.3所以8.56Ğsucrose/100毫升H 2 0）梯度。
- 离心机10分钟/ 800 XG / 20°C。吸取了1ð丢弃肝细胞的凝胶状的顶层。用移液管底部取出卵子颗粒和投入15毫升猎鹰管的。
- 洗颗粒3X在10毫升的PBS / 1毫米EDTA / 1 mM的EGTA使用离心分离机设置：3分/ 30 XG / 20°C。在500μL的PBS重悬。
- 重叠组合一个新的25％的Percoll，10毫升梯度（2.5毫升的Percoll和7.5毫升0.25M蔗糖）使用离心机设置：10分钟/ 800 XG / 20°C。
- 3X：在10毫升，用离心机设置PBS洗3分钟/ 30 XG / 20°C。
- 在过去的10毫升洗，取出100μL，算鸡蛋。鸡蛋定居很快，所以猎鹰管必须混合，然后才取出样品。稀释900μLPBS 100μL样品。应该算作100μL混合使用解剖显微镜（1:10稀释）在显微镜幻灯片液滴。应使用大口径的枪头。
- 50,000蛋/毫升的PBS重悬卵。鸡蛋可以保存几个月，在-80℃，解冻一次或TWICE使用。使用前，检查在显微镜下，以确保鸡蛋仍然完好无损（ 见图1）。
2。腹腔致敏与S。血吸虫卵：0天
- 准备在5000 eggs/100微升PBS鸡蛋在5的毫升snapcap管。注射，估计超过所需的50％以上的鸡蛋。
- 装入23 3/4inch针规，并与100μL鼠标悬浮鸡蛋每1毫升注射器。解决鸡蛋，所以鸡蛋立即使用前负荷针。
- 岩石注射器来回混合鸡蛋，每次注射前，注入腹腔注射100μL每鼠标悬浮。
3。眼窝静脉挑战与 S 血吸虫卵：14天
- 在5000 eggs/100微升上述准备鸡蛋。
- 与异氟醚（4％），或与甲苯噻嗪（10毫克/公斤）和氯胺酮（120毫克/千克）腹腔麻醉的小鼠在专门室。对ANEST深度hesia确定捏的脚垫，并确保没有生理反应。
- 装载1毫升注射器和23计3/4inch针与鸡蛋，用钳子在面临成角的斜面弯曲90°角进针。确保无气泡存在。
- 放在一方鼠标。收回的皮肤，眼睛会突出，眼球后面的船只注入100μL，在45°角的鼻子。
- 撤出针，适用于轻的压力，以控制出血。
所有这些程序都必须小心，必须监测小鼠，直到他们从麻醉中恢复。这些协议被批准的由宾夕法尼亚机构动物照顾及使用委员会（IACUC）的大学。
4。实验的收获：第22天
- 安乐死与CO 2的小鼠。
- 70％的乙醇，回地方的湿鼠标。
- 用生硬的强迫EPS，抓住老鼠腹部，并在皮肤的小切口。用剪刀小心地取下的皮肤和公开的肋骨和腹膜。
- 切开腹膜。切断腹主动脉，用巴斯德吸管恢复血液。存储在冰上。
- 移动肝脏暴露隔膜。使用罚款剪刀剪下隔膜。仔细切开暴露肺组织的左肋。
- 恢复parathymic淋巴结肿大，肺排出罚款钳。这些左肋下夹着，对胸腺9两旁。在1ml无菌媒体商店（DMEM培养基辅以10％热灭活小牛血清，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，2毫米L-谷氨酰胺，2 - 巯基乙醇50微米，都可以从Invitrogen公司）在冰上。
- 恢复灌洗，膨胀的肺部组织学分析，必须进行气管插管。由唾液腺移动到一边暴露气管，placi的吴细镊子下气管。用细剪刀，剪了一个洞，在气管中，并插入肺部油管。确保手术线程占用的油管。
- 附加PBS 1 mL注射器充满油管和充气用1 mL PBS肺部。仔细检索用注射器灌洗洗。存储在冰上。
- 附加4％多聚甲醛（PFA）在PBS填充1毫升注射器油管和膨胀的肺部。
- 拆下油管，并收紧手术线，以防止泄漏的煤灰。
- 仔细解剖出5毫升4％PFA在50毫升猎鹰管和肺组织的地方。
5。回收组织的制备
- 血清：以下存储在冰上30分钟到2Ĥ血液凝固，血清离心恢复从血液（13000 XG / 10分钟/ 4℃）。血清储存于-20°C，可以用于细胞因子酶联免疫吸附或 S 血吸虫卵抗原特异性IgG亚型酶联免疫吸附
- 淋巴结肿大：准备单细胞悬液，用于评估细胞计数的免疫反应的严重程度。检查Th2细胞极化，细胞重新刺激与 S 血吸虫虫卵抗原72小时。可以用流式细胞仪检测细胞内细胞因子染色，上清可以回收和ELISA Th2细胞因子（IL-4，IL-5，IL-13）6，储存在-20°C。
- 灌洗：细胞颗粒（400 XG / 5分钟/ 4℃）。 BAL液被回收并储存在-20°C用ELISA Th2细胞因子的分析。 BAL细胞计数作为气道炎症的读数。 10,000-100,000细胞（500转/ 5分钟/ 4℃）cytocentrifuge准备，随后Diffquik染色将使枚举炎症渗透4，6。此外，BAL细胞可以检查，流式细胞仪6。
- 肺组织肺组织是STOR版一夜之间在4°C。固定组织，石蜡包埋，切片，组织学和免疫荧光分析的幻灯片上。
6。代表结果
该协议的细节必要（i）拟定纯化血吸虫卵在体内使用（ 图1），（二）敏感和挑战，这些鸡蛋的小鼠及（iii）检查肺部炎症反应中恢复器官的所有步骤。这在体内模型再现驱动Th2细胞肺癌的一个强有力的炎症反应。这是由呼吸道炎症和嗜酸性粒细胞浸润灌洗细胞计数和cytocentrifuge准备（ 图2）可视化。可以检查鸡蛋引起的肉芽肿（ 图3a），H＆E -染肺段，肺切片免疫荧光染色允许或者激活的巨噬细胞和Th2细胞因子诱导的基因，如电阻的可视化锡类分子（RELM）α（ 图3b）。通过酶联免疫吸附的抗原特异性CD4 Th2细胞因子的响应研究IL-5，IL-4和IL-13的抗原刺激parathymic淋巴结细胞（ 图4）。
图1显示血吸虫卵注入模型代表图片肉芽肿肝脏特点高S.mansoni鸡蛋负担，和S.mansoni鸡蛋- 。平均尺寸（L）120（宽）50微米微米。
图2。S。血吸虫卵注射液驱动气道炎症。答：灌洗细胞数（X10 5）从幼稚（N）或S.mansoni（SM）鸡蛋注入小鼠体内。 * P <0.05;二BAL细胞Cytocentrifuge的准备。 Mac上，巨噬细胞; EO，嗜酸性粒细胞，淋巴结，淋巴细胞。酒吧，10微米。
图3。肺肉芽肿或者激活巨噬细胞周围的S.mansoni的鸡蛋的可视化。答：在H＆E -染肺部分肺肉芽肿周围的SM蛋（黑色箭头）可视化。 B.免疫荧光染色RELMα（绿色），甘露糖受体（红色）和DAPI（蓝色），揭示了周围的肉芽肿钐萤光蛋（黑色箭头）或者激活巨噬细胞（白色箭头）。酒吧，50微米。
图4。S.mansoni虫卵抗原特定的Th2细胞因子的响应。排水parathymic淋巴节点从天真（N）或SM鸡蛋注入小鼠细胞， 钐刺激</ EM> 72小时的虫卵抗原，IL-4，IL-5和IL-13上清酶联免疫吸附试验。规模，毫微克/毫升。* P <0.05;
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Discussion
在这里，介绍一个模型，采用血吸虫卵诱导2型肺部发炎。这种模式的典型特征包括强有力的Th2型免疫反应，气道炎症和肺肉芽肿形成。由于这些参数依赖CD4 Th2细胞的反应11，这是一个有用的模型，探讨Th2细胞反应的特定蛋白质或特定谱系缺失的影响。这里的读数将包括抗原特异性Th2细胞因子的量化分析，呼吸道细胞浸润，肺肉芽肿的大小。一个额外的参数，可衡量的是鸡蛋引起的肝纤维化12。这是衡量染色和Masson染色，从而使胶原沉积，发生周围血管，呼吸道，内肉芽肿（6）可视化的卵子注入肺部分。
虽然这protocOL采用S。血吸虫卵，这种模式的一个限制是，它并没有重现S。血吸虫感染，感染血吸虫尾蚴感染的小鼠进行。然而，这种模式的优点是方便设立，有研究者没有感染的风险。鸡蛋经过净化，可以方便地冻结和使用几个月后。一旦解冻，鸡蛋是不会传染的，因此，可以处理更容易活蛋，或感染尾蚴。准备注射鸡蛋时，必须确保鸡蛋是由在显微镜下检查完好无损。为了尽量减少蛋中断，大口径的枪头和针头必须使用处理时，鸡蛋只在必要时吸取。由于鸡蛋迅速解决，这也是至关重要的温和的摇摆重新挂起计数或注射前。
虽然纯化鸡蛋可以被冻结，受感染的肝脏必须处理立即成功纯化鸡蛋。由于严重的感染，目前在肝脏，鸡蛋的数量是依赖小鼠品系，时间点恢复蛋和蛋产量会有所不同取决于所使用的小鼠。在这里瑞士韦伯斯特女性的使用，并在感染后6-7周牺牲一代10,000-30,000鸡蛋/肝。作为一个有用的参考，奇弗等。在几个小鼠品系13详细肝鸡蛋负担。
鸡蛋注射不会引起死亡。然而，老鼠可能会屈从如果过麻醉，如果鸡蛋准备不彻底清洗（如在协议中详细说明），或如果鸡蛋注射会导致严重出血。另一种复古入轨是尾静脉注射的鸡蛋。这也导致在一个强有力的鸡蛋引起的肺部炎症反应3。所有这些程序都必须小心，必须监测小鼠，直到他们从麻醉中恢复。
总之，这个协议的细节注入S 的血吸虫卵诱导肺部炎症和Th2细胞的反应，是适用于寄生虫引起的炎症，哮喘，过敏症和纤维化疾病的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（NIH）AI091759和克隆氏病和结肠炎基金会美国的威廉·谢尔比参数及家庭基金会研究奖（MN）的支持。 NIAID的血吸虫资源中心（NIAID的合同N01，A130026）提供的血吸虫感染小鼠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase/Dispase | Roche Applied Science | 11 097 113 001 (500mg) | |
| Diff Quik Hema 3 Stain | Pack | Fisher Scientific Co. LLC | 122-911 |
| DMEM | Liquid | Gibco | 11965 |
| Falcon 50mL | Pack | Falcon | 352070 |
| Intramedic PE Tubing | Becton Dickinson and Co. | 427410 (0.58mm) | |
| Isoflurane | Abbot Animal Health | 52600405 (250mL) | |
| Ketamine | Fort Dodge, Animal Health | 100mg/mL | |
| Mannose receptor antibody | Biotin | AbD Serotec | MCA2235B |
| Metallic Strainer | Standard kitchen strainer | Target | Laurentiis |
| Paraformaldehyde | Electron Microsc. Sciences | 15710 (16%) | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | 15070 (100x) | |
| Percoll | GE Healthcare Biosciences | 17 0891 01 (1 Liter) | |
| RELMα antibody | Peprotech | 500-P214 (50μg) | |
| Surgical Thread | Surgical Specialties Corp. | SP118 (2.0 USP 100yds) | |
| Syringe Needle | BD Vacutainer Lab. Med. | 305143 (23g, 3/4 inch) | |
| USA Standard Testing Sieve | W.S. Tyler, Inc. | 150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100 |
|
| Xylazine | Butler | 20mg/mL |
References
- World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. WHO Technical Report Series 912. , Geneva. (2002).
- Pearce, E. J., MacDonald, A. S.
- Sandler, N. G. Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair. J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).
- Perrigoue, J. G. IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).
- Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses. Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).
- Nair, M. G. Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).
- Dalton, J. P. A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues. Parasitology. 115, 29-32 (1997).
- Lewis, F. A. Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations. J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).
- Lewis, F.
- Kaplan, M. H. Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response. J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).
- Cheever, A. W. Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni. Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).
