Mit den Eizellen Published: June 5, 2012 doi: 10.3791/3905

DOI

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Karen L. Joyce¹, Will Morgan², Robert Greenberg², Meera G. Nair¹

¹Institute of Immunology, Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Schistosoma mansoni Eier sind potente Stimulatoren der T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) Immunantwort, die charakteristisch für Parasitenbefall, Asthma und allergische Entzündung. Dieses Protokoll nutzt S. mansoni Ei Injektion an einen CD4 Th2-Zytokin-induzierte Entzündungsreaktion in der Lunge, Lunge durch Granulombildung um das Ei gekennzeichnet, Eosinophilie und Makrophagen-Aktivierung Alternative zu generieren.

Abstract

Schistosoma Parasiten sind Blut-Egel, die schätzungsweise 200 Millionen Menschen weltweit ^ein infizieren. Bei der chronischen Infektion mit Schistosoma, die schwere Pathologie, einschließlich Leberfibrose und Splenomegalie, wird durch die Immunantwort gegen den Parasiten Eier anstatt den Parasiten selbst ² verursacht. Parasiteneier Induktion einer Th2-Antwort durch die Produktion von IL-4, IL-5 und IL-13, die alternative Aktivierung von Makrophagen und die Ansammlung von Eosinophilen ist. Hier beschreiben wir Injektion von Schistosoma mansoni Eier als Modell, um Parasiten-spezifische Th2-Zytokin Reaktionen in der Lunge und Lymphknoten, die Bildung von Granulomen pulmonalen rund um das Ei, und Entzündung der Atemwege zu untersuchen.

Nach intraperitonealer Sensibilisierung und intravenöse Herausforderung, S. mansoni Eier werden in die Lunge über den Lungenarterien, wenn sie im Lungenparenchym eingeschlossen transportiertdurch Granulome von Lymphozyten, Eosinophilen und alternativ aktivierten Makrophagen ^3-6 besteht. Verbunden mit Granulombildung, Entzündung in den bronchoalveolären Raum, Ausdehnung der Lymphknoten-und CD4-T-Zell-Aktivierung beobachtet werden kann. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zur Isolierung von Schistosoma mansoni Eier aus infizierten Lebern (modifiziert nach ^7), Sensibilisierung und herausfordernd Mäuse, und die Rückgewinnung der Organe (bronchoalveoläre Lavage (BAL), Lunge und Lymphknoten) für die Analyse. Wir berücksichtigen auch Vertreter histologischen und immunologischen Daten und Vorschläge für weitere immunologische Analyse.

Insgesamt liefert diese Methode ein in vivo Modell zu Helminthen ausgelösten immunologischen Reaktionen in der Lunge zu untersuchen, was ist breit anwendbar auf das Studium der Th2 entzündlichen Erkrankungen einschließlich Wurminfektionen, fibrotische Erkrankungen, allergische Entzündungen und Asthma. Vorteile dieses Modells für die Untersuchung von typ.e 2 Entzündung in der Lunge sind die Reproduzierbarkeit eines potenten Th2-Entzündungsreaktion in der Lunge und Lymphknoten, die Leichtigkeit der Beurteilung von Entzündungen, die durch die histologische Untersuchung der Granulome rund um das Ei, und das Potenzial für langfristige Lagerung des Parasiten Eier.

Protocol

1. Reinigende Schistosoma mansoni Eier

1. Infect Swiss-Webster-Mäusen mit schistosome Cercarien, die das infektiöse Stadium des Lebenszyklus Schistosoma ⁸ ist. Alternativ erhalten schistosome-infizierten Mäusen aus dem NIAID Schistosomiasis Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Lassen Mäuse für 6-7 Wochen nach der Infektion, in welcher Zeit-Punkt, Eier sind in der Leber vorhanden und können wiederhergestellt werden, wie unten beschrieben (siehe Abb. 1).
2. Einschläfern Mäuse mit CO _2, und benetzen mit 70% Ethanol. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken. Verwenden Sie stumpfen Pinzette und Schere weggeschnitten Haut und des darunterliegenden Bauchfell. Excise die Leber, die unter dem Brustkorb und Zwerchfell entfernt.
3. Fein hacken Lebern und 20 ml pro Leber der Verdauung Mischung von Collagenase / Dispase (0,5 mg / ml), Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 ug / ml) in PBS zusammengesetzt. Setzen Sie mixture in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und über Nacht in einem 37 ° C geschüttelt.
4. Zentrifugieren Mischung bei 400 xg / 3 min / 20 ° C. Vorsichtig abgießen und die überschüssige Flüssigkeit füllen Rohr mit PBS. Zentrifugieren und wiederholen PBS waschen. Nach letzten Zentrifugation, Pellet in 25 ml PBS.
5. Strain die resuspendierten Pellets über eine Standard-Küche metallischen Sieb (mit einem 50-ml-Kolben der Spritze, um die Maische durch Leber Stücke in ein Becherglas), indem man das Gemisch durch ein feines Sieb (10 ml Spritze verwenden, um durch die Mischung feines Sieb drücken, gefolgt in ein zweites Becherglas).
6. Setzen gespannten Mischung in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 400 xg / 5 min / 20 ° C. Füllen Sie vorsichtig heraus, ohne Überstand Pellet. Pellet in 3 ml PBS.
7. Overlay vorsichtig mischen, auf einen 20% Percoll, 40 ml Gradienten von 8 ml Percoll und 32 ml 0,25 M Saccharose (FW = 342,3 so 8,56 g Saccharose/100 ml H ₂ 0).
8. Zentrifuge 10 min / 800 × g / 20 ° C Abpipettieren eind verwerfen gallertartige oberste Schicht der Leberzellen. Entfernen Ei Pellet am Boden mit einer Transferpipette und in ein 15 ml Falcon Röhrchen.
9. Wash Pellet 3X in 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA mittels Zentrifuge Einstellungen: 3 min / 30 ug / 20 ° C Resuspendieren in 500 ul PBS.
10. Overlay Mischung auf eine neue 25% Percoll, 10 ml-Gradienten (2,5 ml Percoll und 7,5 ml 0,25 M Saccharose) unter Verwendung Zentrifuge Einstellungen: 10 min / 800 × g / 20 ° C
11. Waschen in 10 ml PBS mit Zentrifuge Einstellungen 3X: 3 min / 30 xg / 20 ° C.
12. In den letzten 10 ml Wasch-, entfernen Sie 100 ul, um Eier zu zählen. Eier schnell absetzen, so dass die Falcon-Röhrchen und muss vor dem Entfernen Probe gemischt werden. Verdünnen Sie die Probe mit 100 ul 900 ul PBS. 100 ul der Mischung sollte als Tröpfchen auf einem Objektträger mit einem Binokular (1:10 Verdünnung) gezählt werden. Wide-Bohrung Pipettenspitzen verwendet werden sollte.
13. Resuspendieren Eier bei 50.000 Eier / ml in PBS. Eier können für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden und aufgetaut einmal oder TWICe für die Verwendung. Vor dem Einsatz unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Eier noch intakt sind (siehe Abb. 1) zu inspizieren.

2. Intraperitoneale Sensibilisierung mit S. mansoni Eier: Tag 0

1. Planen Eier bei 5000 eggs/100 ul PBS in einem 5 ml SnapCAP Rohr. Für die Injektion schätzen 50% mehr Eier als nötig.
2. Legen Sie eine 23 Gauge ^3/4inch Nadel und einer 1 ml Spritze mit 100 ul Ei Suspension pro Maus. Eier absetzen, so Last Nadel mit Eiern unmittelbar vor der Verwendung.
3. Felsen Spritze hin und her, um Eier vor jeder Injektion zu mischen, und injizieren intraperitoneal 100 L Suspension pro Maus.

3. Retroorbitalen intravenöse Challenge mit S. mansoni Eier: Tag 14

1. Bereiten Eier wie oben bei 5.000 eggs/100 ul.
2. Anesthetize Mäuse in speziellen Kammer mit Isofluran (4%) oder intraperitoneal mit Xylazin (10 mg / kg) und Ketamin (120 mg / kg). Tiefe von Anesthesia wird durch Quetschen der Fußsohle und die Gewährleistung keine körperliche Reaktion bestimmt.
3. Nach der Beladung mit 1 ml Spritze und 23 Gauge Nadel mit ^3/4inch Eier, mit einer Pinzette, um die Nadel in einem Winkel von 90 ° mit der Schräge nach unten in den Winkel zu biegen. Sicherstellen, dass keine Luftblasen entstehen.
4. Bewegen Sie die Maus auf einer Seite. Einfahren Haut so Auge ragen, und injizieren 100 ul in die Gefäße hinter den Augapfel in einem 45 ° Winkel zur Nase.
5. Ziehen Sie Nadel und leichten Druck auf Blutungen zu kontrollieren.

Alle diese Verfahren sind mit besonderer Sorgfalt durchgeführt werden, und Mäuse müssen überwacht, bis sie aus der Narkose erholen werden. Diese Protokolle wurden von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen.

4. Experimentelle Ernte: Tag 22

1. Einschläfern Mäuse mit CO _2.
2. Nasse Maus mit 70% Ethanol, und am Rücken.
3. Mit stumpfer FORCeps, fassen Sie die Maus Bauch und machen einen kleinen Schnitt in der Haut. Entfernen Sie vorsichtig die Haut mit einer Schere und entlarven den Brustkorb und Bauchfell.
4. Schneiden Sie das Bauchfell. Schneiden Sie die Bauchaorta, um das Blut mit einer Pasteurpipette zu erholen. Auf Eis lagern.
5. Bewegen Sie die Leber nach unten, um die Membran freizulegen. Verwenden einer feinen Schere, um die Membran geschnitten. Vorsichtig aufgeschnitten den Brustkorb auf das Lungengewebe zu entlarven.
6. Recover parathymic die Lymphknoten, die Lunge mit feinen Pinzetten abtropfen lassen. Diese werden unter dem Brustkorb gesteckt, auf beiden Seiten des Thymus ^9. Store auf dem Eis in 1ml steriles Medium (DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, alle erhältlich von Invitrogen ergänzt).
7. Um die BAL zu erholen, und pumpen die Lungen für die histologische Analyse, müssen intratracheale Intubation durchgeführt werden. Setzen Sie die Luftröhre, indem Sie die Speicheldrüsen zur Seite, und pLacing feinen Pinzette unter der Luftröhre. Mit feinen Schere, schnitt ein Loch in der Mitte der Luftröhre, und legen Sie Schlauch in die Lunge. Befestigen Sie Schlauch durch das Binden mit chirurgischen Faden.
8. Bringen Sie PBS-gefüllten 1 ml-Spritze auf den Schlauch und pumpen die Lungen mit 1 ml PBS. Sorgfältig abrufen BAL Wäsche mit Spritze. Auf Eis lagern.
9. Bringen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS-gefüllten 1 ml-Spritze mit dem Schlauch aufpumpen und in die Lunge.
10. Entfernen Sie die Schläuche, und ziehen Sie die chirurgischen Faden zu verhindern Auslaufen des PFA.
11. Sorgfältig sezieren aus Lungengewebe und in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit 5 ml 4% PFA.

5. Vorbereitung der Recovered Gewebe

1. Serum: Nach der Lagerung auf Eis für 30 min bis 2 h für Blutgerinnung, Serum aus dem Blut durch Zentrifugieren (13.000 × g / 10 min / 4 ° C). Serum wird bei -20 ° C gelagert und kann für Zytokin-ELISAs oder S verwendet werden mansoni Ei Antigen-spezifischen IgG-Isotyp ELISAs
2. Lymphknoten: Einzelne Zellsuspensionen hergestellt und Zellzahl verwendet, um die Größe der Immunantwort zu beurteilen. Um Th2-Zell-Polarisation zu untersuchen, werden die Zellen mit S. restimuliert mansoni Ei-Antigen für 72 Stunden. Intracellar Zytokinfärbung kann mittels Durchflusszytometrie untersucht werden, und die Überstände kann zurückgewonnen und bei -20 ° C für ELISA von Th2-Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: Zellen werden pelletiert (400 × g / 5 min / 4 ° C). BAL-Flüssigkeit gewonnen und bei -20 ° C zur Analyse von Th2-Zytokinen durch ELISA. BAL-Zellen Zahlen werden als eine Anzeige für Entzündung der Atemwege verwendet. Zubereitungen von 10.000-100.000 Zytozentrifuge Zellen (500 U / 5 min / 4 ° C), wird gefolgt von Färbung Diffquik ermöglichen Aufzählung entzündliches Infiltrat ^{4, 6.} Alternativ kann BAL-Zellen mittels Durchflusszytometrie ⁶ untersucht werden.
4. Lungengewebe: Lungengewebe ist stored über Nacht bei 4 ° C. Feste Gewebe in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Objektträger für histologische und Immunfluoreszenz-Analyse.

6. Repräsentative Ergebnisse

Dieses Protokoll Details alle notwendigen Schritte, um (i) Vorbereitung gereinigt Schistosoma mansoni Eier zur Verwendung in vivo (Abb. 1), (ii) zu sensibilisieren und fordern Mäuse mit diesen Eiern und (iii) erholen Organe zur Untersuchung der Lunge Entzündungsreaktion. Diese In-vivo-Modell reproduzierbar treibt eine starke Th2-Lungen-Entzündung. Dies wird durch Entzündung der Atemwege und Eosinophilie gezeigt als visualisiert von BAL-Zellzahlen und Zyto Zubereitungen (Abb. 2). H & E-gefärbten Lungen-Abschnitte können für Ei-induzierte Granulome (Abb. 3a) untersucht werden, und Immunfluoreszenzfärbung von Lungen-Abschnitten ermöglicht die Visualisierung der alternativ aktivierten Makrophagen und Th2-Zytokin-induzierte Gene wie ResisZinn-ähnliches Molekül (RELM) α (Abb. 3b). Die Antigen-spezifische CD4 Th2-Cytokin-Antwort wird durch ELISA für IL-5 untersucht, IL-4 und IL-13 der Antigen-stimulierten parathymic Lymphknotenzellen (4).

Abbildung 1 Schistosoma mansoni Ei Injektion Modell repräsentative Bilder von granulomatösen Lebern, die charakteristisch für hohe Belastungen S.mansoni-Ei, und der S.mansoni Eier werden gezeigt -.. Durchschnittliche Größe (L) 120 mu m durch (W) 50 um.

Abbildung 2. S. mansoni Ei Injektion treibt Entzündung der Atemwege. A. BAL Zellzahlen (x10 ⁵⁾ aus naiven (N) oder S.mansoni (Sm) Ei-injizierten Mäusen. * P <0,05. B. Zytozentrifuge Vorbereitung der BAL-Zellen. Mac, Makrophagen; Eos, Eosinophilen, Lymphe, Lymphozyten. Bar, 10 um.

Abbildung 3. Visualisierung der pulmonalen Granulome und alternativ aktivierten Makrophagen rund um das Ei S.mansoni. A. Pulmonale Granulom rund um das Ei Sm (schwarzer Pfeil) visualisiert wurde in H & E-gefärbten Lungen-Abschnitten. B. Immunfluoreszenzfärbung für RELMα (grün), Mannose-Rezeptor (rot) und DAPI (blau) zeigt alternativ aktivierten Makrophagen (weißer Pfeil) in der Umgebung des Granuloms autofluoreszierenden Sm Ei (schwarzer Pfeil). Bar, 50 um.

4. S.mansoni Ei Antigen-spezifischen Th2-Cytokin-Antwort. Entleeren parathymic Lymphknotenzellen aus naiven (N) oder Sm Ei-injizierten Mäusen wurden mit Sm stimuliert </ Em> Ei-Antigen für 72 Stunden, durch ELISA der Überstände für IL-4, IL-5 und IL-13 an. Scale, ng / ml. * P <0,05.

Discussion

Hier wird ein Modell beschäftigt Schistosoma mansoni Eier zu Typ-2-Lungen-Entzündung zu induzieren beschrieben. Charakteristische Merkmale dieses Modells sind die potenten Th2-Immunantwort, Entzündung der Atemwege und Lungen Granulombildung. Da diese Parameter in Abhängigkeit vom Th2 CD4-Zell-Antworten ¹¹ sind, ist dies ein nützliches Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Protein-spezifischen oder Linie-spezifische Deletionen auf Th2-Zell-Reaktionen zu untersuchen. Hier die Anzeigen würde Quantifizierung von Antigen-spezifischen Th2-Zytokinen, die Analyse der Zell-Infiltration in den Atemwegen, und die Größe der Lungengranulomen. Ein weiterer Parameter, die gemessen werden kann, ist Ei-induzierte Fibrose ^12. Dies wird durch Anfärben Ei-injizierten Lungenschnitten mit Masson, die die Visualisierung der Ablagerung von Kollagen, die um die Gefäße, die Atemwege, und innerhalb des Granuloms (gezeigt in ⁶⁾ erfolgt ermöglicht gemessen.

Obwohl diese Protokollol beschäftigt S. mansoni Eier, eine Einschränkung dieses Modells ist, dass es nicht reproduzieren S. mansoni Infektion, die durch Infektion von Mäusen mit infektiösen Cercarien durchgeführt wird. Allerdings ist Vorteile dieses Modells die Bequemlichkeit für die Einrichtung und dass es kein Risiko einer Infektion des Ermittlers. Nach der Reinigung können die Eier bequem eingefroren und verwendet werden, einige Monate später. Einmal aufgetaut, die Eier sind nicht ansteckend und kann daher leichter als Live-Eier, oder infektiösen Cercarien behandelt werden. Bei der Zubereitung Eier für die Injektion, muss man sicherstellen, dass Eier unversehrt durch Inspektion unter dem Mikroskop sind. Um Störungen Ei, mit weiter Bohrung Pipettenspitzen und Nadeln zu minimieren muss beim Umgang mit und Pipettieren von Eiern nur wenn nötig werden. Da Eier rasch eine Lösung finden, ist es auch wichtig, durch sanfte Schaukeln erneut zu suspendieren, bevor das Zählen oder Injizieren.

Obwohl die gereinigten Eier eingefroren werden kann, muss infizierten Leber verarbeitet werdensofort für die erfolgreiche Aufreinigung von Eiern. Da die Schwere der Infektion, und die Anzahl der Eier in der Leber Mausstamm-abhängig sind, werden die Zeitpunkte für Ei Ei Verwertung und Erträge variieren abhängig von den Mäusen verwendet. Hier Swiss-Webster-Frauen verwendet wurden, und 6-7 Wochen nach der Infektion getötet zur Erzeugung von 10.000-30.000 Eier / Leber. Als ein nützliches Nachschlagewerk, Cheever et al. Detail die Leber Ei Belastungen in verschiedenen Mausstämmen ^13.

Ei-Injektionsgerät nicht induziert Mortalität. Jedoch kann, wenn Mäusen über-anästhesiert unterliegen, wenn das Ei Herstellung nicht gründlich (wie im Protokoll beschrieben) gewaschen, oder Ei-Injektionsgerät verursacht schwere Blutung. Eine Alternative zu retro-orbitale Injektion Injektion in die Schwanzvene der Eier. Dies führt auch zu einem starken Ei-induzierte Lungenfibrose Entzündungsreaktion ^3. Alle diese Verfahren sind mit besonderer Sorgfalt durchgeführt werden, und Mäuse müssen überwacht, bis sie aus der Narkose erholen werden.

Im Ergebnis dieses Protokoll Details Injektion von S. mansoni-Eiern für die Induktion von Lungenentzündung und Th2-Zell-Antworten, und ist für die Untersuchung von Helminthen-induzierte Entzündung, Asthma, Allergien und fibrotischen Erkrankungen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase/Dispase		Roche Applied Science	11 097 113 001 (500mg)
Diff Quik Hema 3 Stain	Pack	Fisher Scientific Co. LLC	122-911
DMEM	Liquid	Gibco	11965
Falcon 50mL	Pack	Falcon	352070
Intramedic PE Tubing		Becton Dickinson and Co.	427410 (0.58mm)
Isoflurane		Abbot Animal Health	52600405 (250mL)
Ketamine		Fort Dodge, Animal Health	100mg/mL
Mannose receptor antibody	Biotin	AbD Serotec	MCA2235B
Metallic Strainer	Standard kitchen strainer	Target	Laurentiis
Paraformaldehyde		Electron Microsc. Sciences	15710 (16%)
Penicillin/ Streptomycin		Gibco	15070 (100x)
Percoll		GE Healthcare Biosciences	17 0891 01 (1 Liter)
RELMα antibody		Peprotech	500-P214 (50μg)
Surgical Thread		Surgical Specialties Corp.	SP118 (2.0 USP 100yds)
Syringe Needle		BD Vacutainer Lab. Med.	305143 (23g, 3/4 inch)
USA Standard Testing Sieve		W.S. Tyler, Inc.	150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100
Xylazine		Butler	20mg/mL