Bruke Egg fra Published: June 5, 2012 doi: 10.3791/3905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Karen L. Joyce¹, Will Morgan², Robert Greenberg², Meera G. Nair¹

¹Institute of Immunology, Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Schistosoma mansoni egg er potente stimulators av T hjelperen type 2 (Th2) immunrespons, karakteristisk for parasitt infeksjon, astma og allergisk betennelse. Denne protokollen benytter S. mansoni egg injeksjon for å generere et CD4 Th2 cytokin-indusert betennelsesreaksjon i lungene, preget av lunge svulstdannelser rundt egg, eosinofili og macrophage alternativ aktivering.

Abstract

Schistosoma parasitter er blod flukes som infiserer anslagsvis 200 millioner mennesker verden over ^1. I kronisk infeksjon med Schistosoma, den alvorlige patologi, herunder leverfibrose og splenomegali, er forårsaket av immunrespons mot parasitten eggene heller enn parasitten selv ^to. Parasitt egg indusere en Th2 respons preget av produksjonen av IL-4, IL-5 og IL-13, alternativ aktivering av makrofager og rekruttering av eosinofile. Her beskriver vi injeksjon av Schistosoma mansoni egg som en modell for å undersøke parasitt-spesifikke Th2 cytokin respons i lungene og drenering lymfeknuter, dannelsen av pulmonale granulomer rundt egget og luftveier betennelser.

Etter intraperitoneal sensibilisering og intravenøs utfordring, S. mansoni egg transporteres til lungene via lungene arteriene hvor de er fanget i lungene parenchymaav granulomer består av lymfocytter, eosinofile og alternativt aktiveres makrofager ^3-6. Assosiert med svulstdannelser, betennelse i de broncho-alveolene mellomrom, utvidelse av drenering lymfeknuter og CD4 T-celleaktivering kan observeres. Her har vi detalj protokollen for å isolere Schistosoma mansoni egg fra infiserte leveren (modifisert fra ^7), allergifremkallende og utfordrende mus, og utvinne organene (broncho-alveolar lavage (BAL), lunge og drenering lymfeknuter) for analyse. Vi inkluderer også representant histologisk og immunologiske data og forslag til ytterligere immunologisk analyse.

Samlet gir denne metoden en in vivo modell for å undersøke helminth-indusert immunologiske reaksjoner i lungene, som er bredt gjelder for studiet av Th2-inflammatoriske sykdommer, inkludert helminth infeksjon, fibrotiske sykdommer, allergisk betennelse og astma. Fordelene med denne modellen for studiet av type to betennelse i lungene inkluderer reproduserbarhet av en potent Th2 betennelsesreaksjon i lungene og drenering lymfeknuter, den enkle vurdering av betennelse ved histologisk undersøkelse av granulomer rundt egget, og potensialet for langsiktig lagring av parasitten egg.

Protocol

1. Rensing Schistosoma mansoni Eggs

1. Infisere sveitsisk-Webster mus med schistosome cercariae, som er smittsom scenen i Schistosoma livssyklus ^8. Alternativt få schistosome-infiserte mus fra NIAID Schistosomiasis Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). La mus for 6-7 uker etter smitte, og da-punkt, egg finnes i leveren og kan utvinnes som beskrevet under (se fig. 1).
2. Avlive mus med CO _2, og vætet med 70% etanol. Plasser musen på ryggen. Bruk butte pinsett og saks for å klippe bort hud og underliggende peritoneum. Avgiftsdirektoratet leveren, som ligger under brystkasse og membran.
3. Fint kjøttdeig lever og legge 20 ml per lever av fordøyelsen blanding, bestående av collagenase / dispase (0,5 mg / ml), penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 mikrogram / ml) i PBS. Sett mixture i en 50 ml Falcon rør og inkuber natten i en 37 ° C shaker.
4. Sentrifuger blandingen ved 400 xg / 3 min / 20 ° C. Forsiktig helle av overflødig væske og fylle røret med PBS. Sentrifuger igjen og gjenta PBS vask. Etter siste sentrifugeringen, resuspender pellet i 25 mL PBS.
5. Sil resuspendert pellet gjennom en standard kjøkken metallisk sil (bruk en 50 ml sprøytestempelet til mash leveren bitene gjennom i et glass begerglass), etterfulgt av at den blandingen gjennom en sil (bruk 10 ml sprøyte å presse blandingen gjennom sil inn i en andre glass begerglass).
6. Sett anstrengt blandingen i en 50 ml Falcon rør. Sentrifuger ved 400 xg / 5 min / 20 ° C. Hell forsiktig ut supernatanten uten å miste pellet. Resuspender pellet i 3 mL PBS.
7. Overlay bland forsiktig inn en 20% Percoll, 40 ml stigning på 8 ml Percoll og 32 mL 0,25 m sukrose (FW = 342,3 så 8,56 g sucrose/100 mL H ₂ 0).
8. Sentrifuger 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipettering av end forkaste geléaktige øverste laget av leverceller. Fjern egg pellet i bunnen med en overføringspipetten og satt i en 15 ml Falcon rør.
9. Vask pellet 3X i 10 mL PBS / 1 mM EDTA / 1 mm EGTA bruker sentrifuger innstillinger: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Resuspender i 500 mL PBS.
10. Overlegg mix på en ny 25% Percoll, 10 ml gradient (2,5 ml Percoll og 7,5 mL 0,25 m sukrose) med sentrifuger innstillinger: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
11. Vask 3X i 10 mL PBS bruker sentrifuger innstillinger: 3 min / 30 xg / 20 ° C.
12. I den siste 10 ml vaske, fjerne 100 mL å telle egg. Egg bosette raskt, så Falcon røret må blandes godt før du tar prøven. Fortynn 100 mL prøve med 900 mL PBS. 100 mL av miksen som skal regnes som dråper på et objektglass med en dissekere mikroskop (1:10 fortynning). Wide-bar pipettespisser bør brukes.
13. Resuspender egg på 50.000 egg / ml PBS. Egg kan lagres i flere måneder ved -80 ° C og tines én eller twice til bruk. Før bruk, inspisere under et mikroskop for å sikre at eggene er fortsatt intakt (se fig. 1).

2. Intraperitoneal Sensibilisering med S. mansoni Egg: Dag 0

1. Koke egg på 5000 eggs/100 mL PBS i en 5 ml snapcap tube. For injeksjon, anslår 50% flere egg enn nødvendig.
2. Legg en 23 gauge ^3/4inch nål og en 1 ml sprøyte med 100 mL av egg suspensjon per mus. Egg bosette, så last nål med egg umiddelbart før bruk.
3. Rock sprøyte frem og tilbake for å blande egg før hver injeksjon, og injiser intraperitonealt 100 mL av suspensjon per mus.

3. Retro-orbital Intravenøs Challenge med S. mansoni Egg: Dag 14

1. Forbered egg som ovenfor ved 5000 eggs/100 mL.
2. Anesthetize mus i spesialiserte kammer med isofluran (4%), eller intraperitonealt med xylazin (10 mg / kg) og ketamin (120 mg / kg). Dybde på anesthesia bestemmes ved å knipe av footpad og sørge ingen fysisk reaksjon.
3. Etter lasting av 1 ml sprøyte og 23 gauge ^3/4inch nål med egg, bruke tang for å bøye nålen i en 90 ° vinkel med skråkant vendt ned i vinkelen. Sørg for at ingen bobler er til stede.
4. Plasser musen på den ene siden. Trekk huden slik øyet vil rage, og injisere 100 mL inn skipene bak øyeeplet i 45 graders vinkel slik at nesen.
5. Uttak nål og bruke lett press for å kontrollere blødning.

Alle disse prosedyrene må utføres med forsiktighet, og mus må overvåkes til de komme fra anestesi. Disse protokollene ble godkjent av University of Pennsylvania Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

4. Eksperimentell Harvest-: Dag 22

1. Avlive mus med CO _2.
2. Våt mus med 70% etanol, og plass på baksiden.
3. Bruke sløv forceps, ta tak i musen magen og lage et lite snitt i huden. Fjern forsiktig huden med saks og utsett brystkassen og peritoneum.
4. Skjær åpne peritoneum. Kutt abdominal aorta å gjenopprette blod med en Pasteur pipette. Oppbevar på is.
5. Flytt leveren ned for å avsløre mellomgulvet. Bruk fin saks til å klippe membranen. Forsiktig kuttet opp brystkassen for å avdekke lungevevet.
6. Gjenopprette parathymic lymfeknutene som drenerer lungen med fine tang. Disse er gjemt under brystkassen, på hver side av thymus ^9. Store på isen i 1 ml sterile media (DMEM supplert med 10% varme-inaktiverte kalvefoster serum, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, 2 mm L-glutamin, 50 mM 2-mercaptoethanol, alt tilgjengelig fra Invitrogen).
7. For å gjenopprette BAL, og blåser opp lungene for histologisk analyse, må intratrakeal intubasjon utføres. Utsett trachea ved å flytte spyttkjertlene til side, og placing fin pinsett under luftrøret. Ved hjelp av gode saks, klippe et hull i midten av luftrøret, og sett slangen inn i lungene. Sikre slangen ved å binde med kirurgisk tråd.
8. Fest PBS-fylte 1 ml sprøyte til slangen og blås lungene med 1 ml PBS. Nøye hente BAL vask med sprøyte. Oppbevar på is.
9. Fest 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS-fylte 1 ml sprøyte til slangen og blås lungene.
10. Ta slangen, og skru den kirurgiske tråden for å forhindre lekkasje av PFA.
11. Forsiktig dissekere ut lungevev og plass i en 50 ml Falcon rør med 5 ml 4% PFA.

5. Utarbeidelse av Gjenopprettede Vev

1. Serum: Etter lagring på is i 30 min til 2 timer for blodet å koagulere, er serum utvinnes fra blodet ved sentrifugering (13 000 xg / 10 min / 4 ° C). Serum oppbevares ved -20 ° C og kan brukes til cytokin ELISAs eller S. mansoni egg antigen-spesifikk IgG isotype ELISAs
2. Lymfeknuter: Single cellesuspensjoner er forberedt og celletall brukt til å vurdere omfanget av immunresponsen. For å undersøke Th2 celle polarisering, blir cellene re-stimulert med S. mansoni egg antigen i 72 timer. Intracellar cytokin farging kan undersøkes ved flowcytometri, og supernatants kan gjenvinnes og oppbevares ved -20 ° C for ELISA av Th2-cytokiner (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: Cellene er pelletert (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAL væske gjenvinnes og lagret ved -20 ° C for analyse av Th2-cytokiner med ELISA. BAL celler teller brukes som en avlesning for Airway betennelse. Cytocentrifuge preparater av 10,000-100,000 celler (500 rpm / 5 min / 4 ° C), vil etterfulgt av Diffquik farging tillate opplisting av inflammatorisk infiltrere ^{4, 6.} Alternativt kan BAL celler undersøkes med flowcytometri ^6.
4. Lungevev: lungevevet er Stored natten ved 4 ° C. Fast vev er parafin-innebygd, seksjonert og montert på lysbilder for histologiske og immunfluorescens analyse.

6. Representative Resultater

Denne protokollen detaljer alle de nødvendige skritt for å (i) forberede renset Schistosoma mansoni egg for in vivo bruk (Fig. 1), (ii) sensitize og utfordre mus med disse eggene og (iii) gjenopprette organer for undersøkelse av lungene inflammatorisk respons. Denne in vivo modell driver reproduserbart en potent Th2 lunge inflammatorisk respons. Dette er vist ved luftveis inflammasjon og eosinofili som visualisert ved BAL celletall og cytocentrifuge preparater (Fig. 2). H & E-farget lunge seksjoner kan undersøkes for egg-indusert granulomer (Fig. 3a), og immunofluorescent farging av lunge seksjoner tillater visualisering av alternativt aktiverte makrofager og Th2 cytokin-induserte gener som resistinn-lignende stoff (RELM) α (fig 3b). Den antigen-spesifikke CD4 Th2 cytokin respons undersøkt av ELISAs for IL-5, IL-4 og IL-13 av antigen-stimulerte parathymic lymfeknute celler (Fig. 4).

Figur 1 Schistosoma mansoni egg injeksjon modell Representative bilder av granulomatøs lever, karakteristiske høye S.mansoni-egg byrder, og av S.mansoni egg vises -.. Gjennomsnittlig størrelse (L) 120 mikrometer ved (W) 50 mikrometer.

Figur 2. S. mansoni egg injeksjon driver Airway betennelse. A. BAL celle tall (x10 ⁵⁾ fra naive (N) eller S.mansoni (SM) egg-injiserte mus. * P <0.05. B. Cytocentrifuge utarbeidelse av BAL celler. Mac, makrofag; Eos, eosinophil, lymfe, lymfocytt. Bar, 10 mikrometer.

Figur 3. Visualisering av pulmonale granulomer og eventuelt aktiveres makrofager rundt S.mansoni egg. A. Pulmonal granulom rundt Sm egg (svart pil) ble visualisert i H & E-fargede lunge seksjoner. B. Immunfluorescens farging for RELMα (grønn), mannose reseptor (rød) og DAPI (blå) viser alternativt aktiverte makrofager (hvit pil) i granulom rundt autofluorescent Sm egg (svart pil). Bar, 50 mikrometer.

Figur 4. S.mansoni egg antigen-spesifikk Th2 cytokin respons. Drenering parathymic lymfeknute celler fra naive (N) eller Sm egg-injisert mus ble stimulert med Sm </ Em> egg antigen i 72 timer, etterfulgt av ELISA av supernatants for IL-4, IL-5 og IL-13. Scale, ng / ml. * P <0.05.

Discussion

Her er en modell ansette Schistosoma mansoni egg til å indusere type 2 lunge betennelse beskrevet. Karakteristiske trekk ved denne modellen inkluderer den potente Th2 immunforsvaret, luftveier betennelse og pulmonal svulstdannelser. Siden disse parametrene er avhengige av CD4 Th2 celle responser ^11, er dette en nyttig modell for å undersøke effektene av protein-spesifikke eller avstamning-spesifikk slettinger på Th2 celle responser. Her lettleselig ville inkludere kvantifisering av antigen-spesifikke Th2-cytokiner, analyse av cellen infiltrasjon i luftveiene, og størrelsen på lunge granulomer. En ekstra parameter som kan måles er egg-indusert fibrose ^12. Dette måles ved farging egg-injiserte lunge seksjoner med Masson sine trichrome, som tillater visualisering av kollagen deponering som oppstår rundt skipene, luftveiene, og i granulomer (vist i ^6).

Selv om dette protocol sysselsetter S. mansoni egg, en begrensning av denne modellen er at den ikke reprodusere S. mansoni infeksjon, som er utført ved å infisere mus med infeksiøs cercariae. Imidlertid er fordelene ved denne modellen bekvemmeligheten for å sette opp, og at det ikke er fare for smitte av undersøkeren. Etter rensing, kan eggene være bekvemt fryses og brukes flere måneder senere. Tint, eggene er ikke smittsom, og kan derfor håndteres lettere enn levende egg, eller smittefarlig cercariae. Når du forbereder egg for injeksjon, må man sørge for at egg er intakte ved inspeksjon under mikroskopet. For å minimere egg avbrudd, wide-bore pipettespisser og nåler må brukes ved håndtering, og pipettering av egg kun når det er nødvendig. Siden egg bosette seg raskt, er det også avgjørende å re-suspendere ved forsiktig rocking før telling eller injisering.

Selv om rensede eggene kan fryses, må infiserte leveren behandlesumiddelbart etter vellykket rensing av egg. Siden alvorlighetsgraden av infeksjonen, og antall egg stede i leveren er mus stamme-avhengige, vil tid-poeng for egg utvinning og egg Kapasiteten varierer avhengig av mus brukes. Her sveitsisk-Webster hunner ble brukt, og ofret på 6-7 uker etter smitte for generering av 10,000-30,000 egg / lever. Som en nyttig referanse, Cheever et al. detalj leveren egg byrdene på flere musestammer ^13.

Egg injeksjon induserer ikke dødelighet. Imidlertid kan mus bukke hvis over-bedøvet, hvis egget preparatet ikke er vasket grundig (som beskrevet i protokollen), eller om egg injeksjon forårsaker alvorlig blødning. Et alternativ til retro-orbital injeksjon er halen vene injeksjon av eggene. Dette resulterer også i en potent egg-indusert lunge inflammatorisk respons ^tre. Alle disse prosedyrene må utføres med forsiktighet, og mus må overvåkes til de komme fra anestesi.

I konklusjonen, denne protokollen detaljer injeksjon av S. mansoni egg for induksjon av lunge betennelse og Th2-celle responser, og er gjeldende for studiet av helminth-indusert betennelser, astma, allergi og fibrotiske sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase/Dispase		Roche Applied Science	11 097 113 001 (500mg)
Diff Quik Hema 3 Stain	Pack	Fisher Scientific Co. LLC	122-911
DMEM	Liquid	Gibco	11965
Falcon 50mL	Pack	Falcon	352070
Intramedic PE Tubing		Becton Dickinson and Co.	427410 (0.58mm)
Isoflurane		Abbot Animal Health	52600405 (250mL)
Ketamine		Fort Dodge, Animal Health	100mg/mL
Mannose receptor antibody	Biotin	AbD Serotec	MCA2235B
Metallic Strainer	Standard kitchen strainer	Target	Laurentiis
Paraformaldehyde		Electron Microsc. Sciences	15710 (16%)
Penicillin/ Streptomycin		Gibco	15070 (100x)
Percoll		GE Healthcare Biosciences	17 0891 01 (1 Liter)
RELMα antibody		Peprotech	500-P214 (50μg)
Surgical Thread		Surgical Specialties Corp.	SP118 (2.0 USP 100yds)
Syringe Needle		BD Vacutainer Lab. Med.	305143 (23g, 3/4 inch)
USA Standard Testing Sieve		W.S. Tyler, Inc.	150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100
Xylazine		Butler	20mg/mL