En murint Model of Muscle Training ved nevromuskulær elektrisk stimulering

Summary

En murint modell av nevromuskulær elektrisk stimulering (NMES), en trygg og rimelig klinisk modalitet, til de fremre kammer musklene er beskrevet. Denne modellen har fordelen av å endre en lett tilgjengelig klinisk enhet med det formål å få fram målrettede og konkrete muskelsammentrekninger i mus.

Abstract

Nevromuskulær elektrisk stimulering (NMES) er en vanlig klinisk modalitet som er mye brukt for å gjenopprette ^en, vedlikeholde ^to eller forbedre ^3-5 muskel funksjonsevne. Transkutan overflate stimulering av skjelettmuskulatur innebærer en strøm mellom en katode og en anode, og dermed indusere spenning av motorenheten og de omkringliggende muskelfibre.

NMES er en attraktiv modalitet å evaluere muskelavslappende tilpassede tiltak av flere grunner. Først gir det en reproduserbar eksperimentell modell der fysiologiske tilpasninger, for eksempel myofiber hypertophy og muskel styrke ^{6, 7-9} angiogenese, vekst faktor sekresjon ^9-11, og muskel forløperen celleaktivering ¹² er godt dokumentert. Slike fysiologiske responser kan titreres forsiktig med forskjellige parametere for stimulering (for Cochrane-oversikt, se ^13). I tillegg NMES rekruttenemotoriske enheter non-selektivt, og i en romlig fast og timelig synkron måte ^14, gir den fordelen av å utøve en behandlingseffekt på alle fibre, uavhengig av fibertype. Selv om det er spesifiserte kontraindikasjoner NMES i kliniske populasjoner, inkludert perifere venøse lidelser eller malignitet, for eksempel, er NMES trygt og gjennomførbart, selv for de som er syke og / eller sengeliggende og for populasjoner som kraftig trening kan være utfordrende.

Her demonstrerer vi protokollen for å tilpasse kommersielt tilgjengelige elektroder og utfører en NMES protokollen ved hjelp av en murine modell. Denne dyremodell har fordelen av å benytte en klinisk tilgjengelig enhet og gi umiddelbar tilbakemelding om plassering av elektroden å lokke fram ønsket muskelgruppe kontraktile effekt. For hensikten med dette manuskriptet, vil vi beskrive protokollen for muskelstimulering av fremre kammer musklene i en mus hindlimb.

Protocol

1. Elektrode Forberedelse

• Skjær en 1 cm x 1 cm delen av vektoren kretskortet.
• Stabiliser 2 wirewrap pins med en skrustikke grep, med pinner fordelt på ca 3,5 mm fra hverandre. De splittnagler endene av pinnene skal vende opp.
• Bøy wirewrap pins i 90 ° vinkel, omtrent midtveis langs lengden, bruker needlenose tang.
• Avdekke kobbertråder av kontakter, ca 7 cm fra bly tilkobling, ved stripping isolasjon.
• Loddetinn en av kobbertråder til splittnagler slutten av en de wirewrap pinnene. Gjenta lodding steg for andre wirewrap pin.
• Trekk krympeslange på loddet forbindelse mellom kobbertråder og gull pinner for å isolere og stabilisere. Varm slangen ved hjelp av lodding tips.
• Sett unsoldered tips av wirewrap pinnene inn i tilstøtende åpninger breadboard kretskortet.
• Påse at wirewrap pins er parallelt til hverandre og stICK gjennom breadboard slik at tuppene er plassert i samme avstand når den plasseres gjennom styret.
• Integrer loddet endene av pinnene klar epoxy. La epoksyen herde i ca 10 minutter, eller til det er helt tørt.
• Gjenta påføring av epoxy til pinnene og vektor kretskort er helt innebygd for å gi strukturell integritet og strekkavlastning for ledningene.
• Sand ned epoxy med en metall-fil for å avsløre tips av gull pinnene.
• Bruk et multimeter for å sikre de to ledningene er ikke elektrisk kortsluttet og at ledningene har tilstrekkelig kontinuitet
• Fest elektroden fører fra NMES enheten til kvinnelig 2-veis ledningskontakten (Pomona patch cord).

2. Animal Forberedelse

• Dyr er bedøvd ved innånding bruke 2% isofluorane (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) i 100% O ₂ gass. Dyret bør forbli bedøvd gjennom than NMES sesjon.
• Før du starter NMES protokollen utføre en tå klype for å sikre at dyret er helt bedøvet.
• Animal bør regelmessig kontrolleres for respons på stimulering for å sikre at bedøvelsen nivå er tilstrekkelig. Den anestesi bør justeres etter behov. Bevegelse annen enn den stimuleres beinet, endringer i luftveiene dybde og farge på slimhinner bør alle bli vurdert regelmessig for å overvåke anestesidybden.
• Plasser dyret i lateral recumbency.
• Påfør ophthalmic smøremiddel til øynene for å forhindre hornhinnen tørker under prosedyren.
• Barbere hindlimb området som skal behandles, og tørk med alkohol.
• Tørk av elektroden med 3% blekemiddel, og skyll med vann.
• Påfør et lag gjennomføre gel over området der elektroden vil bli brukt. Påfør som nødvendig gjennom hele NMES protokollen for å sikre strømmen mellom elektroden og huden.
• En varmelampe or sirkulerende vann teppe bør brukes til å opprettholde normal kjerne kropp områder.
• Merk: Alle prosedyrer er gjennomgått og godkjent av Universitetet i Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk komité og utført i PHS sikret og AAALAC Int. akkreditert program og fasiliteter.

3. Stimulering

• Elektrode plassering:
  • For stimulering av fremre kammer muskler, inkludert tibialis anterior og extensor digitorum longus muskel, plasserer overflaten elektroden direkte over dyrets dype fibular nerve, som er en distal avgreining av den felles peroneal nerve, og ligger bare anterior til den fibular hode.
  • For stimulering av fremre kammer muskler, er plassering av elektroden bekreftet når stimulering utløser fulle ankel dorsiflexion og full forlengelse av sifrene. På den annen side, dorsiflexion, i fravær av siffer forlengelse antyder at bare tibialis anterior muskel blir stimulert. En slik målrettet kontraktile responsen kan være ønskelig, avhengig av studien design.
  • Den muskel sammentrekning er delt inn i 2 faser av stimulering: et fritt bevegelig, konsentrisk fase, som oppstår under den innledende ~ 0,5 sekunder. I denne første fasen, beveger labb fra en hvileposisjon til maksimal dorsiflexion og siffer forlengelse. Den andre fasen av stimulering er en isometrisk kontraksjon opprettholdes ved utgangen utvalg dorsiflexion og siffer forlengelse.
• Stimulering parametere:
  • Dette NMES Modellen benytter den 300 PV Empi multifunksjonsmaskin elektroterapi enhet, som gir 2 kanaler med konvensjonelle NMES (se tabell). Ved anvendelsen av denne modellen, er kun en kanal som brukes.
  • Parametere som benyttes inkluderer symmetrisk bølgeform, en puls varighet på 150 μs og en frekvens på 50Hz. Stimulering tid er satt til 5 sekunder, med en 0,5 andre rampe opp og en 0,5 andre rampe ned. Dette vil gi muskler til mer gradvis acclikompis til stimulering. I dagens protokollen, ble av tid i mellom riene satt til 10 sekunder, men dette kan bli justert avhengig av ønsket effekt. Redusert off ganger vil resultere i en raskere oppstart av muskeltretthet. Disse stimulering parametrene var basert på kliniske protokoller laget for å forbedre muskelstyrken med nevromuskulær elektrisk stimulering, uten å indusere betydelig skjelettmuskulatur skade ^{en, 15, 16.}
  • Mus fullføre to sett med 10 sammentrekninger, med en fem minutters hvile i mellom settene.
  • For voksne dyr, er NMES intensitet vanligvis initiert ved 9 mA. Fra vår erfaring, er dette omtrentlig til maksimal start intensitet som induserer ikke en merkbar gangart verdifall umiddelbart etter stimulering. For påfølgende NMES økter, vil intensiteten økes med 1 mA hver gang dyrene er i stand til å fullføre 20 Full dorsiflexions.
• Etter ferdigstillelse av stimulering protokollen og Recoveldig fra anestesi, dyr vanligvis demonstrere en normal gangart og holdning. Bevegelser skal forbli upåvirket gjennom varigheten av NMES programmet.

4. Representative Resultater

Den NMES protokollen beskrevet i denne artikkelen har blitt iverksatt i flere musestammer, inkludert: Wild Type (B6/10), B6.SCID og mdx / SCID mus. Representative resultater av NMES utført over 4 uker (20 økter) i 3-5 mnd gammel mdx / SCID presenteres.

Dyrene ble humant avlivet av livmorhalskreft forvridning mens under anestesi. Den tibialis anterior muskelen ble høstet og umiddelbart frosset i to metyl-butan pre-kjølt i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C. Serial tverrsnitt (10 mikrometer) ble innhentet og montert på lysbilder. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av standard statistiske programvarepakker (SPSS, v19.0 programvare). Først ble Levene test brukes til å vurdere om det was likestilling av varianser. Uavhengige prøver t-test ble deretter utført for å undersøke forskjeller mellom NMES og kontrollgruppene.

Hematoxylin og eosin (H & E) flekker ble utført for å undersøke om NMES protokollen ville føre til økt skade i dystrofe muskelen. En seksjon ble valgt, og bildene ble innhentet ved hjelp av et lysmikroskop (Nikon Eclipse E800, Nikon, Japan). Det totale antall fibre og antall fibre med en sentral beliggenhet atomkjerner ble manuelt regnet med National Institutes of Health (NIH) - utviklet bildeanalyse programvare, Bilde J. Det var ingen signifikant økning i tilvekst indeks (antall sentralt kjerneholdige fibre / totalt antall fibre) i dyrene sendes til NMES sammenlignet med kontroller (p = 0,802; Figur 1). Dette tyder på at anvendelsen av NMES ikke øker degenerasjon-regenerering kaskade observert i dystrofe dyr, og er derfor ikke sannsynligskal framkalle en økt muskel skade.

Immunofluorescent farging for CD31 ble utført for å undersøke effekten av den 4-ukers NMES protokollen på muskel vascularity. Kort, ble muskel seksjoner fiksert i 4% formalin og blokkert ved hjelp av 5% Horse Serum (HS). Seksjoner ble inkubert med en rotte anti-mus primær antistoff (1:300 fortynning i 5% HS) og behandles med en 555-merket geit anti-rotte sekundært antistoff (1:300 fortynning i 5% HS). For å kvantifisere det totale antall CD31 positive celler, ble en del valgt, og fotografert ved hjelp av fluoriserende mikroskopi (Nikon Eclipse E800, Japan). Det totale antall kapillærer ble manuelt regnet med Northern Eclipse Software (Empix Imaging Inc.). Det var en betydelig økning i antall CD31 positive celler i dyrene sendes til NMES sammenlignet med kontroller (p <0,01; figur 2), som indikerer at NMES protokollen som beskrevet fremmer muskel-skjelettlidelser angiogenese.

In situ kontraktile testing: Fire uker etter avslutningen av en NMES protokollen, ble kontraktile testing av fremre kammer musklene utføres ved hjelp av en in situ testing apparater (809B modell, Aurora Scientific Inc, Canada), stimulator (701C Model, Aurora Scientific Inc , Canada), og kraft svinger (Aurora Scientific Inc, Canada). Kort ble peroneal nerve av anesteserte dyr isolert gjennom et lite snitt lateral til kneet. Musene ble deretter plassert liggende på en plattform og foten blir testet var plassert på fotplaten. Den hindlimb brukt til testing ble stabilisert med klut tape på kneet og foten. Muskler ble stimulert ved hjelp av en krok elektroder settes inn under huden. Muskel tetanic sammentrekning ble testet med en frekvens på 150 Hz for 350 ms å undersøke om fire ukers NMES protokollen ville overtale forbedringer i muskel kraft. Resultatene ble normalisert til våt muskel vekt. Det var en ca 30% økning i tetanic sammentrekning av dyr sendt til NMES, sammenlignet med kontroller (p = 0,005) (figur 3), noe som tyder protokollen beskrevet forbedrer skjelettmuskulatur styrke i MDX / SCID dyr.

. Figur 1 Hematoxylin & eosin skjelettmuskulatur farging av dystrofe (MDX) / immunsvikt mus (4-5 måneder) (10x forstørrelse): a) ubehandlede kontroller, B) etter 4 uker med NMES.

Figur 2. CD31 immunfluorescens (rød), som en markør av skjelettmuskulatur vascularity, i skjelettmuskulatur av dystrofe (MDX) / immunsvikt mus (4-5 måneder) (20x forstørrelse) a) ubehandlede kontroller, B) etter 4 uker NMES.

Figur 3. Kontraktile testingav fremre kammer musklene i kontroll og dyr behandlet med NMES i 4 uker. MNM = milli Newtonmeter. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Disse resultatene tyder på at vår utviklede murine modell av NMES fremmer skjelettmuskulatur angiogenese (figur 2) og forsterkning (figur 3), men induserer ikke skjelettmuskulaturen skader (figur 1).

Det bør bemerkes at stimulering parametrene beskrevet her har blitt designet for å indusere en muskel overbelastning til de fremre kammer muskler. Akkurat som tilfellet er for kliniske scenarier, kan elektrode plassering justeres for å stimulere andre muskelgrupper, selv om muskel respons til NMES kan være forskjellig, avhengig av fibertype sammensetning. NMES varighet, totalt antall behandlinger, og totalt antall repetisjoner kan endres i henhold til studere design.

Som med enhver protokoll, har denne metoden begrensninger som bør nevnes. I den foreliggende studien ble stimulering utført over den dype fibular nerve. Men i klinikken, stimulering is vanligvis gis på motorenheten. I dyremodell, vil stimulering av nerve kreve en lavere intensitet for å lokke fram fulle muskel sammentrekning. En annen begrensning av modellen som presenteres er at vi ikke klarer å innhente informasjon om komfort nivået under anvendelsen av NMES, gitt at dyrene bedøves. Derfor er toleransen av sammenlignbare intensiteter i en klinisk populasjon vanskelig å vurdere. Men våre histologiske resultater tyder vår NMES modell, som beskrevet, induserer ikke muskelskader.

Utviklingen av dyr modeller som etterligner modaliteter vanligvis implementert i klinikken gi oss nyttige laboratoriet verktøy som muliggjør en bedre forståelse av cellulære og molekylære responser til behandlingstiltak. I tillegg er slike modeller er nyttige å gjennomføre pre-kliniske studier både Detaljert eksisterende rehabilitering protokoller og utvikle nye indikasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vector wire wrap posts with bifurcated solder terminal	Newark Inc	T68
Vector circuit board	Newark Inc	3662-2
Pomona patch cord	Newark Inc	P-36-0
5 minute epoxy	VO Baker Co.	4001
Spectra 360 Electrode Gel	Milliken Medical	MR41217
Portable neuromuscular stimulation device	EMPI	300pv