Summary
Glassull filtre har blitt brukt til å konsentrere vannbårne virus av en rekke forskningsgrupper rundt om i verden. Her viser vi en enkel tilnærming for å bygge glass ull filtre og demonstrere filtrene er også effektive i å konsentrere vannbårne virus-, bakterie-og protozo patogener.
Abstract
Nøkkelen første skritt i å vurdere patogen nivåer i mistanke forurenset vann er konsentrasjonen. Konsentrasjon metoder tendens til å være spesifikk for en bestemt patogen gruppe, for eksempel US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia og Cryptosporidium en, noe som betyr flere metoder er nødvendig dersom prøvetaking programmet er rettet mot mer enn en patogen gruppe. En annen ulempe med dagens metoder er utstyret kan være komplisert og dyrt, for eksempel VIRADEL metoden med 1MDS patron filter for å konsentrere virus to. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du konstruere glassull filtre for å konsentrere vannbårne patogener. Etter filter eluering, er konsentratet mottagelig for en andre konsentrasjon skritt, slik som sentrifugering, etterfulgt av patogen Påvisning og telling av kulturelle eller molekylære metoder. Filtrene har flere fordeler. Konstruksjonen er enkel og filtrene kan bygges til enNY størrelse for å møte spesifikke prøvetaking krav. Filteret deler er billig, noe som gjør det mulig å samle et stort antall prøver uten alvorlig påvirker et prosjekt budsjett. Store prøvevolumer (100s til 1000 L) kan være konsentrert avhengig av takten for tilstopping fra utvalget turbiditet. Filtrene er svært portabel og med minimal utstyr, for eksempel en pumpe og strømningsmåler, kan de implementeres i feltet for prøvetaking ferdig drikkevann, overflatevann, grunnvann, og landbruket avrenning. Endelig er glassull filtrering effektiv for å konsentrere en rekke patogene typer slik at bare én metode er nødvendig. Her rapporterer vi om filter effektivitet i å konsentrere vannbåren human enterovirus, S almonella enterica, Cryptosporidium parvum, og fugleinfluensa-viruset.
Protocol
1. Klargjøre Glassull
- Før og etter at hvert parti av filtre, sterilisere arbeidsområdet med 10% blekemiddel løsning.
- Ta på hansker og kappe. Steriliser en bøtte ved autoklavering ved 121 ° C og 15 psi i minst 20 minutter. Plasser glassull i den sterile bøtte.
- Mett glassull med omvendt osmose vann og la trekke i 15 minutter.
- Tapp omvendt osmose vann fra bøtte.
- Mett glassull med en M HCl og la trekke i 15 minutter.
- Drener 1 M HCl fra bøtten.
- Skyll glassull med omvendt osmose vann.
- Bland grundig.
- Sjekk pH med pH papir og gjenta omvendt osmose vannet skylle inntil en nøytral pH er oppnådd.
- Hell av skyllevannet.
- Mett glassull med en M NaOH og la trekke i 15 minutter.
- Drener 1 M NaOH fra bøtten.
- REPEAT omvendt osmose skylle inntil en nøytral pH er oppnådd.
- Hell av skyllevannet.
- I stedet for en bøtte, kan et glass ull vaskemaskin bygges, som ligner på design til et glass pipette skive (figur 1).
- Dekk glassull helt med steril Fosfatbufret saltvann (PBS) justert til pH 6,8.
- Bruk forberedt glassull umiddelbart eller butikken ved 4 ° C. Det kan lagres i opptil to uker. Før du bruker, sørg for at pH er nøytral fordi det vil stige over tid. Hvis pH er ikke nøytral, re-skylle med sterilt Fosfatbufret saltvann (pH 6,8).
2. Montering av Glassull Filter
- Bor en 11/16 tomme hull inn i PVC caps og trykk tråder så de mannlige adapter nylon beslag kan skrus inn i caps. Dette trinnet er nødvendig bare for den første forsamlingen. Deretter kan de caps bli brukt i årevis. Bruk Teflontape til nylon innredning trådene og skru til caps.
- Pakk PVC rør med små biter av glass ull. Bruk et metall stempel, som en bilmotor ventil, å pakke tett. Pakking krever ikke stor kraft. Pakk stramt nok til at glasset ull holder seg på plass og kanaler danner ikke. Men ikke pakke så hardt vann ikke kan renne gjennom filteret. Når pakket riktig, bør en flow rate på 4 til 5 liter per minutt være oppnåelig når filteret er festet til vannkraner med press mellom 40-60 psi. For størrelsen på PVC rør er spesifisert i denne protokollen, ca 85 gram vasket og pakket glass ull brukes per pipe. Tare den tomme PVC-rør på en topp-lasting balanse og pakke med vasket glass ull inntil røret massen øker 85 gram.
- Sett polypropylen mesh i PVC caps med mannlige adapter nylon beslag festet.
- Bruk Teflon tape til de gjenga deler av PVC rør.
- Skru på PVC caps til PVC pIPE og etiketten ett filter slutt tilsig og den andre enden av utstrømningen. Dette er viktig senere i eluering trinnet. Hvilken ende er merket tilsig ingen rolle.
- Skyv 60 ml sterilt Fosfatbufret saltvann (pH = 6,8) i filteret ved hjelp av et kateter tippet sprøyte. Overflødig vil komme ut motsatt ende.
- Wrap slutter tett med Parafilm å unngå lekkasje. Filtre kan lagres i opp til 30 dager ved 4 ° C.
3. Prøvetaking
- Steriliser rør som brukes for prøvetaking ved å resirkulere eller dyppe elementer i 30 minutter i 0.525% NaClO (dvs. en 10% løsning av standard klorin). Følg dette ved drenering av hypokloritt løsningen og nøytraliser med 0,05% natriumtiosulfat, laget ved å tilsette 25 ml av en 2% lager vannfritt natriumtiosulfat løsning til en liter av omvendt osmose vann.
- For prøve vann med en pH større enn 7,5, justere pH til mellom 6,5 og 7,0 med HCl. HCl-konsentrasjon kan variere fra 0,25M til 1 M. Fire liter 0,5 M HCl er vanligvis tilstrekkelig for to 800 liters prøver, avhengig av vannets ambient pH og bufferkapasitet. Injiser HCl under prøvetaking ved hjelp av en peristaltiske pumpe eller Venturi (figur 2). Juster pumpehastigheten eller Venturi åpning for å oppnå målet pH. Mål pH på prøven linje stikkontakt med et felt pH-meter.
- Bruk en forfilter hvis glassull filter tresko fra vann med høy turbiditet. (Spesifikasjoner for forfilteret og bolig er i Materials listen på nettet.) Fordi patogener kan festes til partikler fanget av forfilter må det eluted sammen med glassull filteret (se nedenfor).
- Juster strømningshastigheten til mellom 2 og 4 liter / minutt. Typiske prøvevolumer er mellom 200 og 1500 liter.
- Koble glassull filter og oppbevar i en plastpose steril pose ved 4 ° C i opptil 48 timer.
4. Eluering
- Fest glassull filter i en ringstå med prøven tilsig enden peker nedover i en polypropylen flaske. Eluer motsatt av retningen av prøven flyt.
- Skyv 80 ml sterilt 3% storfekjøtt ekstrakt i 0,05 M glysin med en pH på 9,5 i filteret.
- Vent 15 minutter.
- Skyv en annen 80 ml sterilt 3% storfekjøtt ekstrakt i 0,05 M glysin med en pH på 9,5 i filteret.
- Skyv luft grundig filteret inntil skummet kommer ut av filteret innløpet.
- Juster eluatet pH til mellom 7,0 og 7,5 med 1 M HCl.
- Oppbevares eluatet ved 4 ° C i opptil 24 timer eller ved -20 ° C i lengre perioder av gangen.
- Eluer forfilter hvis en blir brukt. Skru toppen av boliger kassetten og hell av alle gjenværende vannet inne i huset mens du holder forfilteret på plass med sterile hansker.
- Fjern forfilteret fra huset kassetten og putt den i en 15 "x 6" zip-lås pose.
- Hell 200 ml steril 3% storfekjøtt ekstrakt i 0,05 M glycine med en pH på 9,5 i posen og forsegle sikkert med zip-lås.
- Snu pose forfilteret flere ganger for å sikre at hele overflaten kommer i kontakt med biff ekstrakt.
- Vent 15 minutter, og snu og masserer pose forfilter.
- Åpne zip-lås. Grip posen rundt forfilteret tett å presse ut så mye biff ekstrakt som mulig og trekk silen ut med sterile hansker,.
- Hell biff ekstraktet eluatet i en polypropylen flaske.
- Juster eluatet pH til mellom 7,0 og 7,5 med 1M HCl.
- Oppbevares eluatet ved 4 ° C i opptil 24 timer eller ved -20 ° C i lengre perioder av gangen. Forfilteret eluatet kan separat analysert for patogener eller kombineres med glassull filteret eluatet.
5. Representative Resultater
| Patogen | Vann Turbiditet Level (NTU) en | Beløp Seeded / L b, c, d | % Recovery ± 1 SD | Antall uavhengige studier |
| Enterovirus-poliovirus Sabin III | 0.5 | 500 | 81% ± 11 | 7 |
| Enterovirus-poliovirus Sabin III | 0.5 | 5000 | 67% ± 12 | 8 |
| Enterovirus-poliovirus Sabin III | 215 | 500 | 59% ± 32 | 7 |
| Enterovirus-poliovirus Sabin III | 215 | 5000 | 38% ± 22 | 6 |
| Enterovirus-poliovirus Sabin III | 447 | 500 | 56% ± 18 | 8 |
| Enterovirus-poliovirus Sabin III | 447 | 5000 | 63% ± 37 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 0.5 | 5 | 38% ± 14 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 0.5 | 50 | 53% ± 19 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 5 | 40% ± 16 | 7 |
| Cryptosporidium parvum | 215 | 50 | 30% ± 6 | 6 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 5 | 33% ± 13 | 8 |
| Cryptosporidium parvum | 447 | 50 | 28% ± 11 | 8 |
| Salmonella enterica | 0.5 | 5 | 29% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica | 0.5 | 500 | 56% ± 16 | 8 |
| Salmonella enterica | 215 | 5 | 32% ± 24 | 7 |
| Salmonella enterica 215 | 500 | 34% ± 11 | 6 | |
| Salmonella enterica | 447 | 5 | 34% ± 18 | 8 |
| Salmonella enterica | 447 | 500 | 31% ± 24 | 8 |
- Nefelometrisk Turbiditet Unit
- Enterovirus oppregnet av qPCR som genomisk kopier / L
- C. parvum nummerert av immunfluorescens som oocyster
- S. enterica nummerert av kultur som koloniens-forming-enheter
Tabell 1. Glassull konsentrasjon med varierende vann turbidities og patogen tettheter.
| Patogen | Vannprøve Sted | Beløp Seeded / L en | % Reco veldig |
| Fugleinfluensa H5N2 | Sundi Lake, Anchorage Borough | 2500 | 42,9% |
| Fugleinfluensa H5N2 | Minto Flats, Fairbanks North Star Borough | 2500 | 36,7% |
| Fugleinfluensa H5N2 | Portage Valley, Anchorage Borough | 2500 | 7,8% |
| Fugleinfluensa H5N2 | Potter Marsh, Anchorage Borough | 2500 | 41,5% |
| Fugleinfluensa H5N2 | Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough | 2500 | 15,5% |
- Målt etter qPCR som genomisk kopier / L
Tabell 2. Glassull konsentrasjon av aviær influensa virus ved hjelp av vann fra fem steder i Alaska.
les/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Diagram av glassull vaskemaskin. Dette kan brukes i stedet for en bøtte, som sparer tid fra skylling. Konseptet ligner på et glass pipette vaskemaskin.
Figur 2. Glassull filtrering med syre injeksjon ved peristaltiske pumpen. Legg merke til "T" kontakten der pumpen slangen introduserer syre i prøven linjen mellom vannkranen og glassull filter. pH-justering er nødvendig bare hvis vannet samplet har en pH> 7.5.
Glass ull filtre er effektive i å konsentrere patogener fra vannet med et bredt spekter av turbiditet nivåer og patogen tettheter (Tabell 1). For å teste dette, ble 20 liter dechlorinated springen vann blandet med tørket silt leire jord (0, 1,27, eller 2,75 g / L) for å oppnå ønsket nivå av turbiditet og deretter seedet med patogener ved ulike tettheter. Vannetble vedtatt gjennom et glass ull filter, ble de konsentrerte patogener i eluatet nummerert, og denne verdien var telleren i prosent utvinning beregningen. Mengden av patogener seeded i vannet, det vil si nevneren i prosent utvinning beregning, ble bestemt av første seeding patogener inn i en negativ eluatet så opplisting av patogener. Den negative eluatet ble utarbeidet ved å bestå en unseeded 20 liter prøven gjennom et filter og eluting. Kvantifisere seeded patogener i en negativ eluatet unngår forskjeller i patogen oppregning som kan resultere fra matrix forskjeller skapt av glassull filter. Betydningen av dette trinnet når kvantifisere patogener ved qPCR er omtalt i Lambertini et al. Tre. En 20 liters negativ kontroll prøven ble konsentrert via glassull filtrering for å fastslå det var ingen innebygd patogener tilstede som kunne forvirre den prosent utvinning beregningen. En 10 mikrometer nominell porestørrelse forfilter wsom brukes når turbiditeten nivået var ≥ 215 NTU.
Poliovirus ble kvantifisert ved real-time qPCR med det sekundære konsentrasjon og nukleinsyre utvinning prosedyrer og primere og probe beskrevet i Lambertini et al. Tre. Cryptosporidium parvum ble kvantifisert i finalen konsentrert prøvevolum (FCSV) skapt av den sekundære konsentrasjonen prosedyre for poliovirus . Oocyster ble visualisert ved immunfluorescens (MeriFluor Cryptosporidium og Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, Ohio). Salmonella enterica ble tallfestet i FCSV av platekledning på XLD agar (Remel, Lenexa, KS) og telling koloni-forming- enheter.
Glass ull filtre er effektive i å konsentrere fugleinfluensavirus (tabell 2). Lav patogenitet fugleinfluensa (H5N2) ble sådd i vann fra flere steder i Alaska og prosent utvinning beregnes som beskrevet above. Sekundær konsentrasjon og nukleinsyre prosedyrer ble utført som for poliovirus, viruset ble kvantifisert ved qPCR bruke primere og probe beskrevet i Spackman et al fire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glassull filtre har vært brukt av flere forskergrupper 3,5,6 å konsentrere menneskelige enteriske virus fra en rekke vannkilder som ferdig drikkevann 7, 8,9 grunnvann, overflatevann 10, sjø 11 vann, 12 avløpsvann, og landbruket avrenning 13. Her rapporterer vi er filtrene også effektive i å konsentrere aviær influensa virus samt bakterielle og protozo patogener Salmonella enterica (serovar Typhimurium) og Cryptosporidium parvum, henholdsvis. Deboosere et al. Også nylig rapportert glassull konsentrasjon av aviær influensa virus 14.
Filtrene er en fordel i at de er rimelige, svært portabel, brukbare i et bredt spekter av vann matriser, og effektive for å konsentrere mange typer vannbårne patogener. De kan være konstruert til enhver størrelse, avhengig av forskningsbehov. Etter desinfiserion, filterhus er gjenbrukbare.
Glass ull filtre, derimot, har begrensninger. Som med alle virus konsentrasjon metode som baserer seg på electropositively ladde medier for virus adsorpsjon (f.eks 1MDS filter, Cuno Inc., Meriden, CT), avhenger filter effektivitet på ambient vann pH. I vårt laboratorium har vi valgt pH 7,5 som cut-off, over som vannet pH er justert ned med kontinuerlig pumping 0,25 M HCl i filteret inntastingslisten under prøvetaking. Høyere pH farvann kan prøves uten justering av pH, men på bekostning av filter effektivitet tre. En annen begrensning er holdbarhet. Vi har vist for filtre lagret ved 4 º C i seks uker at patogenet konsentrasjonen effektiviteten ikke nedgangen (upubliserte data). Likevel har lengre lagringstid ikke blitt testet så konservativt, for å sikre datakvalitet, vi bruker ikke filter eldre enn 30 dager. Vanligvis er filtre laget etter behov. En annen potensiell veisperring i noen countries er å innhente glassull fra den franske kilden som er angitt i tidligere papirer. Nylig viste vi standard unfaced glassfiber isolasjon er like effektive, og dette er lett tilgjengelig fra maskinvare eller hjemme forbedring butikker (se Materialer liste på nettet).
For alle eksperimenter, er det viktig å kjøre to sett kontroller, en utstyr tomme for å sikre glassull filtrene ble ikke forurenset under bygging og en recovery kontroll for å sikre filtrene fungerer som tiltenkt. Disse kontrollene er nødvendig for alle vannbårne patogen konsentrasjon metode.
Bruk et glass ull filter kan være så enkelt som å feste den til en kran og skru på springen eller så komplisert som inntar et sediment-Laden elv i et avsidesliggende sted, krever pumper, pH justering, og et forfilter for å hindre tilstopping. For vår forskergruppe, er den største fordelen med å bruke glass ull filtre evnen til å samle inn og analysere tusenvis av vannprøves for menneskelige og husdyr patogener, gir data om patogen overflod og distribusjon i miljøet som ikke ville vært like gjennomførbart med mer kostbare, kompliserte metoder 13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker William T. Eckert for narrating videoen. Utvikling av glassull protokollen var en del av Wisconsin vann og helse Trial for enteriske risikoer (WAHTER Study), finansiert av US EPA STAR Grant R831630. Alaska prøver ble samlet av A. Reeves, A. Ramey, og B. Meixell med økonomisk støtte fra USGS. All bruk av handel, produkt eller firma navn er for beskrivende kun og innebærer ikke godkjenning av amerikanske myndigheter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrochloric acid |  Fisher Scientific |
A144-500 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific |
BP359-212 | |
| Phosphate Buffered Saline Sodium chloride Potassium phosphate-dibasic Potassium phosphate-monobasic | Fisher Scientific |
BP358-212 BP363-500 BP362-500 | |
| Sodium hypochlorite i.e., household bleach | Clorox |
||
| Sodium thiosulfate, anhydrous | Fisher Scientific |
S 475-212 | |
| Beef extract, desiccated | BD Biosciences |
211520 | |
| Glycine | Fisher Scientific |
G46-500 | |
| Oiled sodocalcic glass wool Or R-11 unfaced fiberglass insulation | Johns Manville |
Bourre 725 QN | |
| Polypropylene mesh | Industrial Netting |
xN4510 | |
| 2"x4" Sch 80 PVC threaded pipe nipple | Grainger |
6MW35 | |
| 2" Sch 40 PVC cap | Grainger |
5WDW3 | |
| Male adapter nylon fitting (1/2"x1/2") | US Plastic Corp. |
62178 | |
| Sample bottles for eluate- 1 liter | Fisher Scientific |
03-313-4F | |
| 60 mL syringe | Fisher Scientific |
NC9661991 | |
| pH strips | Whatman, GE Healthcare |
2614 991 | |
| Prefilter, Polypropylene, 10 inch cartridge, 10 μm | McMaster-Carr | 4411K75 | |
| Prefilter housing | Cole-Parmer | S-29820-10 |
References
- US Environmental Protection Agency. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. EPA 815-R-05-002. , (2012).
- Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water. J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).
- Lambertini, E. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. Report No. NC/99/40. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).
- Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. Glass wool for virus concentration at ambient water pH level. Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).
- Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res. 38, 2699-2705 (2004).
- Powell, K. L. Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).
- Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses. Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).
- van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).
- Vilaginés, P. Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water. Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).
- Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).
- Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).
- Deboosere, N. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water. Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).
- Lambertini, E. Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems. J. Water Health. 9, 799-812 (2011).
